HPLC-ICP-MS聯(lián)用測定小兒咳喘靈顆粒中Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)△

陳榮，張華鋒

蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215104

鉻元素常見價態(tài)有0、+2、+3、+6，其中三價鉻[Cr(Ⅲ)]毒性較小，為人體所必需，主要生理功能是參與葡萄糖耐量因子的組成，激活某些代謝酶的活性、穩(wěn)定核酸、促進膽固醇和脂肪酸形成，常用于治療缺鉻導致的糖尿病[1]。但六價鉻[Cr(Ⅵ)]毒性較大，具有強氧化性，易穿透生物膜，在1990年就被國際癌癥研究機構(IARC)列為致癌物。中成藥藥材來源復雜，種植、采收、加工各個環(huán)節(jié)均可能受到外源性元素污染，鉻元素作為中藥材、中成藥重金屬檢測指標也逐漸受到重視[2-3]，但因為鉻元素不同價態(tài)毒性差異較大，單以鉻總量來規(guī)定中藥中含量限值并不嚴謹。目前針對Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的定量研究主要集中在環(huán)境、玩具、食品、保健品等領域[4-8]，如何在中成藥中定量2種價態(tài)鉻卻鮮有報道。本實驗以小兒咳喘靈顆粒為例，采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯(lián)用法(HPLC-ICP-MS)探索Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)準確定量方法，為中成藥中鉻含量限值設定提供參考。

1 材料

Agilent 1260液相色譜儀、Agilent 7900電感耦合等離子體質譜儀(安捷倫公司)；CEM Mars 6微波消解儀(CEM公司)；Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3離心機(賽默飛世爾公司)；Mettler Toledo XS105DU電子天平、Sevenmulti S40 pH計(德國，梅特勒-托利多公司)；HY-5調速多用振蕩器(蘇州威爾公司)；SK5200HP超聲波清洗器(上海科島公司，53 kHz，200 W)。

硝酸為UP級(蘇州晶瑞化學公司，批號：200101007)；氨水為HPLC級(上海阿拉丁生化科技公司,批號：K1820068)；EDTA-2Na(上海凌峰化學試劑公司，批號：20120605，分析純)；氫氧化鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鎂(國藥集團化學試劑公司，分析純)；水為超純水(Millipore Synergy超純水機制得)。

8批小兒咳喘靈顆粒樣品均來自四川某廠(批號分別為170904、180402、171107、180102、170606、171106、170802、171102，編號1～8)，以GB 5009.123—2014檢測總鉻含量異常偏高，見表1。水中Cr(Ⅵ)標準溶液(批號：B1807130，1000 mg·L-1，北京壇墨質檢科技有限公司)；九水硝酸鉻(Ⅲ)(批號：BCBV5398，純度99%，美國Sigma公司)。

表1 8批小兒咳喘靈顆粒樣品中Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)測定結果 μg·g-1

2 方法

2.1 色譜條件及儀器參數(shù)

Hamilton PRP-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)；流動相為0.075 mo·L-1硝酸銨溶液[在1 L水中，加入氨水8 mL，混勻后加入硝酸5 mL，用硝酸調節(jié)pH至(7.0±0.1)]；流速：1 mL·min-1；進樣量為20 μL。

ICP-MS參數(shù)：分析同位素52Cr；RF功率為1550 W；采樣深度為8 mm；載氣為1.2 L·min-1；積分時間為0.8 s，采集模式為He模式，流速4.5 mL·min-1；蠕動泵0.3 r·s-1。

2.2 供試品溶液制備

取樣品約0.5 g，精密稱定，置50 mL離心管中，加磷酸緩沖溶液(8.71 g磷酸氫二鉀和6.80 g磷酸二氫鉀用水配制成100 mL磷酸溶液)1 mL，再加氯化鎂0.4 g，堿提液(20 g氫氧化鈉和30 g碳酸鈉用水配制成1000 mL溶液)10 mL，混勻，置搖床上振搖1 h，3500 r·min-1離心(離心半徑15.4 cm)10 min，取上清液5 mL(沉淀備用)，精密加入EDTA-2Na溶液[0.1 mol·L-1，用氨水調節(jié)pH至(7.0±0.1)]5 mL，混勻，置搖床上振搖1 h，0.45 μm濾膜濾過，即得供試品溶液Ⅰ，用于測定Cr(Ⅵ)的含量。

取上述離心后沉淀物，加入硝酸2 mL，反應后用3 mL硝酸轉移至消解罐中，微波消解(消解程序：1400 W，120 ℃，爬坡5 min，保持10 min；185 ℃，爬坡10 min，保持25 min)，放冷，置加熱板上趕酸至溶液近干，用40 mL EDTA-2Na溶液轉移至50 mL量瓶中，用氨水調節(jié)pH至(5.0±0.2)，加水定容至50 mL，密塞，置60 ℃水浴中超聲30 min，放冷，3500 r·min-1離心(離心半徑12.6 cm)10 min，取上清液用0.45 μm濾膜濾過，即得供試品溶液Ⅱ，用于測定Cr(Ⅲ)的含量。

2.3 標準溶液制備

取水中Cr(Ⅵ)標準溶液適量，加水配制成每1 mL含5 μg的Cr(Ⅵ)標準溶液儲備液；另取九水硝酸鉻約0.078 g，置500 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取2 mL，用水稀釋至20 mL，即得每1 mL含2 μg的Cr(Ⅲ)標準溶液儲備液(臨用現(xiàn)配)。量取上述Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)儲備液適量，用EDTA-2Na溶液配制成每1 mL含Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)均為0、5、10、20、50、100 μg·L-1的系列混合標準溶液。

3 結果和討論

3.1 線性關系及檢出限考察

將上述系列混合標準溶液依次注入色譜儀，以峰面積(Y)為縱坐標，標準溶液質量濃度(X)為橫坐標，進行線性回歸，標準曲線方程Cr(Ⅵ)：Y=362.132 6X+127.900 5，r為0.999 7；Cr(Ⅲ)：Y=421.400 4X+18.004 4，r為0.999 9，2種價態(tài)在上述質量濃度范圍內(nèi)線性關系良好?；旌蠘藴嗜芤褐蠧r(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)在6 min內(nèi)完全分離，樣品中2種價態(tài)色譜法分離度良好，見圖1。樣品空白溶液連續(xù)測定11次，以其信號響應值的標準偏差(δ)的3倍所對應的質量濃度作為檢出限，Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)檢出限分別為0.01、0.03 μg·L-1。

注：A.混合標準溶液；B.供試品溶液Ⅰ(批號：180102)；C.供試品溶液Ⅱ(批號：180102)；1. Cr(Ⅵ)；2. Cr(Ⅲ)。圖1 Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)混合標準溶液、供試品溶液Ⅰ、供試品溶液Ⅱ色譜圖

3.2 重復性和加樣回收率

將樣品4(批號：180102)按2.2方法平行制備6份，測得Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)含量RSD(n=6)分別為5.3%、2.5%，另平行稱取樣品9份，以3份為1組，分別精密加入Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)儲備液0.75、0.5、0.25 mL，相應回收率Cr(Ⅵ)為90.4%、87.7%、82.1%；Cr(Ⅲ)為95.2%、94.1%、94.6%。

3.3 穩(wěn)定性考察

將樣品4(180102)制備的供試品Ⅰ和Ⅱ，分別于0、2、4、8、12、24、48 h進樣，記錄Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)峰面積，計算RSD，結果分別為4.6%、2.4%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 提取方法優(yōu)化

3.4.1Cr(Ⅵ)提取方式的選擇 本實驗采用陰離子交換柱，以EDTA-2Na溶液將樣品中Cr(Ⅲ)絡合成陰離子，從而實現(xiàn)與Cr(Ⅵ)(鉻酸根)的分離。通過對樣品前處理方法考察，發(fā)現(xiàn)使用流動相溶解樣品后再用EDTA-2Na溶液超聲絡合，離心凈化后進樣，樣品中Cr(Ⅵ)未檢出，加入高水平Cr(Ⅵ)(5 μg)在同等條件下試驗，有相當部分轉化為Cr(Ⅲ)，因Cr(Ⅵ)是影響樣品毒性的關鍵，所以Cr(Ⅵ)的準確測定至關重要，該方法不可行，見圖2(A)。參照EPA Method 3060A方法，以0.28 mol·L-1Na2CO3和0.5 mol·L-1NaOH混合溶液提取，樣品中Cr(Ⅵ)有檢出，以樣品空白加高水平Cr(Ⅵ)(5 μg)驗證，Cr(Ⅵ)的回收率為104.5%，見圖2(B)。實驗中添加氯化鎂是為抑制Cr(Ⅲ)向Cr(Ⅵ)轉化，用高水平Cr(Ⅲ)(5 μg)驗證，未檢出Cr(Ⅵ)，說明0.4 g氯化鎂的添加量合適，該方法能有效提取Cr(Ⅵ)，見圖2(C)。

注：A. 樣品加高水平Cr(Ⅵ)；B. 樣品空白加高水平Cr(Ⅵ)；C.高水平Cr(Ⅲ)；1.Cr(Ⅵ)；2. Cr(Ⅲ)。圖2 高水平Cr(Ⅵ)轉變成Cr(Ⅲ)、高水平Cr(Ⅵ)、高水平Cr(Ⅲ)驗證色譜圖

3.4.2Cr(Ⅲ)提取方式選擇 樣品經(jīng)堿提后，Cr(Ⅲ)以Cr(OH)3形式與Mg(OH)2形成共沉淀，采用硝酸微波消解的方式，使樣品中的Cr主要以Cr3+方式存在，再與EDTA-2Na溶液絡合。通過比較絡合方式(振搖、超聲、高溫水浴)、時間等因素，發(fā)現(xiàn)絡合效果60 ℃水浴超聲1 h>90 ℃水浴5 min>常溫振搖2 h，水浴超聲效果比較60 ℃>40 ℃>20 ℃，常溫振搖的樣品放置時間在24 h后Cr(Ⅲ)檢出濃度最高，隨時間推移，濃度不再升高。因此本實驗選擇60 ℃水浴超聲來迅速絡合Cr(Ⅲ)，由于樣品中Cr(Ⅵ)相對Cr(Ⅲ)含量很低，堿提后離心棄去上清，以沉淀物來提取Cr(Ⅲ)，并不會造成Cr(Ⅲ)含量偏差太大。但是采用供試品溶液Ⅰ測定Cr(Ⅵ)時，樣品色譜圖中出現(xiàn)Cr(Ⅲ)峰，推測可能是因為基質影響導致部分Cr(Ⅲ)未與Mg(OH)2形成共沉淀而被EDTA-2Na絡合，該部分Cr(Ⅲ)的量占供試品溶液Ⅱ中Cr(Ⅲ)量的2.4%～5.7%，計算總Cr(Ⅲ)量時將兩者合并，見表1。

3.4.3pH的控制 測定鉻價態(tài)關鍵在于減少Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的互相轉化，pH<4時，Cr(Ⅲ)主要以Cr3+方式存在；pH升高，Cr3+逐漸轉變?yōu)槌恋?，pH為6時基本沉淀完全，隨著堿性增強，溶液中出現(xiàn)電負性的[Cr(OH)3]nOH-膠體，當pH升至10以上時，Cr(Ⅲ)溶液易被氧化性物質氧化為Cr(Ⅵ)。在中性溶液體系內(nèi)，Cr(Ⅲ)、Cr(Ⅵ)電偶間氧化還原電位很高，價態(tài)之間趨于穩(wěn)定，報道稱只有極少數(shù)自然系中氧化劑能氧化Cr(Ⅲ)成Cr(Ⅵ)[7]，本實驗流動相控制在pH=(7.0±0.1)，是為盡量保證樣品中提取出的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)在色譜系統(tǒng)中保持原本價態(tài)。在堿性條件下提取Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)多以沉淀形式存在，堿提液經(jīng)EDTA-2Na絡合后，pH在(9.0±0.3)，未進行調整直接進樣，基本不會造成Cr(Ⅲ)氧化為Cr(Ⅵ)。本實驗色譜柱的pH耐受范圍是2.0～10.0，硝酸消解后趕酸至近干，經(jīng)EDTA-2Na絡合后的溶液pH<3，峰形很差，Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)不能分離，用氨水調節(jié)至(5.0±0.2)再定容，2種價態(tài)完全分離，也利于Cr3+與EDTA-2Na的絡合。

3.5 樣品測定結果

8批樣品均檢出Cr(Ⅵ)，檢出值為0.027～0.082 μg·g-1，平均值0.051 μg·g-1，Cr(Ⅲ)檢出值為5.775～18.743 μg·g-1，平均值10.366 μg·g-1。與國標測定結果總鉻量比較，Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)總量占其80.8%～94.1%，且各批次間Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、總鉻量趨勢基本一致。

《中華人民共和國藥典》2015年版中明膠鉻的限值為不得過百萬分之二，USP40 NF35和EuP 9.0中則規(guī)定明膠中鉻含量不得過10 mg·kg-1，EuP 9.0 5.20.金屬催化劑及金屬試劑殘留量中限定吸入劑的Cr(Ⅵ)的每日允許暴露量(PDE)為不得過10 ng·d-1。本實驗4批樣品總Cr(Ⅲ)量超過10 mg·kg-1，以小兒咳喘靈顆粒每日最大服用量8 g來計，Cr(Ⅵ)的每日暴露量為216～656 ng，全部超過歐洲藥典金屬催化劑或試劑殘留量中吸入劑Cr(Ⅵ)的限定。因為歐洲藥典中該限值規(guī)定僅針對吸入劑，小兒咳喘靈顆粒作為中成藥中口服制劑毒性還有待考察。

4 結論

本實驗參照EPA Method 3060A對小兒咳喘靈顆粒樣品進行堿提分離Cr(Ⅵ)，再以微波消解方式釋放樣品中Cr(Ⅲ)，用HPLC聯(lián)合ICP-MS同時測定2種鉻價態(tài)含量。實驗中以Cr(Ⅵ)含量的準確測定為重點，優(yōu)化提取方法，盡量減少Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)間的轉化，通過陰離子交換柱達到2種價態(tài)完全分離，8批小兒咳喘靈顆粒樣品Cr(Ⅵ)含量占本方法測得2個價態(tài)總量的0.4%～0.6%。在國標方法測得總鉻量超標的情況下，抓住重點對毒性較高的Cr(Ⅵ)含量進行深入研究，相比以總鉻量判定因鉻元素導致藥品毒性更加合理?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版已對汞、砷作出修訂，以適應更廣范圍樣品的價態(tài)測定，相信不久將來針對中藥材、中成藥中有害元素各形態(tài)和價態(tài)的考察也會更深入和廣泛[9-10]。小兒咳喘靈顆粒作為兒科用中成藥，更應對檢出的重金屬元素問題予以重視，科學、客觀地評判其安全性，同時結合體內(nèi)毒性試驗進行分析，以期分別制定針對不同價態(tài)鉻的限量標準。本方法準確度高，重復性好，為更客觀、合理地評價中成藥中鉻的安全性提供參考。