芍黃顆粒對小鼠銀屑病模型的治療作用研究

程國強(qiáng) 董涵 王永金 夏介英 洪楊

摘要：為了探討芍黃顆粒對小鼠銀屑病模型的治療作用，采用咪喹莫特致小鼠銀屑病模型觀察芍黃顆粒對銀屑病模型小鼠皮損組織病理變化、表皮厚度及皮膚組織中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)的影響;采用小鼠陰道上皮病理模型及小鼠尾鱗片上皮病理模型觀察芍黃顆粒對小鼠陰道上皮有絲分裂及小鼠尾鱗片表皮顆粒層形成的影響。結(jié)果表明，與模型組比較，芍黃顆粒各劑量組均能顯著減小銀屑病模型小鼠皮膚厚度（P<0.05），芍黃顆粒5.0、10.0g/kg劑量對小鼠背部皮損有改善作用且能顯著減少小鼠皮膚組織中PCNA蛋白表達(dá)量;芍黃顆粒10.0g/kg劑量能明顯抑制小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂，對小鼠尾鱗片表皮顆粒層形成有顯著促進(jìn)作用。表明芍黃顆?？赏ㄟ^影響表皮細(xì)胞過度增殖、角化不全而減小皮膚厚度、改善皮損，抑制陰道上皮細(xì)胞有絲分裂，促進(jìn)小鼠尾鱗片表皮顆粒層形成等來治療銀屑病，為銀屑病治療的有效藥物。

關(guān)鍵詞：芍黃顆粒;銀屑病;動(dòng)物模型

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）09-0137-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.09.029

銀屑病是一種常見的頑固性皮膚病，病程較長，易復(fù)發(fā)。該病發(fā)病以青壯年為主，對患者的身體健康和精神狀況影響較大川。臨床表現(xiàn)以紅斑、鱗屑為主，全身均可發(fā)病。有關(guān)該病的病因雖然進(jìn)行過許多研究，但至今尚不十分清楚。目前認(rèn)為，該病的發(fā)生不是單一的原因，可能涉及多方面，如遺傳、感染、內(nèi)分泌因素、免疫異常等。該病目前尚無特效療法，適當(dāng)?shù)膶ΠY治療可以控制癥狀。由于該病是一種慢性復(fù)發(fā)性疾病，不少患者需要長期醫(yī)治。西醫(yī)治療銀屑病主要有聯(lián)合療法、交替療法、序貫療法和間歇療法等，而各種療法都有一定的不良反應(yīng)[2，3]。

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為血熱是銀屑病發(fā)病的重要原因，風(fēng)熱之邪結(jié)聚于皮膚，則局部的氣血運(yùn)行失暢，氣血久郁則血熱，紅斑是血中有熱的表現(xiàn)，白屑是熱盛血燥、皮膚失養(yǎng)所致[4]。芍黃顆粒由赤芍、生地黃、牡丹皮、蒲公英、金銀花、白茅根組成，具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗炎抗?jié)?、解熱解痙、免疫調(diào)節(jié)等作用。本試驗(yàn)采用咪喹莫特致小鼠銀屑病樣皮損模型、鼠尾鱗片顆粒層模型及小鼠陰道上皮病理模型，觀察芍黃顆粒對銀屑病的治療作用，為其臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品 芍黃顆粒由赤芍、生地黃、牡丹皮、蒲公英、金銀花、白茅根等組成，試驗(yàn)用中藥材購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院資源所專家鑒定為正品。藥物經(jīng)水煎煮提取有效成分、濃縮，加一定比例輔料，烘箱低溫干燥制成棕黃色顆粒，1g相當(dāng)于原生藥1.5g;噲喹莫特乳膏，四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司;苯甲酸雌二醇注射液，天津金耀氨基酸有限公司;秋水仙堿，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;雷公藤多苷片，浙江得恩德制藥有限公司;復(fù)方青黛膠囊，陜西天寧制藥有限責(zé)任公司;小鼠增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體，Ab-cam（上海）貿(mào)易有限公司;Mouse E-Selectin ELISAKit、Mouse Endothelin 1（ET-1）ELISA Kit，CUSA-BIO BIOTECH CO.，LTD.。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 JA1003A型電子天平，上海精天電子儀器有限公司;JY10001型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司;CX21型生物顯微鏡，廣州奧林巴斯工業(yè)有限公司;Varioskan Flash酶標(biāo)儀，Thermo出品;BA200型Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，美國Media Cybernetics。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級昆明小鼠，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2013-19。

1.1.4 試驗(yàn)環(huán)境 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院藥理毒理研究所SPF屏障系統(tǒng)，室內(nèi)溫度20～22℃，相對濕度40%～70%，光照采用12h明亮、12h黑暗，合格證號為SYXK（川）2013-100。自由飲水。全營養(yǎng)顆粒飼料由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 芍黃顆粒對咪喹莫特致小鼠銀屑病模型的影響試驗(yàn)取雌雄各半小鼠60只，將背部毛剃干凈，10只為正常對照組，其余小鼠均背部涂抹咪喹莫特乳膏，涂抹面積為2cm²，每天1次，每次約60mg，連續(xù)涂8d[5-7]。將制備好的咪喹莫特模型小鼠50只隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為芍黃顆粒10.0、5.0、2.5g/kg劑量組、模型組和陽性藥物（雷公藤多苷片）組。共6組。芍黃顆粒組分別灌胃相應(yīng)劑量藥物，陽性藥物組按0.1g/kg給予雷公藤多苷片，正常對照組與模型組小鼠給予等體積0.5% CMC-Na溶液，每天2次，連續(xù)14d;給藥期間除正常對照組外均隔日涂抹咪喹莫特乳膏。建模過程中觀察小鼠背部皮損變化情況。給藥結(jié)束后，剪取各組小鼠皮損皮膚，常規(guī)組織切片，經(jīng)HE染色后觀察皮膚病理學(xué)變化，并測量表皮厚度;剪取各組小鼠皮損皮膚，石蠟包埋、切片經(jīng)免疫組化處理觀察PCNA的表達(dá)水平。

1.2.2 芍黃顆粒對鼠尾鱗片顆粒層模型的影響試驗(yàn)取小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常對照組、芍黃顆粒10.0、5.0、2.5g/kg劑量組。芍黃顆粒組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，正常對照組給予等體積0.5%CMC-Na溶液，每天2次，連續(xù)14d。末次給藥1h后處死小鼠，在距尾根部約2cm處取尾背部皮膚一條，長約2cm，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色。在光鏡下觀察鼠尾鱗片顆粒層形成情況，計(jì)數(shù)100個(gè)鱗片中有顆粒層的鱗片數(shù)[8]。

1.2.3 芍黃顆粒對小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂的影響試驗(yàn)取雌性小鼠60只，10只為正常對照組，腹腔注射生理鹽水;其余50只腹腔注射苯甲酸雌二醇0.2mg/10g，每日1次，連續(xù)3d，使其處于雌激素期。第4天將處于雌激素期的小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，即模型組、陽性藥物（復(fù)方青黛膠囊）組、芍黃顆粒10.0、5.0、2.5g/kg劑量組。芍黃顆粒組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，陽性藥物組按1.0g/kg給予復(fù)方青黛膠囊，模型組與正常對照組給予等體積0.5%CMC-Na溶液，每日2次，連續(xù)5d。由于細(xì)胞有絲分裂的晝夜節(jié)律性，每組試驗(yàn)時(shí)間應(yīng)統(tǒng)一。第6天上午各組小鼠腹腔注射秋水仙堿2mg/kg，6h后處死小鼠，取陰道組織，常規(guī)組織切片處理，HE染色，光鏡下計(jì)數(shù)300個(gè)陰道上皮基底細(xì)胞的有絲分裂數(shù)[9，10]。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 咪喹莫特致小鼠銀屑病樣動(dòng)物模型皮損的外觀形態(tài)變化

與正常對照組比較，咪喹莫特模型組小鼠在涂抹咪喹莫特1～2d后皮膚即出現(xiàn)紅斑、鱗屑及增厚現(xiàn)象，皮損癥狀在7～8d最為嚴(yán)重，呈典型的銀屑病樣改變。隨著時(shí)間延長，模型組小鼠皮損日益嚴(yán)重，紅斑由少量淡粉色斑點(diǎn)變?yōu)榇竺娣e深紅偏棕褐色斑塊;鱗屑由瑣碎狀增多增厚，過渡至布滿裸露皮膚的層狀鱗屑;皮膚逐漸褶皺、隆起，增厚浸潤明顯。芍黃顆粒高、中、低劑量組和雷公藤多苷片組小鼠皮損癥狀與模型組比較有所減輕，鱗屑較少，紅斑量少且色淺，增厚浸潤程度較輕。

2.2 芍黃顆粒對銀屑病樣小鼠模型皮損的病理學(xué)變化及皮膚厚度的影響

由表1可知，與模型組比較，芍黃顆粒各劑量組均能顯著降低銀屑病模型小鼠的皮膚厚度（P<0.05）。

HE染色結(jié)果（圖1）顯示，正常對照組小鼠皮膚角質(zhì)層、顆粒層、棘細(xì)胞層很薄;模型組小鼠皮膚過度角化、棘層增厚;芍黃顆粒能使小鼠皮膚角化過度減輕、棘層變薄，表皮層厚度明顯低于模型組。

2.3 芍黃顆粒對銀屑病小鼠PCNA表達(dá)水平的影響

由表2可見，與正常對照組比較，模型組小鼠皮膚組織中PCNA蛋白含量極顯著升高（P<0.01），提示造模成功。10.0和5.0g/kg芍黃顆粒組小鼠皮膚組織中PCNA蛋白含量極顯著降低（P<0.01）2.5g/kg芍黃顆粒組小鼠皮膚組織中PCNA蛋白含量與模型組比較無明顯差異。

圖2為光鏡下觀察PCNA陽性表達(dá)率情況。陽性物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀，正常對照組小鼠陰道上皮細(xì)胞中PCNA主要表達(dá)于基底層細(xì)胞，且著色較淺;與正常對照組比較，模型組PCNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)，在基底層和部分棘層均有活躍表達(dá)，而且著色較深;10.0、5.0g/kg芍黃顆粒與0.1g/kg雷公藤多苷片可明顯抑制PCNA的表達(dá)。

2.4 芍黃顆粒對鼠尾鱗片顆粒層模型的影響

由表3可見，與正常對照組比較，10.0g/kg芍黃顆粒組鼠尾有顆粒層的鱗片數(shù)極顯著升高（P<0.01）。

2.5 芍黃顆粒對小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂的影響

由表4可見，與模型組比較，10.0g/kg芍黃顆粒組小鼠陰道上皮有絲分裂指數(shù)顯著降低（P<0.05）。

3 小結(jié)與討論

咪喹莫特為Toll樣受體激動(dòng)藥，其與表皮漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞內(nèi)的TLR7結(jié)合，分泌大量的干擾素α以及多種白細(xì)胞介素致動(dòng)物表皮角化過度、角化不全、棘層肥厚、血管生成和炎細(xì)胞浸潤等人類銀屑病的組織病理學(xué)改變[11]。

雌激素期的小鼠陰道上皮細(xì)胞增殖活躍，基底層有絲分裂增加，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換加快，可模擬銀屑病表皮增殖加速的特點(diǎn)，以評價(jià)藥物抑制細(xì)胞有絲分裂的作用，藥物如能抑制小鼠陰道上皮基底細(xì)胞的有絲分裂，說明其可能抑制銀屑病表皮的增生，從而具有改善作用。正常情況下，小鼠尾部鱗片的表皮角質(zhì)層角質(zhì)形成細(xì)胞保留有細(xì)胞核，而顆粒層細(xì)胞缺失，其天然的角化形式與人類銀屑病表皮相似，可以模擬銀屑病角化不全的特點(diǎn)，藥物如果能促進(jìn)鼠尾鱗片表皮生成顆粒層，則說明其可能改變銀屑病表皮的角化不全，從而具有改善作用。以上3種模型被作為篩選抗銀屑病藥物的常用模型[12-14]。

本試驗(yàn)選用上述3種常用模型評價(jià)芍黃顆粒對銀屑病的藥效學(xué)作用。結(jié)果表明，不同劑量芍黃顆粒均能降低銀屑病模型小鼠的皮膚厚度，使小鼠皮膚角化過度程度減輕、棘層變薄，表皮層厚度明顯低于模型組。高劑量芍黃顆粒能使鼠尾有顆粒層的鱗片數(shù)明顯增多，促進(jìn)鼠尾鱗片表皮生成顆粒層，說明其可能改變銀屑病表皮的角化不全。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)良好的指標(biāo)，用PCNA標(biāo)記可從分子水平反映上皮細(xì)胞增殖程度的變化。在正常表皮細(xì)胞中，PCNA表達(dá)水平較低，而在銀屑病中由于表皮基底細(xì)胞增生加速，PCNA表達(dá)明顯增強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，中、高劑量芍黃顆粒能顯著抑制銀屑病模型小鼠皮膚組織中PCNA蛋白表達(dá)量，與謝青等[15]研究結(jié)果一致。同時(shí)，高劑量芍黃顆粒使小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂指數(shù)明顯降低，可抑制小鼠陰道上皮基底細(xì)胞的有絲分裂，說明其可能抑制銀屑病表皮的增生，從而具有改善銀屑病作用，這也與芍黃顆粒抑制銀屑病模型小鼠皮膚組織中PCNA蛋白表達(dá)量結(jié)果一致。綜上可知，芍黃顆粒對銀屑病癥狀有很好的改善作用，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]PREY S，PAUL C，BRONSARD V，et al.Cardiovascular risk factorsin patients with plaque psoriasis：A systematic review ofepidemiological studies[J].J For Acad Dermatol Venereol，2010，24（Suppl 2）：23-30.

[2]BREMMER S，VAN VOORHEES A S，HSU S，et al.Obesity andpsoriasis：From the medical board of the national psoriasisfoundation[J].J Am Acad Dermatol，2010，63（6）：1058-1069.

[3]張建中.銀屑病的流行病學(xué)與危險(xiǎn)因素[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2013，10（1）：4-6.

[4]王媛中，黃旦.中醫(yī)藥治療銀屑病研究進(jìn)展[J].吉林中醫(yī)藥，2015，35（8）：861-864.

[5]韓珊珊，李輝，黨翔吉，等.銀屑片治療小鼠銀屑病的實(shí)驗(yàn)研究[J].中成藥，2014，36（12）：2463-2466.

[6]王萍，聶繼紅，孫玉華.雙黃解毒乳膏對銀屑病動(dòng)物模型作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中成藥，2011，33（7）：1227-1229.

[7]底婷婷，趙京霞，王燕，等.涼血活血膠囊對咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損的干預(yù)作用[J].中國病理生理雜志，2012，28（4）：718-722.

[8]黨翔吉，張鎮(zhèn)，魏立明，等.復(fù)方桅子凝膠對銀屑病動(dòng)物模型的干預(yù)作用[J].中藥藥理與臨床，2013，29（5）：128-131.

[9]施惠娟，周茹，金少舉，等_氧化苦參堿對銀屑病模型雌激素周期小鼠陰道上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].臨床皮膚科雜志，2011，40（11）：669-671.

[10]劉海杰，史新明，歐陽恒，等.仙方消銀片對模擬銀屑病模型小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2006，12（5）：488-490.

[11]賴奇?zhèn)?咪喹莫特誘發(fā)銀屑病的機(jī)制研究新進(jìn)展[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2013，20（20）：25-27.

[12]閆玉紅，趙瑞芝，盧傳堅(jiān).銀屑靈片處方優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2014，25（11）：2673-2675.

[13]韓珊珊，郭菲，劉紅霞.銀屑病模型與脾虛銀屑病病癥結(jié)合模型相關(guān)指標(biāo)的差異[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35（4）：416-419.

[14]熱比姑麗.伊斯拉木，阿瓦姑力.伊斯拉木，斯拉甫.艾白.銀屑病動(dòng)物模型研究概況[J].中國藥房，2015，26（19）：2726-2729.

[15]謝青，王進(jìn)，王菊英，等.依托泊苷對雌激素周期小鼠陰道上皮細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響[J].中國生化藥物雜志，2009，30（1）：21-24.

收稿日期：2019-07-09

基金項(xiàng)目：四川省省級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)（A-2018N-24）;四川省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究專項(xiàng)（2018QN041）

作者簡介：程國強(qiáng)（1984-），男，河南課河人，助理研究員，主要從事中藥藥理、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究，（電話）028-85247897（電子信箱cheng-gq110@163.com;通信作者，洪楊（1986-），女，四川成都人，助理研究員，主要從事動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)研究，（電話）18384125659（電子信箱）452663212@qq.com。