甘露醇兼養(yǎng)三角褐指藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和巖藻黃質(zhì)

丁曉婷， 王麗娟, 范 勇, 張培玉, 李福利

(1. 青島大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 青島 266071； 2. 中國(guó)科學(xué)院 青島生物能源與過程研究所, 青島 266101)

三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)是屬于硅藻門(Bacillariophyta)的海洋微藻。細(xì)胞中EPA(Eicosapentaenoic acid，二十碳五烯酸)含量能達(dá)到油脂的20%以上[1]。EPA是含5個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFA)，積極補(bǔ)充EPA對(duì)嬰兒大腦發(fā)育及成人心血管系統(tǒng)疾病的防治具有很好的效果[2]。另外，作為模式硅藻，三角褐指藻中富含F(xiàn)CP復(fù)合體(Fucoxanthin-chlorophyll a/c protein，巖藻黃素-葉綠素a/c蛋白復(fù)合體)，巖藻黃質(zhì)含量在15.42～16.51 mg/g之間[3-4]。巖藻黃質(zhì)(Fucoxanthin，F(xiàn)x)，又稱巖藻黃素或褐藻素，為偏極性類胡蘿卜素[5]。服用巖藻黃質(zhì)能加快新陳代謝，調(diào)節(jié)3-羥甲戊二酰輔酶A還原酶和?；o酶A的活性[6]。巖藻黃質(zhì)可以抑制肝臟中脂肪的積累，降低磷脂磷酸水解酶的活性，并通過刺激線粒體解偶聯(lián)蛋白在白色脂肪組織中的表達(dá)從而起到減肥作用[7]。

自20世紀(jì)80年代后，微藻養(yǎng)殖開始在全世界推廣開來[8-11]，其產(chǎn)品應(yīng)用于健康食品、化妝品、醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)、高檔飼料等領(lǐng)域。在微藻的培養(yǎng)過程中，其營(yíng)養(yǎng)方式具有多樣性，大多數(shù)微藻采用光合自養(yǎng)(Phetoautotrophy)方式，也有許多微藻具有利用有機(jī)碳進(jìn)行兼養(yǎng)(Mixotrophy)和異養(yǎng)(Heterotrophy)生長(zhǎng)的能力[12]。自養(yǎng)培養(yǎng)在生長(zhǎng)中后期會(huì)受光照限制，而兼養(yǎng)和異養(yǎng)能夠部分消除光照限制[13]，為微藻高密度培養(yǎng)提供了一條有效途徑。選擇一種適合兼養(yǎng)利用的碳源，是決定兼養(yǎng)生長(zhǎng)速度和經(jīng)濟(jì)性高于其他培養(yǎng)方式的最關(guān)鍵因素。另外，在培養(yǎng)過程中，常規(guī)有機(jī)碳源面臨著培養(yǎng)過程易污染，有機(jī)碳源利用率低使得培養(yǎng)成本高等問題，限制了大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。使用甘油、乙酸鈉和葡萄糖作為兼養(yǎng)碳源，對(duì)三角褐指藻利用多種有機(jī)碳源進(jìn)行兼養(yǎng)培養(yǎng)的過程進(jìn)行分析，培養(yǎng)生物量分別達(dá)到自養(yǎng)的1.60、1.28和1.21倍[13]。進(jìn)一步提高兼養(yǎng)效率，尋找在常規(guī)培養(yǎng)環(huán)境中雜菌不易利用的有機(jī)碳源以及改善培養(yǎng)基和細(xì)胞狀態(tài)的活性添加劑，提高兼養(yǎng)碳源利用率，是我們探索的方向。

甘露醇(Mannitol)是褐藻的主要積累物質(zhì)之一，是海洋中含量最為豐富的一類單糖物質(zhì)[14]。其能通過磷酸轉(zhuǎn)移酶(phosphotransferase system，PTS system)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過甘露醇磷酸脫氫酶(Mannitol-1-phosphate dehydrogenases)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，進(jìn)入碳代謝途徑，因此可以被選作在兼養(yǎng)培養(yǎng)過程中作為有機(jī)碳源進(jìn)行添加。鑒于此作者針對(duì)三角褐指藻兼養(yǎng)過程，提供一種利用甘露醇兼養(yǎng)三角褐指藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和巖藻黃質(zhì)的方法，旨在提高三角褐指藻生產(chǎn)率。

1 材料與方法

1.1 藻種與基礎(chǔ)培養(yǎng)條件

三角褐指藻，購(gòu)自中國(guó)海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫(kù)，編號(hào)MACC/B228。

培養(yǎng)條件：使用優(yōu)化的f/2培養(yǎng)基[15]，溫度25 ℃，光照80 μmol photons/m2·s，光周期為16 h光照、8 h黑暗。自養(yǎng)培養(yǎng)2 d后，加入不同濃度的甘露醇及茶多酚，培養(yǎng)至第10天，測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，用于分析最佳兼養(yǎng)碳源濃度和活性添加劑的濃度。

在使用最佳添加濃度進(jìn)行培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，調(diào)整培養(yǎng)條件用于巖藻黃質(zhì)和EPA產(chǎn)量分析評(píng)價(jià)。在培養(yǎng)過程中每2 d檢測(cè)和計(jì)算甘露醇和茶多酚的利用情況，并補(bǔ)加甘露醇與茶多酚至初始濃度繼續(xù)培養(yǎng)至第10天，測(cè)定三角褐指藻的巖藻黃質(zhì)濃度和EPA含量。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥品

甘露醇和茶多酚購(gòu)自山東西唐生物科技有限公司，普通市售產(chǎn)品，食品級(jí)；海鹽購(gòu)自青島海之鹽水族科技有限公司，普通市售產(chǎn)品；巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；EPA標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海安譜(ANPEL)實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 巖藻黃質(zhì)的測(cè)定

三角褐指藻藻細(xì)胞(細(xì)胞干重約為50～60 mg)在4000 r/min速度下離心收集，重懸在乙醇中進(jìn)行色素提取，45 ℃保溫2 h，每0.5 h震蕩1次，通過高速離心將提取的色素與藻渣分離。巖藻黃質(zhì)含量的測(cè)定使用高效液相色譜儀檢測(cè)系統(tǒng)(Primaide，Hitachi)，選擇反相C18色譜柱(2.7 μm，100×4.6 mm)。檢測(cè)波長(zhǎng)445 nm，進(jìn)樣量5 μL。流動(dòng)相為乙腈和水，流速1 mL/min。乙腈比例在8 min內(nèi)由80%升至100%, 維持這個(gè)比例洗脫3 min。使用巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

1.3.2 EPA的測(cè)定

三角褐指藻藻細(xì)胞(細(xì)胞干重約為50～60 mg)在4000 r/min速度下離心收集。加入6 mL氯仿-甲醇溶液(2∶1，V/V)，37 ℃搖床中震蕩1 h，隨后加入2 mL KCL(0.9%)充分震蕩。5000 r/min離心5 min，分離油層并用氮吹儀吹干后得到藻油。加入1.5 mL正己烷使藻油能夠完全溶解，之后加入4.5 mL 2% 硫酸-甲醇(正己烷∶硫酸-甲醇=1∶3，V/V)，85 ℃甲酯化反應(yīng)3 h。用于氣相色譜(GC)分析脂肪酸甲酯組成[12, 16]。

利用安捷倫7890A氣相色譜進(jìn)行分析，色譜柱為HP-5(30 m×320 μm×0.25 μm)。進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣體積：1 μL；升溫程序設(shè)置：120 ℃維持5 min，隨后3.5 ℃/min升至240 ℃，保持10 min。

1.3.3 甘露醇的測(cè)定

使用2 g/L甘露醇培養(yǎng)三角褐指藻的過程中，將5 mL藻液在12 000 r/min速度下離心，收集上清培養(yǎng)液，根據(jù)樣品濃度稀釋，使用安捷倫高效液相色譜儀示差檢測(cè)器檢測(cè)系統(tǒng)(Agilent 1260)，選擇Bio-RAD Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm)，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫箱55 ℃，流動(dòng)相為5 mol/L H2SO4，流速為0.5 mL/min，等強(qiáng)度洗脫30 min。

1.3.4 茶多酚的測(cè)定

使用2 g/L甘露醇和0.2 g/L茶多酚培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，對(duì)茶多酚含量進(jìn)行分析。將5 mL三角褐指藻在12 000 r/min速度下離心，收集上清，根據(jù)樣品濃度稀釋，使用高效液相色譜儀檢測(cè)系統(tǒng)(Primaide，Hitachi)，選擇反相C18色譜柱(2.7 μm，100×4.6 mm)。檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，進(jìn)樣量為10 μL，流動(dòng)相為甲醇∶水=24∶76，流速為1 mL/min，等強(qiáng)度洗脫30 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度甘露醇條件下三角褐指藻的生長(zhǎng)

不同濃度甘露醇作為外加有機(jī)碳源的條件下，生長(zhǎng)情況如圖1-A所示，甘露醇濃度在2～10 g/L的范圍內(nèi)，最大生物量均超過對(duì)照，各組之間無顯著差異(P>0.05)。甘露醇濃度為0.5～1 g/L時(shí)，達(dá)不到促進(jìn)兼養(yǎng)培養(yǎng)的效果。而甘露醇濃度為15 g/L時(shí)，可能抑制了三角褐指藻的生長(zhǎng)。因此在培養(yǎng)過程中，基于培養(yǎng)成本的考慮，可以選取2 g/L甘露醇濃度作為最佳的培養(yǎng)濃度。

2.2 通過添加茶多酚促進(jìn)三角褐指藻利用甘露醇進(jìn)行兼養(yǎng)生長(zhǎng)

茶多酚是一種水溶性抗氧化劑，在本研究組的前期研究中，發(fā)現(xiàn)茶多酚可促進(jìn)產(chǎn)神經(jīng)酸微藻Mychonastesafer的生長(zhǎng)[17]。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，在2 g/L的甘露醇作為有機(jī)碳源的條件下，使用不同濃度梯度的茶多酚作為抗氧化物質(zhì)，改善細(xì)胞狀態(tài)，提高三角褐指藻的兼養(yǎng)速率。結(jié)果(圖1-B)顯示：當(dāng)茶多酚濃度在0.1～2 g/L的范圍內(nèi)，生長(zhǎng)速率均超過對(duì)照。茶多酚濃度達(dá)到5 g/L時(shí)，開始影響三角褐指藻的正常生長(zhǎng)。培養(yǎng)至第10 d時(shí)，最大生物量稍低于圖1-A中只加甘露醇獲得的最大生物量，這可能由于兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)接種時(shí)的種子液活性有所差異。但多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同一實(shí)驗(yàn)批次中與不加茶多酚的對(duì)照組相比，其差異性顯著。因此三角褐指藻在甘露醇濃度為2 g/L的條件下，選取添加0.2 g/L茶多酚時(shí)以獲得最大生物量。

A中CT為對(duì)照組不添加甘露醇；B為在添加2 g/L甘露醇作為有機(jī)碳源的基礎(chǔ)下，不同濃度茶多酚條件下的生長(zhǎng)曲線；CT為對(duì)照組不添加茶多酚

2.3 兼養(yǎng)培養(yǎng)三角褐指藻過程中甘露醇與茶多酚的利用

以2 g/L甘露醇，0.2 g/L茶多酚為添加濃度，對(duì)三角褐指藻進(jìn)行培養(yǎng)，同光合自養(yǎng)生長(zhǎng)組和只加甘露醇的對(duì)照組進(jìn)行比較。在培養(yǎng)過程中，測(cè)定培養(yǎng)液中的剩余甘露醇與茶多酚的量。結(jié)果(圖2-A)顯示，培養(yǎng)2 d后，甘露醇具有不同的利用水平，添加茶多酚的實(shí)驗(yàn)組利用率為50%，而未添加茶多酚的對(duì)照組，利用率僅為20%，說明茶多酚能夠促進(jìn)甘露醇的利用；液相色譜結(jié)果(圖2-B)顯示，兒茶素類化合物，主要包括兒茶素(EC)、沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素沒食子酸酯(ECG)和沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)等物質(zhì)，含量逐步減少，說明茶多酚的主要活性成分參與了細(xì)胞的生理活動(dòng)，或者在培養(yǎng)過程中存在降解過程。分析結(jié)果顯示單位時(shí)間內(nèi)(2 d)，添加茶多酚的實(shí)驗(yàn)組，甘露醇利用率穩(wěn)定在39%～48%，而僅添加甘露醇的實(shí)驗(yàn)組，其利用率穩(wěn)定在22%～30%之間；茶多酚的主要成分被利用或者降解完全。因此，基于以上檢測(cè)分析得到的結(jié)果，每2 d補(bǔ)加甘露醇和茶多酚至初始濃度。培養(yǎng)至第10天，測(cè)定EPA與巖藻黃質(zhì)的含量。

A為培養(yǎng)2 d后的甘露醇的利用情況，TP：茶多酚；B為使用HPLC分析茶多酚主要成分，1：表沒食子酸兒茶素；2：右旋兒茶素；3：表沒食子兒茶素沒食子酸酯；4：表兒茶素；5：表兒茶素沒食子酸酯

由圖3可知，添加甘露醇的2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，三角褐指藻巖藻黃質(zhì)和EPA含量都要高于光合自養(yǎng)對(duì)照組;在進(jìn)一步添加茶多酚的情況下，巖藻黃質(zhì)和EPA的含量分別比僅添加甘露醇的實(shí)驗(yàn)組高出30%和6%，說明茶多酚的添加能夠有效地促進(jìn)三角褐指藻的兼養(yǎng)效率，達(dá)到提高巖藻黃質(zhì)和多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的目的。

A為巖藻黃質(zhì)含量；B為EPA在總油脂中的含量，TP：茶多酚

2.4 比較甘露醇和甘油作為有機(jī)碳源培養(yǎng)三角褐指藻的差異

在方法1.1的基礎(chǔ)上，使用不同有機(jī)碳源對(duì)三角褐指藻進(jìn)行兼養(yǎng)培養(yǎng)，分別以2 g/L的甘油或者甘露醇作為初始外加有機(jī)碳源，并添加0.2 g/L茶多酚，培養(yǎng)過程中僅在培養(yǎng)的第2天添加一次有機(jī)碳源。

結(jié)果(圖4)表明，使用甘油作為碳源，在添加茶多酚的情況下也具有較好的兼養(yǎng)效果。在培養(yǎng)至第10天時(shí)，生物量和巖藻黃質(zhì)的含量分別比光合自養(yǎng)高出26%和53%，而以甘露醇為碳源時(shí)，生物量和巖藻黃質(zhì)的含量分別比光合自養(yǎng)高出63%和90%。這說明在添加茶多酚的情況下，甘油和甘露醇作為有機(jī)碳源都能用于三角褐指藻的兼養(yǎng)培養(yǎng)，其中甘露醇的培養(yǎng)效果更好。

A為生長(zhǎng)曲線；B為巖藻黃質(zhì)含量。Control：光合自養(yǎng)組；TP：茶多酚

3 討論與結(jié)論

甘露醇是海洋環(huán)境中的主要碳水化合物之一，在海洋中分布廣泛。三角褐指藻作為海洋微藻，能夠適應(yīng)甘露醇的滲透壓力，并具有利用甘露醇的關(guān)鍵代謝途徑和基因(甘露醇-1-磷酸脫氫酶；XP_002182129.1；Mannitol-1-phosphate dehydrogenases)，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甘露醇同甘油作為碳源相比，能夠有效提高三角褐指藻的兼養(yǎng)生長(zhǎng)速度和產(chǎn)量(提高了30%)，使得甘露醇可以作為一種有效的兼養(yǎng)碳源。并且在相同培養(yǎng)條件下，含甘露醇的培養(yǎng)體系不易被環(huán)境中的雜菌污染，在短期的兼養(yǎng)培養(yǎng)周期中，不會(huì)因?yàn)榫奈廴径斐膳囵B(yǎng)過程的失敗。另外還發(fā)現(xiàn)添加茶多酚的培養(yǎng)體系具有很好的環(huán)境抗逆效果。茶多酚的分子作用機(jī)理目前還不清楚，但在Xu[17]等的工作中，表征了通過添加植物生長(zhǎng)因子及茶多酚，微藻細(xì)胞內(nèi)活性氧水平下降，PSII受到氧化損傷程度低，因此修復(fù)組裝受損PSII光合系統(tǒng)的CP43蛋白表達(dá)下調(diào)。因此，我們推測(cè)，在三角褐指藻中，其具有相似的作用機(jī)理，進(jìn)一步優(yōu)化兼養(yǎng)培養(yǎng)體系的輔因子添加，提高碳源利用率和經(jīng)濟(jì)效益，是我們今后需要進(jìn)一步嘗試改進(jìn)的方面。