優(yōu)化大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)及應(yīng)用

邵夢瑤, 路福平, 朱欣娜, 張學(xué)禮

(1. 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院, 天津 310018； 2. 中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所, 天津 300308； 3. 中國科學(xué)院 系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300308)

大腸桿菌被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工程和代謝工程等諸多生物學(xué)領(lǐng)域[1]。為使大腸桿菌成為生產(chǎn)有機(jī)酸[2]和氨基酸[3-4]等重要的工程菌株，敲除及整合外源功能基因是常常用到的策略。通常的技術(shù)手段是利用Red重組酶進(jìn)行同源重組實(shí)現(xiàn)基因的敲除和整合，但該技術(shù)方法操作繁瑣。因此，研究人員對簡單快速的基因編輯系統(tǒng)的需求越來越迫切。

2012年，Jennifer A. Doudna[5]闡明了Type II CRISPR系統(tǒng)中的Cas9核酸酶(來源于化膿鏈球菌Streptococcuspyogenes)的功能，這個160 ku的核酸酶結(jié)合兩個RNA(crRNA和tracrRNA)就可以實(shí)現(xiàn)對雙鏈DNA的切割。這為新的基因編輯系統(tǒng)奠定了最根本的基礎(chǔ)。

2013年，張峰課題組[6]證實(shí)了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)對原核微生物如鏈球菌和大腸桿菌的基因編輯。該研究雖然證明了CRISPR/Cas9[7]能對大腸桿菌進(jìn)行基因編輯，但并沒有建立起良好的可操作體系。2015年，美國伊利諾伊大學(xué)香檳分校趙惠民課題組[8]和中科院上海植生所楊晟課題組[9]分別在鏈球菌和在大腸桿菌中建立了完善的 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)。這兩個系統(tǒng)都將crRNA和tracrRNA融合表達(dá)出gRNA，不同之處前者是單質(zhì)粒編輯系統(tǒng)，后者是雙質(zhì)粒編輯系統(tǒng)。單質(zhì)粒編輯系統(tǒng)[10]將Cas9，gRNA和供體DNA構(gòu)建在同一個表達(dá)載體上，在遺傳操作過程中，只需一輪質(zhì)粒轉(zhuǎn)化就能實(shí)現(xiàn)對基因組的編輯。但單質(zhì)粒由于本身骨架片段較大，可插入的供體DNA大小受限，質(zhì)粒構(gòu)建會有一定的難度。雙質(zhì)粒編輯系統(tǒng)可以解決單質(zhì)粒構(gòu)建困難的問題，將Cas9，Red構(gòu)建在一個質(zhì)粒上，將目標(biāo)N20-gRNA, 供體DNA片段構(gòu)建在另一個質(zhì)粒上，利用這個雙質(zhì)粒CRISPR/Cas9系統(tǒng)，大腸桿菌單基因編輯的效率達(dá)到100%。

本實(shí)驗(yàn)室在2016年建立了CRISRP/Cas9單質(zhì)?；蚓庉嬒到y(tǒng)，單基因編輯效率達(dá)到100%。隨后，構(gòu)建了雙質(zhì)?；蚓庉嬒到y(tǒng)[11]，實(shí)現(xiàn)了多個嚴(yán)謹(jǐn)型啟動子的高效整合(編輯效率達(dá)到100%)，為快速評價啟動子在染色體上的功能提供了可能。然而，將該系統(tǒng)用于于工程菌株的構(gòu)建時，我們發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)進(jìn)行基因的敲除[12]或外源基因的整合過程中，供體質(zhì)粒很難通過傳代培養(yǎng)及電擊[16]的方式消除，影響了工程菌株的構(gòu)建進(jìn)程。

因此，本文旨在構(gòu)建擁有自剪切功能的供體質(zhì)粒，優(yōu)化已有的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，并應(yīng)用于衣康酸工程菌株的構(gòu)建中，實(shí)現(xiàn)了基因的連續(xù)敲除和整合，快速地得到工程菌株，為工程菌株的構(gòu)建和改造提供一種更為便捷的高效方法。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

本實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的菌株和質(zhì)粒

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基[14]，用于大腸桿菌的培養(yǎng)，37 ℃，250 r/min。NBS培養(yǎng)基[18]，用于衣康酸的發(fā)酵，30 ℃，200 r/min。

1.3 試劑及儀器

抗生素的使用濃度分別為：氨芐霉素100 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL，氯霉素34 μg/mL。誘導(dǎo)劑：0.5 mmol/L IPTG和1% L(+)阿拉伯糖。抗生素和誘導(dǎo)劑，美國SIGMA-ALDRICH試劑公司；PCR高保真擴(kuò)增Phusion酶，快速T4 DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶BsaI，美國NEB生物公司；Trans T1 感受態(tài)細(xì)胞，中國全式金生物技術(shù)有限公司；Sigma 3-18K離心機(jī)，德國SIGMA實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)公司；全自動凝膠成像儀，美國Bio-rad生物公司。

1.4 含有自剪切元件的供體質(zhì)粒pV4構(gòu)建

以placZ質(zhì)粒為模板，使用引物Bone-F和Bone-R進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物I，用引物cat-N20-up和cat-N20-down進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物II；以pACYC184-M質(zhì)粒[14]為模板，用引物lacI-Ptrc-up和lacI-Ptrc-down進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物III。PCR產(chǎn)物用DpnI處理模板DNA，用Golden Gate 技術(shù)組裝策略[15]將PCR片段I、II和III進(jìn)行組裝，得到供體pV4質(zhì)粒。質(zhì)粒見表1，引物序列見表2。

1.5 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中自剪切供體質(zhì)粒的構(gòu)建

1.5.1 敲除型供體質(zhì)粒pV4-del-gene的構(gòu)建

以pV4質(zhì)粒為模板，用引物對N20-B-F1/N20-B-R1擴(kuò)增獲得pV4骨架片段，用引物gene-N20-B-F2/N20-B-R2擴(kuò)增出針對目標(biāo)基因gene-N20-gRNA的片段；以E.coliATCC 8739 DNA為模板，用引物gene-F1/gene-R1和gene-F2/gene-R2分別PCR擴(kuò)增得到敲除基因的上下游同源臂序列。用材料和方法1.4中的組裝策略得到pV4-del- gene質(zhì)粒。該通用方法構(gòu)建pV4-del-ptsI和pV4-del-iclR供體質(zhì)粒，引物命名將gene替換為ptsI或iclR(表2)。

表2 本研究所用的引物及調(diào)控元件序列

1.5.2 整合型供體質(zhì)粒pV4-ins-gene的構(gòu)建

和構(gòu)建敲除型質(zhì)粒方法1.5.1類似，除了擴(kuò)增pV4骨架片段、針對目標(biāo)基因的gene-N20-gRNA片段和基因的上下游同源臂片段外，還要擴(kuò)增需要整合的基因片段。

以pUC57-kan-M1-93-cad質(zhì)粒為模板，用引物93-cad-F-GGTG和93-cad-R-CTGG擴(kuò)增出大小1.2 kb的片段。該片段和pV4骨架片段，araBAD-N20-gRNA片段，araBAD基因上下游同源臂片段進(jìn)行組裝和轉(zhuǎn)化，得到pV4-del-araBAD-ins-cad質(zhì)粒。

1.6 利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因的敲除和整合

具體過程見文獻(xiàn)[11]。

1.7 CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)中pV4系列供體質(zhì)粒的消除

當(dāng)CRISPR/Cas9雙質(zhì)粒(pRedCas9和pV4系列供體質(zhì)粒)編輯系統(tǒng)完成某個基因的敲除或整合后，將PCR驗(yàn)證正確的單克隆在LB (含0.1 mmol/L IPTG)平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)，10～12 h得到單克隆。將單克隆分別點(diǎn)板于LB氯霉素和LB平板，37 ℃培養(yǎng)3～5 h。觀察氯霉素平板上不長，LB平板上生長的單克隆，即為消除pV4系列供體質(zhì)粒的菌株。

2 結(jié)果和分析

2.1 大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)優(yōu)化

2.1.1 大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)優(yōu)化原理及使用范圍

在大腸桿菌中構(gòu)建代謝途徑時，常常需要連續(xù)的進(jìn)行基因敲除或者整合。利用現(xiàn)有的CRISPR/Cas9雙質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行基因的編輯時，供體DNA質(zhì)粒的消除是實(shí)現(xiàn)基因連續(xù)編輯的前提。雖然采用連續(xù)的劃線傳代及電擊的方法可以消除供體DNA質(zhì)粒[16]，但是耗時長、消耗大量的人力和物力。為提升代謝工程菌株構(gòu)建的效率，有必要對已有的CRISPR/Cas9雙質(zhì)?；蚓庉嬒到y(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，提高供體DNA質(zhì)粒消除效率。因此，本研究對前期的CRISPR/Cas9雙質(zhì)粒基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行了思考，優(yōu)化了該編輯系統(tǒng)中的供體DNA質(zhì)粒(圖1)，在供體DNA質(zhì)粒上添加了自剪切功能元件，使完成基因編輯后，在Cas9蛋白和IPTG的誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)供體DNA質(zhì)粒的自剪切，從而方便下一輪基因的編輯。

A：優(yōu)化CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)供體DNA質(zhì)粒。 B：優(yōu)化CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)基因的連續(xù)編輯。a：在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化pRedCas9質(zhì)粒；b：轉(zhuǎn)化含有供體DNA且具有自剪切功能的pV4質(zhì)粒，對目標(biāo)基因進(jìn)行編輯(敲除或者整合)；c：編輯后，在Cas9和IPTG的誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)供體DNA質(zhì)粒自剪切消除，從而可以進(jìn)行下一輪的基因編輯。骨架片段通用引物對N20-B-F/N20-B-R；Pcon: 組成型啟動子；lacIq調(diào)控Ptrc啟動子；cat氯霉素基因，P15A復(fù)制子；Red重組；Cas9蛋白；PBAD 為組成型啟動子

供體DNA質(zhì)粒具體的優(yōu)化改造過程如圖1-A所示。從實(shí)驗(yàn)室已有的供體DNA質(zhì)粒placZ出發(fā)，在其質(zhì)粒的骨架區(qū)域上添加了針對氯霉素抗性基因(cat)的N20-gRNA序列元件，該元件在Ptrc啟動子下表達(dá)。在IPTG的誘導(dǎo)下，Ptrc啟動子表達(dá)，轉(zhuǎn)錄得到cat-N20-gRNA，該前導(dǎo)gRNA識別并與cat基因的特異20 bp結(jié)合，在Cas9蛋白的幫助下實(shí)現(xiàn)對供體DNA質(zhì)粒pV4的剪切。當(dāng)把敲除或整合基因片段連接于pV4質(zhì)粒的骨架片段上(圖1-A)，就能獲得敲除型或整合型自剪切pV4供體質(zhì)粒(pV4-del-gene或pV4-ins-gene)。圖1-B示意了利用自剪切供體pV4系列質(zhì)粒的CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對基因連續(xù)編輯的過程。

2.1.2 自剪切pV4質(zhì)粒作為供體質(zhì)粒的優(yōu)勢

我們構(gòu)建的自剪切供體質(zhì)粒，可以在IPTG的誘導(dǎo)下及Cas9蛋白的幫助下實(shí)現(xiàn)對供體DNA質(zhì)粒pV4的剪切。與沒有針對氯霉素抗性基因(cat)的N20-gRNA序列的pV4質(zhì)粒相比，它的質(zhì)粒消除時間短，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)室的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)基因的連續(xù)敲除或整合，節(jié)約了基因操作的時間，有廣泛的工程菌株構(gòu)建應(yīng)用前景。

2.2 優(yōu)化CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中的供體質(zhì)粒

為優(yōu)化雙質(zhì)粒CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對基因的連續(xù)編輯，對供體DNA質(zhì)粒進(jìn)行了改造：在供體質(zhì)粒placZ的骨架區(qū)域添加上3個元件：cat-N20-gRNA元件，以placZ質(zhì)粒為模板，用引物cat-N20-up/cat-N20-down擴(kuò)增得到，大小400 bp(圖2-A，泳道2)；元件lacIq和元件Ptrc在質(zhì)粒pMACYC184上相鄰，用引物lacI-Ptrc-up/lacI-Ptrc-down擴(kuò)增得到，大小1.5 kb(圖2-A，泳道3)。將這3個元件和placZ反向擴(kuò)增的骨架片段(圖2-A，泳道1)用Golden Gate策略組裝，得到pV4質(zhì)粒(圖2-B)。pV4質(zhì)粒含有自剪切元件lacIq-Ptrc-cat-N20-gRNA，在IPTG誘導(dǎo)和Cas9蛋白作用下，可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的自我消除。

A： pV4質(zhì)粒組裝PCR片段; B： pV4質(zhì)粒; M: DNA marker trans 2K plus

2.3 應(yīng)用優(yōu)化的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)快速構(gòu)建工程菌株

為顯示優(yōu)化后的CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)的方便快捷，將其應(yīng)用于大腸桿菌產(chǎn)衣康酸工程菌株的構(gòu)建。構(gòu)建大腸桿菌衣康酸工程菌，需要敲除ptsI(糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)酶I)基因，iclR(異檸檬酸裂解酶調(diào)節(jié)劑)基因及整合cad(順烏頭酸脫羧酶)基因。

2.3.1 構(gòu)建敲除型pV4-del-gene和整合型pV4-ins-gene質(zhì)粒

為敲除ptsI、iclR基因和整合cad基因，首先要構(gòu)建兩個敲除型質(zhì)粒pV4-del-ptsI和pV4-del-iclR，一個整合型質(zhì)粒pV4-del-araBAD-ins-cad，將cad基因整合到大腸桿菌araBAD基因位點(diǎn)。

以pV4質(zhì)粒為DNA模板，擴(kuò)增得到pV4系列質(zhì)粒的通用骨架片段，大小為4.4 kb(圖3-A、B、C，泳道1)，含有氯霉素抗性基因cat和復(fù)制子P15A序列及自剪切元件lacI-Ptrc-cat-N20-gRNA。同時，以pV4質(zhì)粒為模板，得到400 bp的針對目標(biāo)基因的N20-gRNA，分別為ptsI-N20-gRNA，iclR-N20-gRNA及araBAD-N20-gRNA (圖3-A、B、C，泳道2)。以ATCC 8739 DNA為模板，擴(kuò)增得到ptsI、iclR上下游400 bp(圖3-A、B，泳道3和4)和araBAD上、下游約400～500 bp的DNA片段(圖3-C，泳道3和5)。以pUC57-kan-M1-93-cad質(zhì)粒DNA模板， 擴(kuò)增得到cad基因和M1-93啟動子序列，大小約1 kb (圖3-C，泳道4)。

按照Golden Gate的片段組裝策略，分別組裝ptsI、iclR敲除型質(zhì)粒和cad整合型質(zhì)粒。組裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans T1感受態(tài)細(xì)胞，得到的克隆PCR驗(yàn)證分析后送樣測序，組裝正確的效率達(dá)到100%。pV4-del-ptsI，pV4-del-iclR和pV4-del-araBAD-ins-cad的質(zhì)粒電泳圖，見圖3-D 泳道1、2和3。

A：組裝pV4-del-ptsI質(zhì)粒的PCR片段; B：組裝pV4-del-iclR質(zhì)粒的CR片段; C：組裝pV4-del-araBAD-ins-cad質(zhì)粒的PCR片段； D：供體pV4系列質(zhì)粒。M: DNA marker trans 2K plus

2.3.2 基因的連續(xù)敲除及其供體質(zhì)粒的消除

從野生型大腸桿菌E.coliATCC 8739出發(fā)，依次敲除ptsI基因和iclR基因，整合cad基因。

將含有pRedCas9和供體質(zhì)粒的pV4-del-ptsI的大腸桿菌，接種于LB液體培養(yǎng)基(含阿拉伯糖)，誘導(dǎo)同源重組Red敲除ptsI基因和表達(dá)Cas9蛋白切割未發(fā)生同源重組的染色體。在含有阿拉伯糖的LB平板上劃線，得到單克隆，用ptsI-YZ-up/ptsI-YZ-down引物進(jìn)行ptsI基因敲除驗(yàn)證。結(jié)果顯示：驗(yàn)證的6個克隆ptsI基因均被敲除，其電泳條帶大小為750 bp(圖4-A左，泳道1～6)，對照未敲除的大小是2 kb(圖4-A左，泳道7) 。

供體質(zhì)粒pV4-del-ptsI的消除：將驗(yàn)證正確的克隆在LB(含0.1 mmol/L IPTG，50 μg/L 卡納霉素)平板上劃線，在IPTG的誘導(dǎo)和得到單克隆。將單克隆分別點(diǎn)板于氯霉素和LB平板。氯霉素平板上不長，LB平板上生長的單克隆，即為消除pV4-del-ptsI供體質(zhì)粒的菌株(圖3-A右)，命名為YM-I001，質(zhì)粒消除效率達(dá)到100%(圖4-A右，表3)。

從YM-I001出發(fā)，按照敲除ptsI基因的方式，繼續(xù)敲除iclR基因。PCR驗(yàn)證(用iclR-YZ-up/iclR-YZ-down引物)4個克隆，顯示iclR基因均被敲除，其電泳條帶大小為750 bp(圖4-B左，泳道1～4)，未被敲除的大小是2 kb(圖4-B左，泳道5)。按照消除pV4供體質(zhì)粒的方式消除pV4-del-iclR，消除效率達(dá)到98%(圖4-B右，表3)，消除供體質(zhì)粒pV4-del-iclR的菌株命名為YM-I002。

從YM-I002出發(fā)，利用pV4-del-araBAD-ins-cad為的供體質(zhì)粒引入cad基因。整合后，用araBAD-YZ-up/cad-YZ-down200引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，cad基因整合了的電泳條帶大小為1.7 kb(圖4-C左，泳道1～7)，未被整合的對照無條帶(圖4-C左，泳道8)。按照消除pV4供體質(zhì)粒的方式消除pV4-del-araBAD-ins-cad，消除效率達(dá)到94%(圖4-C右，表3)，相應(yīng)的菌株命名為YM-I003，該菌株能產(chǎn)衣康酸1.5 g/L。

A：敲除ptsI基因及其供體質(zhì)粒的消除; B：敲除iclR基因及其供體質(zhì)粒的消除; C：整合cad基因及其供體質(zhì)粒的消除; M: DNA marker trans 2K plus

表3 供體質(zhì)粒消除效率及其消耗時間

3 小結(jié)

本研究優(yōu)化了雙質(zhì)粒CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)中的供體質(zhì)粒，優(yōu)化后的pV4系列供體質(zhì)粒不僅能在基因編輯過程中提供針對同源重組的供體DNA片段和提供針對目標(biāo)基因的N20-gRNA，而且能夠在基因編輯結(jié)束后，通過表達(dá)cat-N20-gRNA實(shí)現(xiàn)供體質(zhì)粒的自我消除，方便下一輪供體質(zhì)粒進(jìn)入實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的編輯。

將優(yōu)化后的雙質(zhì)粒CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)，應(yīng)用于大腸桿菌產(chǎn)衣康酸工程菌株的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了基因的連續(xù)編輯，成功敲除了ptsI基因、iclR基因，在araBAD基因位點(diǎn)整合了cad基因。衣康酸工程菌株的構(gòu)建在3周內(nèi)完成，該菌株的快速構(gòu)建，得益于編輯過程中pV4系列供體質(zhì)粒的自我剪切，pV4系列供體質(zhì)粒的消除過程需要的時間總計13～17 h(表3)。

本研究結(jié)果為大腸桿菌工程菌株的構(gòu)建提供了更為優(yōu)化的工具，提高了雙質(zhì)粒CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)連續(xù)進(jìn)行基因編輯的效率，有廣闊的應(yīng)用前景。