Ectoine高產(chǎn)菌株Halomonas sp. XH26的鑒定及紫外誘變選育

田 磊, 張 芳, 沈國平, 高 翔, 龍啟福, 朱德銳

(青海大學 醫(yī)學院 基礎醫(yī)學研究中心, 西寧 810016)

Ectoine(1, 4, 5, 6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidnecarboxylic acid, C6H10N2O2)即1, 4, 5, 6-四氫-2甲基-4-嘧啶羧酸，是一種氨基酸衍生物，廣泛存在于嗜鹽古菌、嗜鹽細菌、鹽藻及真菌等胞內(nèi)[1]。Ectoine是一種抵抗外界高鹽環(huán)境的有機相容性溶質(zhì)，具有增強酶活性、穩(wěn)定DNA結構及保護蛋白質(zhì)的功能[2]。國內(nèi)外諸多文獻報道，已將其廣泛地應用于消化道疾病、干眼綜合征、過敏性鼻炎、皮膚創(chuàng)傷與保健美容等生物醫(yī)學領域[3-4]，其研發(fā)產(chǎn)品涉及消化道藥物、滴眼液、鼻噴劑、皮膚創(chuàng)傷藥及新型生物化妝品等[5-6]。目前，Ectoine大規(guī)模生產(chǎn)主要以微生物發(fā)酵為主，模式菌株主要有鹽單胞菌屬(Halomonas)與色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)，如H.elongata(DSM 2581T、1A01717與BK-AG18)和C.salexigensDSM 3043T等[7-8]。相關研究主要集中于菌株優(yōu)選和發(fā)酵工藝與條件的優(yōu)化。Ectoine的發(fā)酵工藝主要包括實驗室條件下的單批次發(fā)酵(試管液體培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)與臺式發(fā)酵罐等)，中試或工業(yè)級大規(guī)模生產(chǎn)(分批發(fā)酵罐法、流加發(fā)酵罐法與細菌擠奶Bacterial milking)等，或采用不同發(fā)酵方式聯(lián)用，以提高Ectoine產(chǎn)量[9]。

針對Ectoine積聚菌株的研究，主要集中在野生菌株的分離篩選、基因工程菌株的構建(生物合成Pathway基因和ectABC操縱子等)、模式菌株代謝流量控制發(fā)酵(Metabolic overflow，包括Carbon-limited fed-batch cultures、Metabolic flux analysis與Metabolic flux distribution)及優(yōu)化[10-12]。然而，以上不同的研究方法，各具優(yōu)劣，其總體產(chǎn)量提高30%～79%[13-14]。參考其他微生物代謝產(chǎn)物的菌種改良研究，原始菌株的生產(chǎn)能力可通過物理(紫外誘變)或化學(硫酸二乙酯和甲基磺酸乙酯等)突變方式大幅度提高。紫外誘變[15](UV mutagenesis)是一種經(jīng)典微生物誘變方法，菌株對誘變因素極具敏感性，且正向突變率高，能有效提高生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量，然而國內(nèi)外暫無Ectoine菌株誘變研究的相關報道。至此，本研究以小柴旦鹽湖鹽單胞菌Halomonassp. XH26為研究對象，采用9輪紫外線循環(huán)誘變選育遺傳穩(wěn)定的Ectoine高產(chǎn)突變菌株，以期為Ectoine大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)提供新的菌源，提高Ectoine的發(fā)酵生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源與培養(yǎng)基

野生菌株Halomonassp. XH26來源于青海大學基礎醫(yī)學研究中心的保存菌株，該菌株分離于柴達木盆地小柴旦鹽湖。OSM分離培養(yǎng)基[1](g/L)：NaCl 50.0 g，MgSO4·7H2O 20.0 g，檸檬酸鈉3.0 g，KCl 2.0 g，CaCl20.2 g，細菌蛋白胨10.0 g，酵母抽提物2.0 g，調(diào)pH 7.5，固體培養(yǎng)基另加瓊脂15.0 g。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 60.0 g，MgSO4·7H2O 25.0 g，KCl 55.0 g，L-谷氨酸鈉6.5 g和酶水解酪素7.5 g，調(diào)pH 8。

1.1.2 主要試劑與設備

NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、檸檬酸鈉、酵母、L-谷氨酸鈉、酶水解酪素和NaOH等分析純(天津永大化學試劑公司)；乙腈(HPLC級, 美國Fisher scientific公司)；Ectoine 標準品(HPLC級 > 95%, 德國Fluka Analytical公司)；超凈工作臺(上海智城公司)；第三代變速組織研磨器(OSEY50型，北京天根公司)；低真空掃描電鏡(JSM-561ULV型, 日本電子光學公司)；高效液相色譜儀(HPLC1260型，美國安捷倫公司)；色譜柱(Merck-SeQuant ZIC-HILIC，150×4.6 mm，5 μm)；恒溫搖床(ZD-85，上海精達公司)；微孔過濾器(0.22 μm水系，天津亳津公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與菌懸液的制備

菌株活化。將Halomonassp. XH26菌株接種于5 mL OSM培養(yǎng)基中，160 r/min，35 ℃恒溫振蕩培12 h活化，測定OD600值，大量接種備用。菌懸液的制備：取上述對數(shù)生長期的菌液5 mL，3000 r/min 離心10 min，棄清液，加入0.9%的無菌生理鹽水振蕩洗滌3次，后重懸于生理鹽水中，調(diào)整菌懸液濃度約為108CFU/mL[16]。

1.2.2 產(chǎn)Ectoine菌種的鑒定

將菌株接種于OSM固體培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，革蘭染色，在光學顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，參照《微生物學實驗》《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》及《伯杰氏鑒定細菌學手冊》對菌株進行生長特性與生化鑒定[17]。16S rRNA基因測序分析由上海生工生物工程公司完成，運用BLAST搜索同源序列，通過軟件Mega v 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

1.2.3 細菌電鏡樣品的制備

細菌處理和固定。細菌過夜培養(yǎng)后，取2 mL菌液(OD600約1.20)，8000 r/min離心3 min，棄上清；加入500 μL PBS洗2～3次，3000 r/min離心3 min，棄上清；加入2.5%戊二醛，混勻，4 ℃過夜固定。乙醇梯度脫水：固定處理液，8000 r/min離心1 min，棄上清，PBS溶液清洗3次，按30%～90%濃度梯度脫水；每次加入乙醇脫水后靜置15 min，8000 r/min離心1 min后100%乙醇洗滌2次，條件同前；最后用乙酸異戊酯置換2次，每次20 min，最后一次3000 r/min離心3 min，棄上清；沉淀物經(jīng)-20 ℃、-40 ℃與-80 ℃分別冷凍6 h后，在-65 ℃低溫干燥箱中冷凍干燥12 h，粘樣電鏡檢測[19-20]。

1.2.4 紫外誘變

將108CFU/mL菌懸液稀釋為10-3、10-4、10-5與10-6濃度，各取5 mL稀釋液置于90 mm的培養(yǎng)皿中，放入無菌磁力攪拌子，后置于磁力攪拌器上，在紫外燈下(功率25 W，照射距離30 cm，提前預熱30 min)分別照射10～70 s(間隔10 s)。取照射后的菌懸液0.1 mL均勻涂布平板(每梯度3～5個)，以未經(jīng)照射的菌懸液為對照，后將平板置于35 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h計數(shù)致死率和正突變率。紫外誘變后選取菌落較大、長勢良好、菌落邊緣黏稠且不易拉絲的突變菌株，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，測定Ectoine產(chǎn)量。采用9輪循環(huán)紫外照射進行誘變，每輪誘變后連續(xù)培養(yǎng)3次，篩選Ectoine產(chǎn)量最高菌株進行下一輪誘變。正突變率(%)=正突變株數(shù)/誘變后菌落數(shù)×100%；致死率(%)=(對照CFU-處理CFU)/對照CFU×100%[21-23]。

1.2.5 細胞干重測定(CDW g/g)

將100 mL發(fā)酵液4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，棄上清，再加10 mL的生理鹽水快速洗滌，8000 r/min 離心5 min，棄上清，將沉淀放于70 ℃烘干箱至恒重，干燥后稱量，計算細胞干重(CDW g/g)。

1.2.6 Ectoine的提取

菌株發(fā)酵培養(yǎng)36 h后測OD600，12 000 r/min離心5 min，棄上清；加入99%的乙醇10 mL，用組織研磨器高速研磨3～4 min，12 000 r/min離心5 min，取出上清至10 mL燒杯中，放入60 ℃烘干箱中烘干4 h；再加入2 mL超純水，重溶Ectoine后經(jīng)0.22 μm水系微孔過濾器過濾，即為Ectoine提取液。

1.2.7 高效液相色譜(HPLC)檢測Ectoine含量

配制1.0 mg/mL的Ectoine標準品母液(間隔0.2 mg/mL)，通過高效液相色譜(HPLC)檢測Ectoine含量，采用高效峰面積和濃度制作標準曲線。HPLC檢測條件：乙腈為流動相，檢測波長210 nm，流速為1.0 mL/min，柱壓3.486～4.761 MPa，柱溫30 ℃，胞內(nèi)Ectoine抽提液上樣量10 μL[24-25]。

1.2.8 遺傳穩(wěn)定性

2 結果與分析

2.1 Halomonas sp.XH26菌體形態(tài)特征與同源性比對

Halomonassp.XH26菌株在OSM培養(yǎng)基上，菌落形態(tài)呈圓形(圖1-A)，大小適中，易粘連，乳白色，隆起，濕潤狀，邊緣規(guī)則，不透明，革蘭氏陽性菌(圖1-B)。電鏡下菌體形態(tài)呈長桿狀(圖1-C)，略帶彎曲，菌體的長度為(3～5)μm×(0.5～0.8)μm，兩端圓潤，無鞭毛。生理生化試驗結果如表1所示。利用NCBI Blast分析比對XH26的16S rRNA基因序列，構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。分析表明：菌株XH26位于鹽單胞菌屬進化分支單元，與嗜堿鹽單胞菌H.alkaliphila2B8N(JF710970)和美麗鹽單胞菌H.venustaDSM 4743(NR042069)類聚，進化趨近同源；XH26與H.alkaliphilaMAT-16(KC354706)、H.venustaB19b(JF710983)、H.alkaliphilaR4(KX495192)的相似性均為99%，進化高度同源，但在系統(tǒng)發(fā)育方向上，3者之間具有明顯的差異。由圖2可知，菌株XH26與HalomonascampaniensisLS21(CP007757)親緣關系近，結合上述的生理生化鑒定結果，可將菌株XH26鑒定為Halomonascampaniensis。

2.2 紫外誘變最佳誘變時間的確定

紫外線照射時間對菌株的致死率和正向突變率的關系如圖3所示。當紫外照射時間為50 s后菌株致死率達到80%以上，70 s以后菌株致死率達到了100%。隨紫外照射時間的延長，菌株的正突變率也在增加。由于短時間照射不能達到較穩(wěn)定的突變狀態(tài)[24]，按照誘變劑量選擇的一般原則[15]，致死率為70%～80%的劑量，菌株突變性可以保持在較穩(wěn)定的水平。當紫外線處理50 s時致死率為75%，至此本研究選取50 s為最佳誘變時間。

表1 Halomonas sp. XH26的生理生化特征

A：菌落形態(tài)；B：革蘭氏染色油鏡(×100)；C: 掃描電鏡(×10 000)，電壓15 kV，工作距離WD12 mm，Bar 1μm)

圖2 菌株XH26的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 紫外線照射時間對菌株的致死率和正突變率的影響

2.3 產(chǎn)物鑒定結果

采用高效液相色譜法(HPLC)繪制標準曲線(圖4-A)對突變菌株產(chǎn)物進行分析。Ectoine標準品檢測結果如圖4-B所示，選取突變菌株HU09-32提取Ectoine(圖4-C)。通過高效液相色譜圖比對，表明利用乙醇抽提突變菌株胞內(nèi)產(chǎn)物和Ectoine標準品的校正保留時間均為10 min，完全一致，應為同一物質(zhì)，確定突變菌株能夠積累Ectoine。

A：Ectoine標準曲線；B：標準品吸收峰型；C：突變菌株HU09-32提取Ectoine吸收峰型

2.4 紫外誘變突變菌株篩選

經(jīng)過9輪循環(huán)誘變，得到272株突變菌，最終篩選出7株Ectoine產(chǎn)量較高的突變菌株(表2)。由表2可知，誘變菌株HU09-6、HU09-12及HU09-71的Ectoine產(chǎn)量相當，分別為原始菌株的2.1、2.4及2.1倍，HU09-21、HU09-61與HU09-62菌株Ectoine產(chǎn)量分別為1154.29、1165.16與1202.98 mg/L，其中HU09-32菌株Ectoine產(chǎn)量最高，達到1351.09 mg/L，為原始菌株的2.9倍，具有顯著差異(P< 0.05)。因此，選取HU09-32菌株作為后期研究的目標菌株。

表2 紫外誘變突變菌株Ectoine產(chǎn)量

2.5 突變菌株穩(wěn)定性檢測

選取Ectoine產(chǎn)量在950 mg/L以上的7株突變型菌株：HU09-6、HU09-12、HU09-21、HU09-32、HU09-61、HU09-62與HU09-71進行連續(xù)培養(yǎng)，HPLC檢測Ectoine產(chǎn)量。結果分析(表3)表明：通過40 d連續(xù)培養(yǎng)(接種2 d/次)后，7株突變型菌株Ectoine產(chǎn)量均未出現(xiàn)明顯降低，每組實驗結果無明顯差異，表現(xiàn)出一定的遺傳穩(wěn)定性，且均明顯優(yōu)于原始菌株。HU09-12、HU09-21與HU09-61穩(wěn)定性較好，Ectoine產(chǎn)量保持在1000 mg/L左右。HU09-6和HU09-71菌株Ectoine產(chǎn)量較穩(wěn)定，但是在30 d后出現(xiàn)輕度降低的趨勢。HU09-32和HU09-62的穩(wěn)定性最好，Ectoine產(chǎn)量均未低于1200 mg/L，具有發(fā)酵生產(chǎn)應用潛力。

表3 突變株遺傳穩(wěn)定性的測定

3 討論與結論

Ectoine工業(yè)生產(chǎn)的關鍵問題在于菌株的分離與選育，目前研究主要集中在野生菌株的分離篩選、發(fā)酵條件的優(yōu)化及構建基因工程菌株[10-11]。周月慧等[27]單批次搖瓶發(fā)酵HalomonasvenustaSL 21(48 h)，誘導生成的Ectoine產(chǎn)量為285.1 mg/L。張曉梅等[28]實驗室搖瓶發(fā)酵Halorubrumaidingense菌株，顯示Ectoine的最大產(chǎn)量為321.28 mg/L。Becker等[29]將伸長鹽單胞菌(H.elongata)的Ectoine合成基因簇ectABC整合到谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)的基因組，構建基因工程菌，經(jīng)分批補料發(fā)酵Ectoine的產(chǎn)率為6.7 g/L·d。對比以上研究，Ectoine產(chǎn)量均在不同程度上獲得提升，但是增長有限。目前，國內(nèi)外暫無對產(chǎn)Ectoine菌株進行物理或化學方法誘變處理，來獲得高產(chǎn)Ectoine突變菌株的研究報道。

基于紫外誘變是獲得細菌突變體的經(jīng)典方法，其誘變效應為引起細菌DNA結構或堿基序列的變化，導致基因發(fā)生突變[30-31]。目前，該方法廣泛用于不同微生物發(fā)酵產(chǎn)物的研究中。張云野等[32]對休哈塔假絲酵母(Candidaalbicans)HDYXHT-01進行紫外誘變，獲得的突變株乙醇產(chǎn)量提高3.03%～12.88%。劉俊梅等[21]采用紫外線和硫酸二乙酯相結合的誘變方法對P.koreensisPK3菌株進行復合誘變，獲得一株高產(chǎn)PHB突變菌株，PHB產(chǎn)量達到15.94 g/L，較原始菌株提高了2.61倍。田連生和陳秀清[22]通過紫外線和甲基磺酸乙酯(EMs)對野生菌株XN-3進行復合誘變，選育突變菌株UH-2-4，其絮凝率達到96.8%，比出發(fā)菌株提高了25.1%。本研究通過比較紫外線處理時間對Halomonassp. XH26菌株與Ectoine產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)紫外線處理50 s，能有效提高Ectoine的產(chǎn)量；同時，可以保持突變株胞內(nèi)Ectoine產(chǎn)量的穩(wěn)定。經(jīng)9輪循環(huán)紫外誘變篩選，獲得7株遺傳穩(wěn)定性較好的突變株，Ectoine產(chǎn)量均達到出發(fā)菌株2倍以上，其中HU09-32 Ectoine產(chǎn)量最高,為1351.09 mg/L±17.69 mg/L，是原始菌株Ectoine產(chǎn)量(Halomonassp. XH26發(fā)酵條件優(yōu)化后，456.82 mg/L±15.72 mg/L，CDW 0.71 g/g±0.04 g/g)的2.9倍。

本次研究采取多輪紫外循環(huán)誘變，篩選獲得Ectoine高產(chǎn)突變菌株(200%以上)。經(jīng)過連續(xù)培養(yǎng)(40 d)，其Ectoine的產(chǎn)量表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，顯示出很好的生產(chǎn)和應用前景。但實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著誘變代數(shù)的增加，誘變菌株亦表現(xiàn)出生長速度降低、Ectoine產(chǎn)量減少及菌落形態(tài)改變等現(xiàn)象。在本實驗中，獲得7株突變株的Ectoine產(chǎn)量穩(wěn)定，沒有回復親本菌株的跡象，明顯優(yōu)于原始菌株。后續(xù)我們將會在分子水平上對突變菌株與原始菌株產(chǎn)Ectoine基因進行探究，為進一步提升菌株性能提供可靠的實驗依據(jù)與實驗菌株。