常見食品及調味品中嘌呤類組分含量分析及分布規(guī)律

丁玉庭，張靜，周緒霞，趙培城

1(浙江工業(yè)大學 食品科學與工程學院，浙江 杭州，310014)2(國家遠洋水產(chǎn)品加工技術研發(fā)分中心(杭州)，浙江 杭州，310014)

嘌呤是由1個嘧啶環(huán)和1個咪唑環(huán)稠和而成的一種生物堿類物質，以嘌呤核苷酸形式參與人體代謝，起到能量供應、組成輔酶等重要作用。嘌呤在人體內經(jīng)過一系列代謝變化后，最終生成尿酸，而尿酸合成增加或排除減少會引發(fā)高尿酸血癥[1]。食物攝入是嘌呤的主要來源之一，CHOI等[2]研究發(fā)現(xiàn)，較高的肉類和海鮮消費量與較高的血清尿酸水平有關；OMOLE等[3]研究表明，高尿酸血癥極有可能會引起痛風，對心血管疾病產(chǎn)生不良影響，因此健康的生活方式和飲食結構對緩解痛風和高尿酸血癥有重要作用[4]。在日本，高尿酸血癥患者每日嘌呤攝入量限制為400 mg[5]；急性和慢性痛風患者每天嘌呤攝入量應控制在150 mg以下[6]。對中國居民每日膳食嘌呤平均攝入量的評估表明，標準人(18 歲輕體力活動男子)每日攝入嘌呤總量呈逐年增加趨勢，2002年每人每日年達到319 mg，尤其是動物性食物的嘌呤攝入量逐年增加[7]?？梢?，我國現(xiàn)代飲食習慣中嘌呤含量較高的食品逐漸占主體地位，讓人們了解各類食品的嘌呤含量數(shù)據(jù)極為重要。但是當前嘌呤含量的數(shù)據(jù)尚不完善且相差較大，現(xiàn)有的各項數(shù)據(jù)來源不可靠[8]，且檢測方法不一致；特別是調味品中嘌呤含量數(shù)據(jù)十分匱乏，近年來，調味品市場銷量不斷創(chuàng)新高，而高尿酸血癥發(fā)病率不斷升高[9]。

本文擬建立一種基于反相高效液相色譜(reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)能夠準確檢測常見代表性食品以及調味品中嘌呤類組分及其含量的方法，并通過該方法對代表性食品，包括水產(chǎn)品、畜禽肉類、豆制品、食用菌、水果以及調味品中嘌呤類物質的組成及其含量進行檢測，并對其含量規(guī)律進行分析，為居民飲食結構的合理安排提供理論依據(jù)和參考建議。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞肉、鴨肉、五花肉、牛肉、羊肉、豬肝等畜禽肉類，草魚、鯽魚、扇貝等水產(chǎn)品，大豆、豆腐等豆制品，香菇等食用菌，海底撈醬、海鮮醬、沙茶醬、雞鮮調味料、雞精、牛肉醬、燉肉料、濃湯寶、黃豆醬、番茄醬等各類調味品以及新鮮蔬菜、水果，均購自大型超市。

腺嘌呤(純度≥99.5%)、鳥嘌呤(純度≥99.0%)、黃嘌呤(純度≥99.5%)、次黃嘌呤(純度≥99.0%)，Aladdin公司；5′-肌苷酸二鈉(disodium 5′-inosinate,IMP)、5′-鳥苷酸二鈉(disodium 5′-guanosine monophosphate,GMP)(食品級)，希杰(聊城)生物科技有限公司；KH2PO4、H3PO4、KOH、NaOH、高氯酸等均為分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；甲醇(色譜純)，德國 MERCK 公司。

E2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司；RE-2000A型真空旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Allegra 64R高速臺式冷凍離心機，美國Beckman Coulter有限公司；PHS-3C型數(shù)顯酸度計，上海精科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 嘌呤標準溶液的制備

分別準確稱取4種嘌呤標準品各0.100 g，加入5 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，促進溶解，再用超純水定容至1 000 mL，配制成0.1 g/L嘌呤標準溶液，放入4 ℃冰箱保存。

1.2.2 樣品前處理

采用王靜瑩等[10]的酸水解法，并作適當調整。每份樣品制備3份平行樣：將食品、調味品等樣品磨碎，稱取200.00 mg放入20 mL具塞試管，加入體積分數(shù)10%高氯酸3 mL，置于沸水浴中水解60 min，取出后迅速冰浴冷卻。水解液用1 mol/L KOH溶液調節(jié)pH至3.8，定容至5.0 mL，3 000 r/min離心30 min，取上清液用0.45 μm濾膜過濾后置于4 ℃冰箱保存待用。

1.2.3 嘌呤類組分檢測方法優(yōu)化

采用RP-HPLC的方法測定嘌呤類組分含量。由于流動相pH對檢測結果影響較大，本實驗分別設定pH為3.6、3.8、4.0的0.02 mol/LKH2PO4緩沖液作為流動相進行對比試驗，以得到優(yōu)化的HPLC測定條件。采用色譜柱：Agilent XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量20 μL；紫外波長254 nm。

2 結果與分析

2.1 嘌呤類物質HPLC檢測方法優(yōu)化

2.1.1 HPLC檢測條件優(yōu)化

通過RP-HPLC法檢測嘌呤類組分含量時，Agilent XDB-C18柱可直接進樣分析水溶性嘌呤樣品，而選擇254 nm作為紫外波長，是因為4種嘌呤都存在共軛雙鍵，在紫外區(qū)220～300 nm區(qū)間內存在較強的吸收峰。另外，流動相pH值對嘌呤的分離影響最大。劉桂英等[11-12]用HPLC法測定不同豆類、食用菌類的嘌呤含量，選用pH 4.0的0.007 mol/L KH2PO4緩沖液為流動相；凌云等[13]通過HPLC法檢測肉類食品中嘌呤含量時，分別采用了pH 3.62和pH 3.8的0.02 mol/L KH2PO4緩沖液作為流動相;曲欣[14]對比了0.02 mol/L KH2PO4緩沖液作為流動相,pH分別為3.6、3.8、4.0時的液相色譜圖。本實驗采用0.02 mol/L KH2PO4緩沖液作為流動相，對比pH分別為3.6、3.8、4.0時嘌呤混標的分離情況，最終選擇pH 3.8的緩沖液作為流動相，如圖1所示，得到了分離效果較好的4種嘌呤獨立的峰，出峰順序依次為鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤。

1-鳥嘌呤 2-次黃嘌呤 3-黃嘌呤 4-腺嘌呤(下同)；流動相pH為3.8圖1 四種嘌呤標準品HPLC圖Fig.1 HPLC chart of four kinds of purines standard solution

2.1.2 HPLC檢測方法的線性范圍與精密度

配制4種嘌呤混標溶液，依次按照質量濃度1、5、10、25、50、80、100 mg/L梯度進樣，在1.2.3色譜條件下(流動相pH 3.8)分析測定，每個質量濃度設定3份平行樣，將峰面積的平均值與嘌呤混標的質量濃度相對應，得到圖譜如表1所示，計算得到線性回歸方程。相關系數(shù)在0.999 6～0.999 8，相對標準偏差在0.97%～1.69%之間，以3倍信噪比(s/n=3)和10倍信噪比(s/n=10)得到方法的檢出限和定量限分別為0.06～0.21 mg/L和0.25～0.72 mg/L。由數(shù)據(jù)可知，此方法精密度較高，重現(xiàn)性較好，實驗結果可靠性較高。

2.1.3 HPLC檢測方法的回收率研究

用豬肉樣品進行加標回收測定回收率，樣品中分別添加3個水平的嘌呤標液，每個樣品設定6份平行樣，計算回收率和相對標準偏差。實驗結果如表2所示，回收率控制在79.85%～102.60%，在閾值范圍內，能滿足定量分析的要求。

表1 四種嘌呤標準品回歸方程Table 1 Results of linear equation and linear relation

表2 加標回收試驗結果Table 2 Results of recovery

2.2 代表性食品原料中嘌呤類組分測定及規(guī)律研究

將各類食品樣品用1.2.2的方法進行處理，再按照優(yōu)化的1.2.3的方法進樣檢測，得到常見代表性食品原料中嘌呤含量，結果分析如圖2～圖13所示。

2.2.1 水產(chǎn)品中嘌呤類組分含量

圖2～圖4為所測部分水產(chǎn)品中4種嘌呤組分含量的高效液相色譜圖?？梢姡a(chǎn)品中4種嘌呤分離度較好。

圖2 草魚嘌呤HPLC圖Fig.2 HPLC chart of four kinds of purines in grass carp

圖3 海蝦嘌呤HPLC圖Fig.3 HPLC chart of four kinds of purines in sea shrimp

圖4 蟶子嘌呤HPLC圖Fig.4 HPLC chart of four kinds of purines in razor clam

所測水產(chǎn)品中各嘌呤組分含量對比如圖5所示，水產(chǎn)品中總嘌呤含量在147.46～433.15 mg/100 g，屬于高嘌呤食物；不同種類水產(chǎn)品其嘌呤組分差異較大，草魚、鯽魚等總嘌呤含量分布在147.46～168.12 mg/100 g，且次黃嘌呤的含量占總嘌呤的60%以上，這與潘洪志等[15]和KANEKO等[5]研究結果一致。花蛤、扇貝等貝類中總嘌呤含量在160.36～288.85 mg/100 g，腺嘌呤含量較高，可占總嘌呤含量的34.04%～83.96%；海蝦的總嘌呤含量大于400 mg/100 g，且顯著高于魚類和貝類。

圖5 水產(chǎn)品中各嘌呤組分含量Fig.5 Content of purines in aquatic products

2.2.2 畜禽肉類中嘌呤類組分含量

圖6～圖8為所測部分畜禽肉類中4種嘌呤組分含量的高效液相色譜圖。大部分畜禽肉類的4種嘌呤均能較好地分離。

圖6 鴨肉嘌呤HPLC圖Fig.6 HPLC chart of four kinds of purines in duck

圖7 豬肉嘌呤HPLC圖Fig.7 HPLC chart of four kinds of purines in pork

圖8 豬肝嘌呤HPLC圖Fig.8 HPLC chart of four kinds of purines in pork liver

由圖9可知，畜禽肉類總嘌呤含量在106.09～286.06 mg/100 g，大部分屬于中等嘌呤食物，其中內臟豬肝的嘌呤組含量顯著高肉種嘌呤組含量，嘌呤組分中以次黃嘌呤含量最多，占總嘌呤的52.05%～70.20%，而黃嘌呤含量最少。這與楊海斌[16]研究結果一致。豬肝中總嘌呤含量達到286.06 mg/100 g，次黃嘌呤占總嘌呤的53.55%，這與潘洪志等[15]檢測發(fā)現(xiàn)動物內臟嘌呤含量高于其他食品，肉和肉制品中嘌呤含量低于水產(chǎn)品的觀點吻合。在不同畜肉類中，豬肉的總嘌呤含量為125.51 mg/100 g，牛羊肉分別為106.09、107.92 mg/100 g，豬肉高于牛羊肉，而牛羊肉之間差別不大。雞鴨肉嘌呤含量較楊海斌[16]實驗結果測得的低，豬肉嘌呤含量較凌云等[13]測得的結果要高，這可能與不同品種、不同部位、不同生長期和不同飼養(yǎng)方式有關。ZHENG等[17]研究發(fā)現(xiàn)，純種豬肉的總嘌呤含量較低，低嘌呤飼料喂養(yǎng)也會影響豬肉中的嘌呤含量，且豬肉肌內脂肪與嘌呤含量呈負相關。

圖9 畜禽肉類中各嘌呤組分含量Fig.9 Content of purines in livestock and poultry meat

2.2.3 植物性食品中嘌呤類組分含量

圖10～圖12為植物性食品中4種嘌呤組分含量的高效液相色譜圖。

圖10 大豆嘌呤HPLC圖Fig.10 HPLC chart of four kinds of purines in soybean

圖11 干香菇嘌呤HPLC圖Fig.11 HPLC chart of four kinds of purines in dry mushrooms

圖12 鮮香菇嘌呤HPLC圖Fig.12 HPLC chart of four kinds of purines in freshmushrooms

植物性食品中嘌呤含量普遍低于動物性食物，且不同種類植物性食品相差較大。劉桂英等[12]發(fā)現(xiàn)不同菌類嘌呤含量相差較大，在39.27～323.77 mg/100 g不等。毛玉濤等[18]發(fā)現(xiàn)植物性食物嘌呤含量較低，尤其常見蔬菜的嘌呤含量都很低。由圖13可知，豆腐、新鮮食用菌、蔬菜、水果的嘌呤含量均較低，而豆類、干制食用菌中嘌呤含量較高，超過150 mg/100 g，但因其干物質含量高，故不能被列為高嘌呤食物；在植物性食品的嘌呤組分中，腺嘌呤和鳥嘌呤含量較高，占總嘌呤含量60%以上，而次黃嘌呤含量較低。

圖13 植物性食品中各嘌呤組分含量Fig.13 Content of purines in plant food

2.3 典型調味品中嘌呤類組分及其分布規(guī)律研究

2.3.1 典型調味品中嘌呤含量及分布規(guī)律

基于現(xiàn)代飲食中人們對食品風味追求的不斷強化，調味料已成為人們熱衷的烹飪助手，其中，5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉(I+G)各50%混合物更是食品增鮮的必備添加劑，已在各類調味食品中廣泛使用。由于核苷酸在體內可代謝生成次黃嘌呤和鳥嘌呤，因此，會增加人體的嘌呤攝入量。圖14～圖16為部分調味料中嘌呤類組分的液相色譜圖。

圖14 雞鮮調味料嘌呤HPLC圖Fig.14 HPLC chart of four kinds of purines in fresh chickenseasoning

圖15 雞精嘌呤HPLC圖Fig.15 HPLC chart of four kinds of purines in chickenessence

圖16 濃湯寶嘌呤HPLC圖Fig.16 HPLC chart of four kinds of purines in condensed soup

圖17為市售10種典型調味品的嘌呤組分及其含量。

圖17 調味品中各嘌呤組分含量Fig.17 Content of purines in condiments

結果表明，調味品的嘌呤含量普遍較高，尤以水分含量低的雞精和雞鮮粉基類調味品的嘌呤含量居高，總嘌呤含量大于500 mg/100 g，這與張萍等[19]的研究結果一致；在醬類調味品中，牛肉醬等的總嘌呤含量在100 mg/100 g左右，以次黃嘌呤為主，約占總嘌呤的42%，屬于中等嘌呤食物；海鮮醬和沙茶醬中的總嘌呤含量大于150 mg/100 g，以腺嘌呤為多，占總嘌呤的45%以上；發(fā)酵黃豆醬中總嘌呤含量約為120 mg/100 g，介于牛肉醬和海鮮醬之間。另外，燉肉料、番茄醬的嘌呤含量低于50 mg/100 g，燉肉料的原材料主要以砂仁、肉寇、茴香、肉桂、陳皮、山楂等植物類香辛料為主，番茄醬的主要原材料為番茄，所以這類調味品的嘌呤含量普遍較低。

2.3.2 調味品I+G中嘌呤含量及分布規(guī)律

雞精和雞鮮調味料是繼超鮮味精后廣泛流行使用的復合調味品，屬特高嘌呤類食品輔料，表3為市售3種品牌的雞精和雞鮮調味料的嘌呤組分含量比較。

表3 富I+G呈味核苷酸的調味品中嘌呤組分比較 單位：mg/100 g

由表3可知，I+G增鮮劑的組成僅是次黃嘌呤和鳥嘌呤，IMP的呈味特征為雞肉鮮味，鮮度約為味精的40倍；GMP的呈味特征為鮮菇鮮味，鮮度約為味精的160倍。在3種品牌的雞精和雞鮮調味料中，除了次黃嘌呤和鳥嘌呤外，尚含9%～18%的腺嘌呤和黃嘌呤成分，這是由于雞精和雞鮮調味料中強化添加了I+G和酵母抽提物等呈味核苷酸類物質，導致鳥嘌呤和次黃嘌呤含量偏高的緣故。在高嘌呤組分中，次黃嘌呤已被證明對血清尿酸濃度影響均大于鳥嘌呤、腺嘌呤和黃嘌呤等3種嘌呤[5]，因此大劑量添加調味料會使人體攝入更多次黃嘌呤成分，增加健康風險。

另外，尚需特別注意的是，未經(jīng)熱處理的生鮮食品由于存在降解呈味核苷酸二鈉的磷酸酯酶，導致失去I+G的鮮味[20]，因此，建議生鮮食品在加入調味品前需首先進行85 ℃以上熱處理鈍化酶以保障鮮美味，不然，既得不到相應的鮮美味，還會造成人體攝入更多的由磷酸酯酶分解產(chǎn)生的嘌呤物質。

3 結論

本文建立了基于RP-HPLC的食品中腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤的含量測定方法，并對典型食品及常見調味料的4種嘌呤成分含量及分布規(guī)律進行了分析研究。所檢測食品中，總嘌呤含量由高到低依次為水產(chǎn)品>畜禽肉類>植物性食品，其中水產(chǎn)品中為147.46～433.15 mg/100 g，屬于高嘌呤類食物；畜禽肉類中為106.09～286.06 mg/100 g，大部分屬于中嘌呤類食物，而內臟豬肝的總嘌呤含量>280 mg/100 g；植物性食品總嘌呤含量大部分<50 mg/100 g，屬于低嘌呤類食物。不同種類調味品中嘌呤組分差異較大，其中雞精、雞鮮調味料嘌呤含量高于500 mg/100 g。排除個體健康狀況等因素影響，控制飲食中嘌呤的攝入是預防高尿酸血癥的主要途徑。因此，日常飲食應注意高嘌呤類物質的攝入，尤其要減少火鍋、燒烤和飯店等重口味、高熱量、高嘌呤的餐飲攝入，高尿酸血癥患者更應控制水產(chǎn)品、肉類、動物內臟等高嘌呤食物的攝入量，通過飲食控制有效降低高尿酸血癥和痛風的潛在健康風險。