谷氨酰胺轉氨酶活化蛋白酶在大腸桿菌中的表達及性質研究

高慧，劉松*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

谷氨酰胺轉氨酶(EC 2.3.2.13，transglutaminase,TGase),能催化蛋白質肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基(?；w)轉移至賴氨酸殘基的ε-氨基(?；荏w)，形成ε-(γ-谷氨?；?賴氨酸共價鍵，導致蛋白質分子發(fā)生交聯[1]。目前，TGase已被廣泛應用于肉制品、乳制品和豆制品等蛋白類食品的質構改良[2]。隨著對其催化本質認識的加深，TGase的應用開始向生物制藥[3]、制革、紡織[4]及生物技術[5]等多個非食品領域拓展。1989年，日本天野公司首次從土壤中分離了1株能夠分泌TGase的茂源鏈霉菌(Streptomycesmobaraensis)[6]。與其他來源的TGase相比，微生物發(fā)酵生產的TGase具有非Ca2+依賴性的特點，且生產周期短，成本優(yōu)勢明顯。隨著應用領域的拓展，鏈霉菌TGase的產量及酶學性質(底物特異性及熱穩(wěn)定性)的研究逐漸限制了對它的應用需求。構建高產TGase的基因工程菌，并進行酶學性質改造成為相關領域的研究熱點。

鏈霉菌TGase是一種胞外酶，在野生菌中以無活性的酶原(pro-TGase)形式分泌，pro-TGase被內源的蛋白酶切除N端酶原區(qū)后，轉化成活性TGase。由于N端酶原區(qū)對TGase的正確折疊及分泌有重要影響[7-9]，通常其在異源宿主中需以pro-TGase形式表達。值得注意的是，細菌和真菌異源表達宿主通常缺少能專一切割pro-TGase酶原區(qū)的蛋白酶。因此，如何將pro-TGase高效轉化為活性TGase成為其異源表達的關鍵。目前，主要有3種策略獲得活性重組TGase：(1)共表達pro-TGase與特異性蛋白酶(SAM-P45[10]或人鼻病毒3C蛋白酶[11])；(2)共表達酶原區(qū)與TGase[8,12-13]；(3)僅表達pro-TGase，體外添加活化蛋白酶[14]。由于共表達蛋白酶可以對TGase的持續(xù)降解[10]或缺少共價連接的酶原區(qū)促進其分泌[12]，該策略獲得的TGase表達量(16.30 U/mL)[15]仍遠低于僅表達pro-TGase獲得的(51.1 U/mL)[14]。因此，僅表達pro-TGase再體外添加蛋白酶活化的策略，對于制備活性TGase仍具有產量和成本優(yōu)勢。

目前，用于切割N端酶原區(qū)使pro-TGase活化的蛋白酶可以從產TGase的野生菌中分離(如S.mobaraensis金屬蛋白酶TAMEP)[16-17]或其他鏈霉菌中提取(如Streptomycesalbogriseolus分泌的SAM-P20、SAM-P26及SAM-P45等)[18]。此外，一系列商品化的蛋白酶同樣能活化pro-TGase，如dispase、中性蛋白酶和胰蛋白酶等[19]。與其他的蛋白酶相比，S.mobaraensis來源的TAMEP能夠精準地切割pro-TGase的N端酶原區(qū)，活化效率更高且不會對活化后的TGase進行持續(xù)降解[20]。研究發(fā)現，S.mobaraensis來源TAMEP屬M4蛋白酶，在野生菌中僅有少量分泌至胞外，且活性受到鏈霉菌、枯草桿菌蛋白酶抑制劑的抑制[16,20-21]。最近，S.mobaraensisTAMEP被成功表達于大腸桿菌，但僅存在于細胞周質空間，并不利于其大規(guī)模發(fā)酵制備[20]?；诖?，實現TAMEP高效分泌表達將有助于降低重組pro-TGase的活化成本，提高TGase生產效率。

本研究將來源于S.mobaraensis的TAMEP表達于大腸桿菌，通過信號肽類型優(yōu)化、信號肽N端密碼子同義替換及誘導條件優(yōu)化，實現了TAMEP的高效分泌，并分析了其酶學性質及對pro-TGase的活化效率。研究結果將有助于TAMEP的規(guī)?；苽洹?/p>

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株與質粒：表達質粒pET-22b(+)、大腸桿菌EscherichiacoliJM109和E.coliBL21(DE3)由本實驗室保存。產S.mobaraensispro-TGase的生產菌Yarrowialipolytica/pINA1297/TGase由本實驗前期構建[22]。編碼S.mobaraensisTAMEP及天然信號肽TSP基因[20]的質粒pUC18/TSP-TAMEP由上海生工合成。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物 5，胰蛋白胨10，NaCl 10。TB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 12，酵母提取物 24，K2HPO4·3H2O 16.37，KH2PO42.31，甘油 5。Y.lipolytica發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油 15，酵母膏 20，NH4Cl 2.64，KH2PO40.32，MgSO40.25，維生素B13.34×10-4，調pH至8.0。YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20。LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基在接種前需加入終質量濃度為50 μg/mL的氨芐青霉素。

酶、試劑、引物和DNA測序：限制性內切酶、DNA聚合酶購自Takara公司。dispase、GSH、質粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒和抗生素購自上海生工公司。Z-Gln-Gly-OH、L-谷氨酸-γ-單羥肟酸、組氨酸標簽蛋白抗體和顯色劑購自賽默飛公司。BCA蛋白濃度檢測試劑盒和SDS-PAGE試劑盒購于碧云天公司。引物構建、DNA測序由上海生工公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 TAMEP表達質粒的構建與轉化

以pUC18/TAMEP為模板，分別用引物對TSPTAMEP1/TAMEP2和TAMEP1/TAMEP2進行PCR擴增，得到片段TSP-TAMEP(天然信號肽TSP基因+TAMEP基因)和TAMEP。PCR反應條件為： 98 ℃預變性90 s；隨后進行30個循環(huán)擴增(98 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s)；最后72 ℃保溫5 min。將TSP-TAMEP和TAMEP分別克隆至pET-22b(+)的NdeI-XhoI和NcoI-XhoI酶切位點，得到表達載體pET22b-TSP-TAMEP和pET22b-pelB-TAMEP。將所得表達載體轉化E.coliBL21(DE3)，得到重組菌E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)和E.coliBL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)。質粒構建相關引物見表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 優(yōu)化TAMEP信號肽N端密碼子同義隨機替換

以Mut-A1、Mut-A2、Mut-A3、Mut-A4、Mut-A5、Mut-A6、Mut-A7、Mut-A8為上游引物，以Mut-B為下游引物，對pET22b-TSP-TAMEP進行PCR擴增，在TAMEP信號肽TSP的 N端前10個氨基編碼基因中隨機引入同義密碼子。PCR反應條件為： 98 ℃預變性90 s；隨后進行30個循環(huán)擴增(98 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min)；最后72 ℃保溫5 min。PCR產物混合，并經DpnI處理后轉化，轉化后涂布氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板。挑取轉化子至含LB培養(yǎng)基的96深孔板中培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)8 h；轉接裝有TB培養(yǎng)基的96深孔板，37 ℃培養(yǎng)2 h，加入終濃度10 μmol/L IPTG，20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)40 h。將高產轉化子轉接搖瓶培養(yǎng)復篩。

1.2.3 重組菌發(fā)酵優(yōu)化

重組大腸桿菌發(fā)酵：取TAMEP生產菌液100 μL接入LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)10 h轉接至TB培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)；當菌體OD600達到一定值(0.5～3.0)時，加入一定量的IPTG(0～200 μmol/L)，同時降溫培養(yǎng)(16～30 ℃)培養(yǎng)40 h；為提高TAMEP胞外表達水平，分別添加2～10 g/L的甘氨酸、葡萄糖或體積分數為0.2%～1.0%乙醇。各培養(yǎng)基使用前添加終質量濃度50 μg/mL的氨芐青霉素。

重組Y.lipolytica發(fā)酵：將pro-TGase生產菌液接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)24 h；將種子液以10%的接種量轉接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃搖瓶培養(yǎng)120 h。

1.2.4 蛋白質分離純化

采用鎳柱對TAMEP及pro-TGase進行純化。重組菌發(fā)酵上清液經0.22 μmol/L膜過濾制成上樣樣品。將樣品注入經結合緩沖液平衡的鎳柱，并用結合緩沖液洗去未結合蛋白；隨后以0～500 mmol/L咪唑溶液進行梯度洗脫，收集含有TAMEP或TGase催化活性的部分(pro-TGase樣品經dispase活化)。所得純化樣品經脫鹽柱去除鹽離子。

1.2.5 TAMEP酶學性質檢測

最適反應溫度：在反應溫度為20～80 ℃測定TAMEP活性，以所測得的最高酶活力為100%，計算其他反應溫度下的相對酶活力。

最適反應pH：測定pH為5～10條件下TAMEP活性(pH 5：50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；pH 6～8：50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液；pH 9～10：50 mmol/L甘氨酸-NaOH緩沖液)，以所測得的最高活性為100%，計算其他反應pH下的相對酶活力。

熱穩(wěn)定性：將TAMEP分別于30～60 ℃下孵育0～60 min后，冰水浴5 min并測定其催化活性，未經熱處理的酶活力設為100%，計算其他條件下的相對酶活力。

pH穩(wěn)定性：將TAMEP用pH為5～10緩沖液稀釋相同倍數，于30 ℃水浴中孵育60 min測定酶活力，以測得最高酶活力為100%，計算其他pH下孵育的相對酶活力。

1.2.6 pro-TGase活化分析

將純化的pro-TGase與不同濃度的TAMEP溶液混合均勻，于37 ℃恒溫30 min。在該反應體系中，pro-TGase濃度為6.91 μmol/L，TAMEP濃度分別為0.133、0.066、0.033和0.017 μmol/L。反應開始后，每間隔10 min取樣50 μL，進行TGase活力測定；同時取樣10 μL與SDS-PAGE電泳上樣緩沖液混合于90 ℃加熱10 min后進電泳分析。

1.2.7 酶活力檢測

按照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中福林法測蛋白酶活性方法測定TAMEP酶活力。1 U TAMEP酶活力定義為40 ℃下每1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸的酶量。以用α-N-CBZ-Gln-Gly和鹽酸羥胺為作用底物測定TGase酶活力[7]。1 U TGase酶活力定義為37 ℃每1 min催化生成1 μmolL-谷氨酸-γ-單羥肟酸的酶量。

1.2.8 蛋白質分析

使用BCA蛋白濃度檢測和采用碧云天試劑盒制備SDS-PAGE電泳凝膠，具體操作參考產品說明書。使用濃縮膠質量濃度為50 g/L，分離膠質量濃度為120 g/L，以質量濃度1 g/L考馬斯亮藍R-250進行染色。使用His-tag標簽抗體進行Western blot，具體方法參考前期工作[23]。

2 結果與分析

2.1 信號肽來源優(yōu)化提高TAMEP在E. coli中的分泌表達

在E.coli中，融合于N端的信號肽可介導蛋白質分泌[24]。因此，分別將TAMEP天然信號肽[20]和大腸桿菌pelB信號肽融合至TAMEP的N端，構建得到表達質粒pET22b-TSP-TAMEP和pET22b-pelB-TAMEP(圖1)。轉化至E.coliBL21(DE3)分別得到重組菌E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)和E.coliBL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)。

圖1 表達質粒示意圖Fig.1 The scheme of expression plasmids

將E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)、E.coliBL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)及對照菌E.coliBL21(DE3)(pET-22b(+))于TB培養(yǎng)基中進行誘導表達。誘導溫度、誘導起始菌體濃度(OD600)、IPTG濃度和誘導時間，分別為20 ℃、0.8、100 μmol/L和40 h。如圖2-a所示，使用TAMEP天然信號肽的重組菌胞外蛋白酶活力達到20.8 U/mL，較pelB信號肽條件下酶活力提高92.6%；由于存在一定量的內源蛋白酶，對照菌仍能檢測到一定的蛋白酶活力。由于胞外蛋白酶條帶較多，TAMEP的條帶在SDS-PAGE電泳圖中并不清晰(圖2-b)。Western Blot分析結果顯示，在E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)、E.coliBL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)發(fā)酵上清液中均能檢測到條帶，且與TAMEP理論分子質量56.4 kDa接近(圖2-c)。對照E.coliBL21(DE3)(pET-22b(+))樣品，未能檢測到相同條帶(圖2-c)。上述結果表明，TAMEP天然信號肽能有效介導TAMEP在E.coliBL21(DE3)中的分泌，且性能優(yōu)于E.coli內源信號肽pelB。

a-重組菌胞外TAMEP酶活力；b-重組菌胞外SDS-PAGE電泳；c-重組菌胞外Western BlotM-蛋白質標準分子質量；1-E. coli BL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)；2-E. coli BL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)；3-E. coli BL21(DE3)(pET-22b(+))圖2 分泌信號肽類型對TAMEP表達的影響Fig.2 Type of signal peptide on the expression of TAMEP注：TAMEP位置用箭頭標出

2.2 信號肽N端密碼子同義突變提高TAMEP在E. coli中的表達

研究表明，蛋白質N端編碼區(qū)基因序列對其表達效率有重要影響，但確切的機制尚不清楚[25-26]。為進一步提高TAMEP在E.coli中的表達，基于pET22b-TSP-TAMEP對TAMEP天然信號肽N端前10個氨基酸的密碼子進行隨機同義突變(圖1)，并轉化E.coliBL21(DE3)。通過微孔板對1 656個轉化子進行初篩，選取了20株蛋白酶活力較高的菌株進行搖瓶復篩。如圖3-a所示，20株菌中17株菌的酶活力較E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)高；其中，菌株17較出發(fā)菌提高了30%，達到了27.0 U/mL?；蛐蛄蟹治鲲@示，上述17株菌中TAMEP信號肽N端的前10個氨基酸編碼基因均發(fā)生了不同程度的同義突變。

a-突變株搖瓶發(fā)酵上清液TAMEP酶活力;b-突變株TAMEP信號肽N端基因序列WT-E. coli BL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)；1-17-TAMEP信號肽N端密碼子同義突變體圖3 信號肽N端前10個氨基酸密碼子同義突變對TAMEP在E. coli中表達的影響Fig.3 Effect of synonymous mutation within first 10 residuesof the TAMEP signal peptide on its expression in E.coli

2.3 提高TAMEP在E.coli中表達的發(fā)酵條件優(yōu)化

為提高TAMEP在E.coliBL21(+)中的表達量，通過單因素實驗依次對上述17株菌的誘導溫度、誘導劑IPTG濃度、誘導起始菌體濃度及添加劑進行優(yōu)化。如圖4所示，對TAMEP分泌表達影響最大的是添加劑，其次為誘導溫度和誘導劑濃度；誘導起始菌體濃度對酶表達的影響最小。在所選的添加劑中，乙醇能夠刺激細胞熱休克蛋白的表達，防止所表達蛋白的錯誤折疊；葡萄糖可提高宿主細胞中的質粒穩(wěn)定性；甘氨酸、曲通及吐溫等可以改善細胞膜通透性，提高重組蛋白向胞外轉運的效率[27]。葡萄糖對TAMEP分泌表達的促進作用最大，表明質粒穩(wěn)定性可能是其高效表達的限制性因素。最終確定TAMEP在E.coli中高效分泌表達的條件為：誘導溫度20 ℃、IPTG濃度為10 μmol/L、誘導起始OD600值為1.5及添加10 g/L葡萄糖。在此條件下，胞外TAMEP酶活力達到186.3 U/mL，較優(yōu)化前提高了5.9倍。

2.4 TAMEP的純化及酶學性質研究

本研究中表達的重組TAMEP和前期研究中表達的重組pro-TGase均在C端添加了由6個組氨酸構成的His-tag，故采用鎳柱對這2個蛋白進行親和純化。經洗脫條件優(yōu)化，確定TAMEP和pro-TGase洗脫的咪唑濃度分別為50和250 mol/L。如圖5所示，純化的蛋白無明顯雜帶。經脫鹽柱去除咪唑，測定TAMEP比酶活力為437 U/mg。

a-誘導溫度TAMEP表達的影響；b-IPTG濃度TAMEP表達的影響；c-誘導起始菌株濃度TAMEP表達的影響；d-添加劑TAMEP表達的影響圖4 誘導表達條件對TAMEP表達的影響Fig.4 Effects of induction conditions on the TAMEP expression

M-蛋白質標準分子質量；1-純化TAMEP 50 mol/L洗脫液；2-純化pro-TGase 250 mol/L洗脫液圖5 SDS-PAGE電泳分析TAMEPFig.5 SDS-PAGE analysis of TAMEP注：TAMEP和pro-TGase位置分別用單箭頭和雙箭頭標出(下同)

對純化后的TAMEP進行了酶學性質分析。如圖6-a和圖6-b所示，TAMEP的最適反應溫度和最適反應pH分別為55 ℃和7.0。穩(wěn)定性分析結果顯示，TAMEP在30～50 ℃孵育60 min酶活力保持在50%以上，60 ℃孵育相同時間酶活力幾乎全部損失(圖6-c)；TAMEP在pH 6.2～8.9最穩(wěn)定，并且在堿性環(huán)境中比在酸性環(huán)境中更穩(wěn)定。上述性質與S.mobaraensisTAMEP相似，將有助于高效活化pro-TGase的同時，確?；罨骉Gase的穩(wěn)定性。

a-溫度對TAMEP催化活性影響；b-pH對TAMEP催化活性影響；c-溫度對TAMEP穩(wěn)定性影響；d-pH對TAMEP穩(wěn)定性影響圖6 TAMEP酶學性質分析Fig.6 Catalytic property analysis of TAMEP

2.5 TAMEP活化pro-TGase

為研究重組TAMEP對pro-TGase的活化，用0.017～0.133 μmol/L TAMEP活化6.91 μmol/L pro-TGase 30 min，每隔10 min取樣進行TGase酶活力檢測和電泳分析。TGase酶活力分析顯示，TGase活性隨著活化反應進行而逐漸升高；相同的活化時間下，TGase活性隨著加入TAMEP的濃度升高而升高(圖7-a)。

如圖7-b所示，隨著活化反應的進行，pro-TGase(43.4 kDa)迅速轉化為TGase(39.2 kDa)，較高濃度TAMEP可加快這個轉化過程，并且未產生其他小的蛋白條帶。上述結果表明，重組TAMEP能高效催化pro-TGase活化，并不會降解活化后的TGase。

a-TGase酶活；b-SDS-PAGE電泳圖7 重組TAMEP的濃度對pro-TGase活化的影響Fig.7 Effect of TAMEP concentration on theactivation of pro-TGase注：SDS-PAGE左側括號中的數值為TAMEP濃度

3 結論與討論

重組鏈霉菌pro-TGase異源表達后，需要高效且專一性強的活化蛋白將其轉化為活性TGase。S.mobaraensisTAMEP作為pro-TGase天然活化蛋白，較其他蛋白酶更具優(yōu)勢。本研究，我們將S.mobaraensis來源的TAMEP表達于E.coli，并通過多重優(yōu)化策略(信號肽類型、N端同義密碼子優(yōu)化、優(yōu)化誘導條件)，實現了TAMEP的高效分泌表達，胞外TAMEP酶活力達到了186.3 U/mL。與胞內表達相比[20]，高效分泌表達將有助于TAMEP的分離提取，降低產酶成本。酶學性質分析顯示，重組TAMEP 與TGase具有近似穩(wěn)定pH和溫度范圍，將有助于前者對后者的活化。研究結果為TAMEP規(guī)?；a提供了生產菌株和基礎數據。值得注意的是，本研究采用價格較高的IPTG作為誘導劑，同時活化過程中TAMEP不能重復利用。因此，進一步考查自誘導表達的條件及研究TAMEP的固化策略將有助于其工業(yè)化應用。