基于SPME-GC-MS技術(shù)分析曲霉型豆豉生產(chǎn)過程中的揮發(fā)性成分變化

李金林，萬亮，王維亞，黃麗，王筱蘭，涂宗財(cái)*

1(江西師范大學(xué) 國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江西 南昌，330022)2(南昌市食品藥品檢驗(yàn)所 南昌市食品安全檢測與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330012)3(江西師范大學(xué) 江西省淡水魚高值化利用工程技術(shù)研究中心，江西 南昌，330022)

豆豉是我國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，被廣泛用于調(diào)味品[1]，是與日本納豆、印尼天培等齊名的世界著名發(fā)酵豆制品[2]。豆豉具有多種生理功能，如促消化[3]、降血壓[4]、抗氧化[5]、降血糖[6]等。根據(jù)發(fā)酵優(yōu)勢微生物不同，可分為曲霉型、毛霉型、根霉型和細(xì)菌型豆豉，其中曲霉型豆豉生產(chǎn)在我國分布最廣，不同類型豆豉風(fēng)味特征存在較大差異[1，7]。

我國豆豉生產(chǎn)以傳統(tǒng)工藝為主，多采用自然發(fā)酵，其風(fēng)味、品質(zhì)及功能受環(huán)境影響較大[3]。江西生產(chǎn)豆豉歷史悠久，最著名的屬“稻香園”豆豉。“稻香園”豆豉屬于曲霉型豆豉[8]，本課題組前期已對其微生物進(jìn)行測序[9]，并篩選獲得了高產(chǎn)脂肪酶米曲霉[10]和高產(chǎn)蛋白酶[11]、產(chǎn)乳酸[12]及高產(chǎn)酒精[13]菌株，但對該型豆豉的風(fēng)味尚未進(jìn)行報道。本文采用固相微萃取裝置(solid phase micro-extraction,SPME)進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)萃取，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)進(jìn)行成分分析，研究自然發(fā)酵曲霉型豆豉生產(chǎn)過程中風(fēng)味物質(zhì)變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料樣品,南昌稻香園調(diào)味食品有限公司采集。香精標(biāo)品、系列正烷烴(C8-C40)混合標(biāo)品,西格瑪(上海)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

固相微萃取裝置(SPME)及萃取頭(DVB/CAR/PDMS、PDMS/DVB、Carboxen/PDMS、PDMS型),美國Supelco公司；7890A /5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集與處理

豆豉生產(chǎn)流程：

黑豆→洗滌→蒸煮→冷卻→自然制曲(內(nèi)部溫度：20～30 ℃，空氣濕度：60%～90%，8 d)→洗曲→后酵(內(nèi)部溫度：40～50 ℃，20 d)→熱風(fēng)干燥(65～75 ℃，3～4 h)→包裝。

分別采集1個生產(chǎn)周期內(nèi)制曲第8天、后酵第20天和干燥后的樣品(水分含量分別為22.97%、40.90%和19.19%)，用無菌袋封裝置于冰箱4 ℃冷藏，成分分析前粉碎過20目篩。

1.3.2 揮發(fā)性成分萃取

參照李金林等[14]方法進(jìn)行，略有調(diào)整。取3 g樣品，加入到15 mL樣品瓶中，置于水浴中，采用恒溫裝置加熱，60 ℃平衡20 min，將SPME裝置置于樣品瓶上方，60 ℃恒溫萃取30 min，采用GC-MS分析。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Agilent DB-wax毛細(xì)管柱(30 m×0.25 μm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣He，流速1.0 mL/min，不分流模式；升溫程序：起始40 ℃，保持3 min，4 ℃/min升至105 ℃，5 ℃/min升至150 ℃，10 ℃/min升至240 ℃，保持15 min[15]。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電離電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍35～400 amu。

1.3.4 線性保留指數(shù)(linear retention index,LRI)測定

采用樣品GC-MS分析條件進(jìn)行C8-C40正烷烴混合標(biāo)品分析，根據(jù)公式(1)計(jì)算LRI[16]：

(1)

式中：n,正烷烴的碳數(shù)；ti,目標(biāo)成分保留時間，min；tn,Cn的保留時間；tn+1,Cn+1的保留時間。

1.3.5 揮發(fā)性成分鑒定與含量計(jì)算

將各組分質(zhì)譜信息與NIST08 質(zhì)譜庫進(jìn)行對照，將各組分LRI與NIST數(shù)據(jù)庫比較,初步確定各組分成分，部分組分采用標(biāo)品進(jìn)行確認(rèn)，以質(zhì)譜峰面積考察各組分相對含量[15，17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取頭的選擇

以干豆豉為原料，采用4種萃取頭萃取豆豉揮發(fā)性成分，采用GC-MS分析，經(jīng)自帶軟件AMDIS 32及NIST08數(shù)據(jù)庫進(jìn)行解析，4種萃取頭所萃取的成分GC-MS色譜圖見圖1，解析結(jié)果見表1。

圖1 四種萃取頭所萃取成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of flavor compounds extracted by SPME with four fibers

SPME是根據(jù)相似相溶原理，通過萃取頭的吸附性從樣品中萃取揮發(fā)性物質(zhì)，萃取頭極性不同所萃取的物質(zhì)不同。本研究中PDMS為弱極性萃取頭，適用于弱極性物質(zhì)萃取，另外3種屬中等極性萃取頭，適用于中等極性與極性化合物萃取[18]。由圖1可知，PDMS萃取頭萃取的成分種類少、信號強(qiáng)度弱，表明豆豉極性成分占比高。對比色譜圖解析結(jié)果(表1)，Carboxen/PDMS萃取物質(zhì)的最大峰面積最大，但僅個別成分含量高(圖1)，且經(jīng)解析的目標(biāo)成分?jǐn)?shù)不如DVB/CAR/PDMS和PDMS/DVB多。PDMS/DVB在最大峰面積、解析的總化合物數(shù)和目標(biāo)成分?jǐn)?shù)均優(yōu)于DVB/CAR/PDMS和PDMS，表明PDMS/DVB更適合豆豉風(fēng)味物質(zhì)萃取，用于后續(xù)分析用萃取頭。

表1 四種萃取頭所萃取成分的GC-MS分析結(jié)果Table 1 Automated mass spectral deconvolution andidentification results of GC-MS TIC of flavor compoundsextracted by four fibers

2.2 豆豉生產(chǎn)三階段揮發(fā)性成分鑒定

豆豉生產(chǎn)大致分為三階段，即制曲、后酵和干燥。三階段樣品揮發(fā)性成分經(jīng)SPME萃取，采用GC-MS鑒定，結(jié)果見表2。由表2可知，制曲階段共檢出24種成分，依次是呋喃1種、吡嗪5種、醛4種、醇3種、酮2種、酸2種、酚4種、其他3種。后酵階段豆豉中共檢出45種成分，包括呋喃3種、吡嗪4種、醛7種、醇5種、酮2種、酸4種、酯11種、硫化物2種、酚5種、其他2種。干豆豉中共鑒定出50種物質(zhì)，分別是呋喃3種、吡嗪6種、醛7種、醇7種、酮2種、酸4種、酯11種、硫化物2種、酚5種、其他3種。

2.3 不同生產(chǎn)階段揮發(fā)性成分對比分析

在生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)，原料黑豆有股青味，蒸煮后的黑豆主要呈現(xiàn)豆腥味，經(jīng)制曲后豆腥味消失，可嗅出淡淡的醬香味，經(jīng)后酵后形成了濃郁的醬香味和醇香味，干燥后豆豉的醬香味依然濃郁，而醇香味減淡。制曲、后酵及干燥三階段揮發(fā)性物質(zhì)種類、數(shù)量及含量變化情況見圖2。

圖2 豆豉生產(chǎn)三階段揮發(fā)性物質(zhì)種類、數(shù)量及含量變化情況Fig.2 Changes in species,amount,and content of volatilecompounds in Douchi during three processes

通過分析發(fā)現(xiàn)，在制曲階段，形成了少量的揮發(fā)性物質(zhì)，主要為醇、酚、醛，含量分別占總揮發(fā)物的23.54%、20.83%和18.48%，醇、醛賦予豆豉甜香、堅(jiān)果香和面包香等有益風(fēng)味(表2)，這2類物質(zhì)可通過美拉德反應(yīng)和脂肪氧化形成[16，19]；酚主要為愈創(chuàng)木酚，其是木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)單元，可能來源于木質(zhì)素的降解[20]，其賦予了豆豉木香、酚味、煙熏等風(fēng)味。另外，制曲后形成了少量的吡嗪、呋喃、酮類和酸類物質(zhì)，吡嗪和呋喃是典型的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物[15]，表明制曲階段已經(jīng)發(fā)生了輕度的美拉德反應(yīng)。

經(jīng)過后酵，豆豉形成了大量的揮發(fā)性物質(zhì)，醛、酯、醇和酚是含量最高的4類成分，其含量之和超過90%。后酵豆豉中檢出26種新成分(表2)，包括2,6-二甲基吡嗪、5-甲基糠醛、可可醛、二甲基三硫和3-甲基硫醇等典型風(fēng)味物質(zhì)。酯類是后酵過程中形成最多的一類物質(zhì)，共11種，約占總風(fēng)味物質(zhì)的25.40%。酯類的形成賦予產(chǎn)品甜香、花香、水果香、脂香等良好風(fēng)味。新檢出的2種硫化物總含量為1.17%，雖然較低，但其氣味閾值低，如二甲基三硫?yàn)?.36 μg/L[21]，對整體風(fēng)味可產(chǎn)生一定影響。另外，2,6-二甲基吡嗪、可卡醛、1-辛烯-3-醇等8種成分含量明顯增加，其中可卡醛增加最大，其峰面積由制曲階段的(4.28±0.97)×104增長至(224.67±12.74)×104，是后酵豆豉中含量最高的成分?？煽ㄈ┚哂刑鹣?、花香、堅(jiān)果香、可可香等良好風(fēng)味，其他物質(zhì)均體現(xiàn)令人愉快的風(fēng)味(表2)，因此這些物質(zhì)含量的增加有利于改善了豆豉風(fēng)味。

經(jīng)熱風(fēng)干燥后，豆豉揮發(fā)性成分發(fā)生了微弱變化，含量最高的4類物質(zhì)依次為醛、酯、酚和醇，總量占總風(fēng)味物質(zhì)含量的87.24%，檢出2,6-二乙基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、1,2-丙二醇等5種新成分，沒有檢出異丁酸，其他成分含量變化不大。采用SPME萃取風(fēng)味成分，萃取效果不僅與萃取頭極性、萃取溫度及時間有關(guān)，也與鹽分含量有關(guān)[18]。因此，干豆豉與濕豆豉的揮發(fā)性不同可能是由樣品鹽含量不同造成的。另外，在干燥過程中由于豆豉表層及沸點(diǎn)較低的物質(zhì)揮發(fā)，豆豉中各成分的相對含量也會發(fā)生改變。由于多數(shù)物質(zhì)呈現(xiàn)的風(fēng)味特征相近(表2)，微小含量的改變并未影響豆豉的整體風(fēng)味。

表2 豆豉生產(chǎn)不同階段樣品揮發(fā)性成分(n=2)Table 2 Flavor compounds identified in samples from different process of Douchi production(n=2)

續(xù)表2

3 結(jié) 論

由本實(shí)驗(yàn)可知，PDMS/DVB萃取頭適用于豆豉揮發(fā)性成分的萃取，表明豆豉中主要含極性成分，成分鑒定顯示，豆豉中主要含有呋喃、吡嗪、醛、醇、酮、酸、酯、硫化物、酚等物質(zhì)，進(jìn)一步論證了豆豉風(fēng)味物質(zhì)中極性成分占主體。煮熟的黑豆風(fēng)味較淡，豆豉中豐富的風(fēng)味物質(zhì)是在生產(chǎn)過程中經(jīng)微生物代謝及食物組分的相互作用形成的。前期研究已從豆曲或后酵豆豉中分離出了產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶、乳酸及乙醇等物質(zhì)的菌株[10-13]，蛋白酶、脂肪酶等酶的產(chǎn)生促進(jìn)大豆形成氨基酸、脂肪酸等風(fēng)味前體物質(zhì)，分離出產(chǎn)乳酸、乙醇的菌株表明微生物代謝可直接形成風(fēng)味物質(zhì)。豆豉中揮發(fā)性成分的種類、含量與微生物多樣性及發(fā)酵條件有關(guān)。前期研究表明[9]，制曲與后酵階段微生物存在差異，制曲階段米曲霉屬(Aspergillus)為第一大優(yōu)勢真菌，葡萄球菌屬(Staphylococcus)為第一大優(yōu)勢細(xì)菌；后酵階段米曲霉屬相對豐度不斷下降，橫梗霉屬(Lichtheimia)成為第一大優(yōu)勢真菌；細(xì)菌中魏斯氏菌屬(Weissella)相對豐度不斷增加，最終與葡萄球菌屬(Staphylococcus)共同成為優(yōu)勢細(xì)菌，其他菌屬微生物在2個階段也存在一定差異。因此，微生物多樣性導(dǎo)致了制曲和后酵階段形成的揮發(fā)性成分存在差異。另一方面，發(fā)酵溫度與時間不同也可能影響風(fēng)味物質(zhì)的形成，制曲階段溫度接近環(huán)境溫度(20～30 ℃)，時間較短(8 d)，后酵階段由于堆積及微生物代謝發(fā)熱，溫度維持在40～50 ℃，發(fā)酵時間為20 d，溫度的適度提高及時間延長有利于美拉德、脂肪氧化等熱反應(yīng)發(fā)生以形成良好的風(fēng)味物質(zhì)[22]。干燥階段，溫度控制在65～75 ℃，先高后低，由于干燥時間較短(3～4 h)，干豆豉中揮發(fā)性成分種類相對于濕豆豉變化不大，但含量發(fā)生一定變化，原因可能是隨著水分的蒸發(fā)，豆豉表層及沸點(diǎn)低的成分也隨之揮發(fā)。在干豆豉中檢出5種新成分，推測熱風(fēng)干燥可能促進(jìn)新物質(zhì)形成?？傊?，無論是從風(fēng)味成分形成的數(shù)量還是含量看，后酵是豆豉風(fēng)味物質(zhì)形成的主要階段。由于豆豉風(fēng)味的形成是微生物代謝及食物組分相互作用的結(jié)果，其各風(fēng)味物質(zhì)形成的機(jī)理還需進(jìn)一步探討。