CTLA4基因多態(tài)性與不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系

畢曉英 王丹丹 許 珂

河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院(鄭州，450008)

反復(fù)自然流產(chǎn) (UHA)在妊娠者中發(fā)生率為1%～5%[1]，該病發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，研究認(rèn)為染色體異常、子宮疾病、感染、內(nèi)分泌異常等因素可能與反復(fù)流產(chǎn)有關(guān)，但仍有一半以上患者病因不明確[2]。細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)屬T細(xì)胞功能負(fù)調(diào)控因子，在調(diào)控多類自身免疫病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[3]。近期研究顯示CTLA-4基因多態(tài)性會(huì)影響母體與胎兒間的免疫耐受性，進(jìn)而導(dǎo)致流產(chǎn)[4]。然而其基因多態(tài)性在UHA中的作用報(bào)道不多，本研究探究CTLA-4基因多態(tài)性與UHA發(fā)生關(guān)系，為UHA發(fā)生機(jī)制研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年9月—2018年5月在本院治療的UHA患者98例(觀察組)，年齡(27.9±4.7)歲(20～41歲)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①無成功受孕史，流產(chǎn)≥2次且妊娠周數(shù)≤20周；②影像學(xué)檢查生殖器官發(fā)育正常；③患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①夫妻雙方染色體異常；②多囊卵巢綜合征及黃體功能不全；③糖尿病、甲狀腺功能異常者；④免疫系統(tǒng)異常，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗精子抗體；⑤男方原因不孕。另選同期本院孕檢正常妊娠者107例作為對(duì)照組，均有1次以上成功受孕史，未出現(xiàn)自然流產(chǎn)，年齡(27.9±4.7)歲(21～40歲)，與觀察組年齡比較無差異(P>0.05)。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.2.1試劑儀器及取樣全血DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)；CTLA4基因rs5742909、rs4553808、rs231775位點(diǎn)擴(kuò)增引物(生工生物工程有限公司)；PCR檢測(cè)試劑盒(寶生物工程公司)；白介素-2(IL-2)、干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-4、IL-6、IL-10檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；凝膠成像儀(英國(guó)Syngene公司)。取兩組對(duì)象晨空腹靜脈血離心收集上清，于-20℃保存。

1.2.2檢測(cè)CTLA4基因位點(diǎn)分型DNA提取試劑盒提取血液中DNA，分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA純度，當(dāng)260/280波長(zhǎng)1.7～2.0時(shí)表明DNA純度較好，用于后續(xù)檢測(cè)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段多態(tài)性(PCR-RFLP)反應(yīng)體系為25μl，PCR mix12.5μl，上下游引物(rs5742909、rs4553808、rs231775位點(diǎn))各0.35μl，Taq enzyme 0.25μl，DNA template 1μl，添加ddH2O至總體積為25μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃預(yù)變性3min，56℃退火 30s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)，rs5742909、rs4553808、rs231775內(nèi)切酶分別為MseI、MseI、BbvI，酶切體系共15.5μl，緩沖液1.75μl，內(nèi)切酶0.75μl，PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl，補(bǔ)充ddH2O至25μl，37℃過夜反應(yīng)后，取5μl酶切產(chǎn)物于3%凝膠電泳中電泳，凝膠成像儀內(nèi)觀察分型，保存結(jié)果。

1.2.3血清指標(biāo)檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10水平，操作參照試劑盒說明書。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組血清Th1型、Th2型細(xì)胞因子水平

與對(duì)照組相比，UHA組血清IFN-γ、TNF-α、IL-2水平均升高，IL-4、IL-6、IL-10水平均降低(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清各檢測(cè)因子水平比較

2.2 CTLA4基因多態(tài)性

rs5742909位點(diǎn)存在多態(tài)性，酶切后出現(xiàn)3種基因分型，包括野生型純合基因CC(226bp、21bp)，突變雜合基因型CT(226bp、130bp，96bp、21bp)，突變純合基因型TT(130bp、96bp、21bp)；rs4553808位點(diǎn)存在多態(tài)性，酶切后出現(xiàn)三種基因分型，包括野生型純合基因AA(333bp、153bp)，突變雜合基因型AG(486bp、333bp、153bp)，突變純合基因型GG(486bp)；rs231775位點(diǎn)存在多態(tài)性，酶切后出現(xiàn)三種基因分型，包括野生型純合基因AA(329bp)，突變雜合基因型AG(329bp、245bp、84bp)，突變純合基因型GG(245bp、84bp)。見圖1～3。

圖1 rs5742909 PCR-CTPP產(chǎn)物電泳圖

圖2 rs4553808 PCR-CTPP產(chǎn)物電泳圖

圖3 rs231775 PCR-CTPP產(chǎn)物電泳圖

2.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡驗(yàn)證

兩組CTLA4基因rs5742909、rs4553808、rs231775位點(diǎn)實(shí)際基因頻率與理論值比較無差異(P>0.05)，各位點(diǎn)基因頻率表現(xiàn)穩(wěn)定，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。見表2。

表2 兩組CTLA4基因各位點(diǎn)遺傳平衡檢驗(yàn)(實(shí)際值/理論值)

2.4 各組rs5742909、rs4553808、rs231775基因型頻率對(duì)比

觀察組rs5742909位點(diǎn)T等位基因頻率及rs231775位點(diǎn)G等位基因頻率均高于對(duì)照組(P<0.05)；rs4553808不同基因型頻率兩組比較無差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組rs5742909、rs4553808、rs231775基因型頻率對(duì)比

2.5 rs5742909 、rs231775基因型與UHA患者Th1、Th2細(xì)胞因子關(guān)系

rs5742909、rs231775不同基因型者血清IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10水平存在差異(P<0.05)。見表4。

表4 不同基因型者血清各檢測(cè)因子水平比較

2.6 發(fā)生UHA風(fēng)險(xiǎn)的logistic回歸分析

以rs5742909 CC、C等位基因型為參照，TT、TC及T等位基因攜帶者發(fā)生UHA相對(duì)危險(xiǎn)度有差異；以rs231775 AA型、C等位基因?yàn)閰⒄?，AG、GG及T等位基因攜帶者發(fā)生UHA相對(duì)危險(xiǎn)度有差異(P均<0.05)。rs4553808基因型及等位基因頻率與UHA發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)不相關(guān)(P>0.05)。見表5。

表5 基因多態(tài)性與UHA發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的logistic回歸分析

3 討論

UHA屬于臨床常見妊娠期并發(fā)癥，80%～90%的產(chǎn)婦發(fā)生在妊娠早期，臨床對(duì)其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了大量研究，主要涉及子宮畸形、染色體異常等，但具體發(fā)生機(jī)制尚未闡明[5]。免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)胚胎與母體間的免疫應(yīng)答使胎兒產(chǎn)生免疫耐受，對(duì)胎兒生存有利。其中母體T淋巴細(xì)胞在免疫耐受中發(fā)生著重要作用，CTLA-4不僅可誘導(dǎo)Th1/Th2細(xì)胞分化，還對(duì)T淋巴細(xì)胞活化具有抑制作用[6]。過往研究顯示CTLA-4 mRNA及蛋白水平異常后可抑制T淋巴細(xì)胞效應(yīng)，降低母體與胎兒間的免疫耐受作用[7]。近期研究發(fā)現(xiàn)CTLA-4基因多態(tài)性可能影響CTLA-4對(duì)T細(xì)胞的抑制功能，進(jìn)而引發(fā)流產(chǎn)[8]。因此研究UHA患者CTLA-4基因多態(tài)性對(duì)于探究UHA免疫發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

目前CTLA-4基因多態(tài)性位點(diǎn)研究較多的有rs733618、rs5742909、rs4553808、rs231775等。rs231775位點(diǎn)A突變后可以產(chǎn)生產(chǎn)物Ala17Thr，目前此位點(diǎn)研究最多。研究發(fā)現(xiàn)rs231775啟動(dòng)子外顯子149位點(diǎn)為A時(shí)，CTLA-4表達(dá)水平較高，當(dāng)該位點(diǎn)突變?yōu)镚時(shí)，CTLA-4表達(dá)水平降低，對(duì)T細(xì)胞抑制的活性也降低[9]。此外rs231775 位點(diǎn)G攜帶者T淋巴細(xì)胞中CTLA-4表達(dá)水平低于A攜帶者[10]。Mortaza等通過對(duì)流產(chǎn)患者、正常妊娠者CTLA-4基因rs231775 位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩組GG、AG基因型頻率比較差異顯著，且流產(chǎn)患者G等位基因頻率較高[11]。本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，觀察組rs231775位點(diǎn)G等位基因頻率顯著升高，且兩組間不同基因型頻率比較有差異，提示UHA患者CTLA-4基因rs231775 位點(diǎn) A→G突變可能與UHA的發(fā)生相關(guān)；logietic回歸分析發(fā)現(xiàn)rs231775位點(diǎn)G基因攜帶者發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高，提示rs231775 位點(diǎn) A→G突變是UHA的危險(xiǎn)因素。rs4553808位點(diǎn)等位基因由A突變?yōu)镚后，該位點(diǎn)可與c/EBPβ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控CTLA-4基因轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞的增殖、凋亡。過往研究顯示rs4553808位點(diǎn)基因多態(tài)性與慢性丙型肝炎感染、乳腺癌易感性有關(guān)[12-13]；然而本研究發(fā)現(xiàn)兩組rs4553808位點(diǎn)各基因型AA、AG、GG基因頻率比較無差異性，且等位基因G與A等位頻率無差異性，logietic回歸分析發(fā)現(xiàn)rs231775位點(diǎn)基因多態(tài)性與UHA的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)，分析原因可能為納入患者疾病類型、年齡等差異所致。有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)rs5742909位點(diǎn)為T等位基因時(shí)，細(xì)胞內(nèi)CTLA-4表達(dá)水平升高，可進(jìn)一步釋放TGF-β，降低T細(xì)胞反應(yīng)性，抑制Th1型細(xì)胞產(chǎn)生IL-2，進(jìn)而使母體-胎兒免疫維持在動(dòng)態(tài)平衡，因此當(dāng)rs5742909位點(diǎn)發(fā)生突變后，會(huì)影響Th1/Th2免疫平衡，進(jìn)一步影響妊娠結(jié)局[14]。許廣力等[15]研究顯示rs5742909位點(diǎn)多態(tài)性與妊娠早期發(fā)生流產(chǎn)無明顯相關(guān)性。而本研究發(fā)現(xiàn)兩組rs5742909位點(diǎn)不同基因分型、等位基因頻率間具有差異性，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)rs5742909位點(diǎn)C→T突變后可增強(qiáng)UHA的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，提示rs5742909位點(diǎn)C→T突變?yōu)閁HA發(fā)生的危險(xiǎn)因素。

有研究證實(shí)Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡與妊娠結(jié)局密切相關(guān)，正常妊娠情況下Th1型細(xì)胞因子呈低表達(dá)，Th2型細(xì)胞因子呈高表達(dá)，當(dāng)Th1型細(xì)胞因子水平升高后誘發(fā)流產(chǎn)[16]。CTLA-4可通過影響T細(xì)胞效應(yīng)活性進(jìn)而影響T細(xì)胞耐受，維持Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡，當(dāng)CTLA-4基因發(fā)生突變后影響其功能，破壞Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡，參與流產(chǎn)的發(fā)生[17]。目前對(duì)于CTLA-4位點(diǎn)基因型與Th1/Th2細(xì)胞因子的關(guān)系研究不多。本研究發(fā)現(xiàn)rs5742909、rs231775不同基因型者血清Th1/Th2細(xì)胞因子水平存在差異，推測(cè)rs5742909、rs231775位點(diǎn)發(fā)生突變后影響CTLA-4基因功能，進(jìn)而導(dǎo)致Th1/Th2免疫失衡，引發(fā)胎兒有害的免疫反應(yīng)，提示rs5742909、rs231775位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與Th1/Th2免疫平衡有關(guān)。

綜上所述，CTLA4基因rs5742909、rs231775位點(diǎn)多態(tài)性與UHA發(fā)生相關(guān)，rs5742909位點(diǎn)C→T突變、rs231775位點(diǎn)A→G突變可增加UHA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，這可能與Th1/Th2免疫失衡有關(guān)。然而本研究納入病例不多，數(shù)據(jù)分析結(jié)果可能存在一定的偏差，還有待后續(xù)納入多樣本量驗(yàn)證結(jié)果，為探究UHA的病理機(jī)制提供充分的論據(jù)。