深圳地區(qū)育齡人群G6PD基因突變譜特征分析

郭昭鵬 吳群燕 陳仕國 林 圣 鄭開封 蘇進娣 姚克勤 段 山*

1. 深圳市羅湖區(qū)婦幼保健院(518019)；2.深圳市衛(wèi)生健康發(fā)展研究中心

葡萄糖-6磷酸脫氫酶( G6PD)缺乏癥是世界范圍內常見的遺傳性疾病，是由G6PD基因中的點突變導致酶活性的異常。廣東省是中國南部沿海人口最多的省份，一直被稱為“百種族”，G6PD缺乏癥發(fā)生率為3.1%～16.1%[1]，在深圳地區(qū)具有比較高的發(fā)病率[2-3]，但以往的研究沒有對深圳地區(qū)的致病基因突變譜進行大規(guī)模人群系統(tǒng)分析。為了今后能高效開展本地區(qū)G6PD缺乏癥基因篩查，本研究在深圳地區(qū)育齡人群中開展了G6PD缺乏癥致病相關基因突變譜的篩查。

1 對象和方法

1.1 研究對象

來自深圳原羅湖區(qū)和原龍崗區(qū)計劃生育中心體檢育齡夫婦的靜脈血樣本共6389例，其中經(jīng)過G6PD/6GPD比值法初篩G6PD陽性樣本749例及未經(jīng)酶活性篩查的樣本5640例。本研究經(jīng)深圳市衛(wèi)生健康發(fā)展研究中心倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1G6PD/6PGD比值法采用G6PD測定試劑盒(廣州科方生物技術有限公司)，在COBAS8000全自動生化免疫分析系統(tǒng)(ROCHE, USA)上進行G6PD酶活性檢測。正常參考值為1.00～2.30；<0.95為G6PD缺乏，判斷為陽性；>1.05為G6PD酶活性正常，判斷為陰性；0.95～1.05為可疑，予以復查后判定。

1.2.2ARMS-PCR法通過優(yōu)化引物和擴增條件，檢測中國人常見的6種基因突變型：c.1376 G>T、c.1388 G>A、c.95 A>G、c.871 G>A、c.392 G>T、c.1024C>T[4]。抽取10%的樣本進行sanger測序驗證ARMS-PCR法檢測的準確性，結果100%準確，沒有發(fā)現(xiàn)檢測錯誤樣本。

1.2.3二代測序(NGS)用ARMS法排除6個常見位點的樣本后進行NGS全序列測序檢測，擴增方案見參考文獻[5]。NGS全序列測序分析見參考文獻[6]。數(shù)據(jù)分析采用Ion Torrent PGMTM服務器配套的Ion Torrent Software Suite數(shù)據(jù)分析軟件對電信號進行捕獲和轉換，并結合自帶插件coverageAnalysis和variantCaller對測序結果進行初步分析。

2 結果

2.1 基因突變類型

6389例樣本中發(fā)現(xiàn)1180例存在基因突變， 檢出23種基因突變類型。女性樣本中檢出14例純合子(1388G>A純合突變 7 例， 1376G>T 純合突變 7例)及28例雙重雜合子(c.95 A>G/c.1376 G>T復合突變8例、c.95 A>G/c.1388 G>A復合突變7例、c.1376 G>T/c.1388 G>A復合突變13例)。見表1。研究還發(fā)現(xiàn)了4例新突變類型，分別為c.460A>G、c.226A>C、c.-6T>C、c.452C>G，見表2。

表1 6389例樣本ARMS-PCR結合NGS全序列分析檢出基因突變類型

表2 4例未見報道基因突變類型及G6PD/6PGD比值法檢測結果

2.2 基因突變率

5640例樣本檢出有基因突變442例，占7.8%，其中男性148例，占男性樣本10.0%(148/1479)；女性294例，占女性樣本7.0%(294/4161)。

2.3 漏診率和假陽性率

經(jīng)酶活性檢測的5640例中，陰性5280例(男性1331例、女性3949例)中發(fā)現(xiàn)基因突變率1.8%(96/5280)，其中男女性漏診率分別為0.3%(3/1331)和2.4%(93/3949)。而在酶活性檢測為陽性的360例(6.4%)及之前收集的749例G6PD陽性樣本中，共計有25例經(jīng)過全序列測序分析未發(fā)現(xiàn)基因突變，誤診率為2.2%(25/1109)。

3 討論

G6PD缺乏癥，俗稱蠶豆病，是由于編碼紅細胞中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)的基因突變，引起溶血性貧血的一種遺傳性酶缺乏病[7]。G6PD 基因突變具有明顯的地區(qū)和種族異質性，在我國其分布呈“南高北低”的趨勢，患者主要分布在長江以南各省，以海南、廣東、廣西、云南、貴州、四川等省為高，其發(fā)病率可達 4.2%～15.7%[8]。編碼G6PD的基因突變類型以點突變?yōu)橹?，世界各地已發(fā)現(xiàn)超過200種異常G6PD基因型，中國人群已發(fā)現(xiàn)35種[9]。本研究歷時3年，共計對6389例孕前篩查的育齡人群開展了ARMS-PCR法結合NGS全序列分析方法檢測G6PD基因突變的研究，取得了本地區(qū)G6PD基因突變譜的第一手資料。

3.1 中國深圳地區(qū)育齡人群G6PD基因突變類型的流行特征

本研究中得到G6PD缺乏癥酶活性異常率為6.4%，G6PD缺乏癥的基因型突變率為7.8%，其中男女性占比分別為10.0%和7.0%，高于佛山、東莞、潮州等廣東省其他地區(qū)報道的G6PD基因突變率[10-12]。結果的差異性可能與樣本量和地區(qū)人群起源的差異有關。G6PD在不同種族和人群中的致病基因突變類型和發(fā)生頻率有高度遺傳異質性。本研究共對6389例樣本進行基因突變篩查的結果發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)常見突變類型構成比與中國南方人群常見的12種突變類型基本相符[13]。檢出的c.592C>T、c.1360C>T、c.487G>A、c.949G>A,突變分別在印度、意大利和東南亞較為常見[14]。本研究檢測出1例突變類型為c .592C> T，據(jù)報道是中國侗族最常見的突變類型，占侗族G6PD基因突變的50%以上[15]。目前報道東南亞種群中常見的突變類型為c.95A>G，c.392G>T，c.1360C>T，c.1376G>C，c.1388G>A和c.871G>A[16]。本研究結果同樣顯示具有亞洲種群的突變特征，同時又發(fā)現(xiàn)較多中國人群罕見的突變類型，說明深圳地區(qū)作為一個年輕的移民城市，由于匯聚了來自全國各地的新移民，從遺傳學角度看本地區(qū)人群具有高度的遺傳異質性和代表性，因而有許多中國人罕見的基因突變類型得以在本地區(qū)人群中檢出。這也提示深圳地區(qū)人群是篩查中國人群常見遺傳性疾病基因突變譜的理想人群。G6PD全基因序列測序發(fā)現(xiàn)的c.460A>G、c.226A>C、c.-6T>C、c.452C>G，4個基因突變經(jīng)過Pubmed、HGMD、dbSNP、LOVD、Ensembl數(shù)據(jù)庫檢索均未發(fā)現(xiàn)報道。

3.2 G6PD基因檢測方法比較

目前，診斷G6PD缺乏癥主要的檢測方法包括酶活性檢測法和基因檢測法兩大類。臨床上多采用酶活性檢測法[17]。G6PD/6PGD比值法對于女性雜合子的漏檢率約在20%[18]。

ARMS-PCR是一種常用檢測已知點突變的方法，具有簡單、省時、經(jīng)濟、準確優(yōu)點[19]。本研究首先用ARMS-PCR法對6389例樣本進行G6PD基因的6個常見突變位點進行快速低成本篩查，大大節(jié)約了研究的時間成本和經(jīng)濟成本。二代測序(NGS)[20]由于測序成本較高，目前的報道中尚未見將這一方法大規(guī)模用于臨床檢測。但由于其在高通量、全基因范圍內篩查已知和未知突變方面的獨特優(yōu)勢，本研究采用本課題組開發(fā)的長片段PCR捕獲結合NGS測序的目標序列測序方法對未篩查到常見突變的樣本進行了G6PD基因全基因序列測序分析，測序范圍包括基因前后端5000bp范圍的基因表達調控區(qū)及所有外顯子內含子區(qū)域，以便能夠全面篩查可能存在的中國人群罕見G6PD突變和/或未知突變。

本研究對5640例樣本先進行G6PD/6PGD比值法鑒定后再予以基因法檢測，G6PD/6PGD比值法漏診率1.8%，誤診率為2.2%。原因可能有以下幾點：①不同基因突變導致的酶活性缺乏的表現(xiàn)度不一。②女性雜合子突變由于X染色體隨機失活或者DNA甲基化程度各異導致酶活性的缺失程度差異較大。G6PD/6PGD比值法檢測結果靠近正常臨界值甚至正常，需要在G6PD/6PGD比值法檢測的基礎上結合基因突變檢測來提高G6PD缺乏癥的篩查準確率。

本研究在部分G6PD/6PGD法檢出的G6PD酶活性正常樣本中用本方法也檢測出編碼區(qū)的有效錯義突變，是目前較為全面和可靠的方案。本研究發(fā)現(xiàn)的4例尚未見報道的基因突變類型，除了c.460A>G突變女性攜帶者酶活性正常外，其它3種突變的男性攜帶者其酶活性都顯著下降，由于 X 染色體隨機失活,攜帶G6PD 基因突變的女性雜合子會形成酶缺乏紅細胞與正常紅細胞的嵌合，故其酶活性差異較大。它們與G6PD致病的相關性以及造成的酶缺乏程度等致病機制有待進一步實驗研究揭示。

綜上所述，本項研究在深圳地區(qū)開展了較大規(guī)模的系統(tǒng)性G6PD基因突變篩查研究，獲得了較明確的深圳地區(qū)常見的G6PD基因突變譜。并對G6PD/6PGD比值法篩查G6PD缺乏癥的漏診率和誤診率進行初步統(tǒng)計分析。對改進現(xiàn)有臨床G6PD/6PGD比值法提供數(shù)據(jù)和技術支撐，為研發(fā)適合本地區(qū)出生缺陷預防的G6PD缺乏癥基因診斷試劑盒提供理論基礎。

(志謝：深圳市人口基金會為本研究項目提供的研究資金支持)