新型超細晶銅材料植入大鼠子宮中Cu2+釋放及對子宮組織的影響

暴 國 張長勇 饒 永 徐祥波 陳西華 鄭玉峰 賀 斌*

1.國家衛(wèi)生健康委科學技術研究所(北京，100081)；2.吳江永元生物科技有限公司；3.北京大學工學院材料與工程系

美國疾病控制與預防中心、世界衛(wèi)生組織、FSRH、美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會等重要組織機構認為放置宮內(nèi)節(jié)育器(IUD)是適用于多種女性人群的安全避孕方法，近年來國外甚至推薦IUD作為一種緊急避孕方法[1]。盡管IUD被公認是可逆、高效的長效避孕方法，但仍存在不少臨床問題。我國《12萬例宮內(nèi)節(jié)育器避孕效果調(diào)查報告》大樣本研究顯示，20年來，雖然IUD避孕有效率明顯提高和品種大量增加，但出血、感染、腹痛、腰痛等副反應卻沒有下降。與20世紀80年代初期研究相比，有的副反應甚至升高[2]。已有研究顯示Cu2+的暴釋是副反應產(chǎn)生的重要因素之一[3]。2012年，鄭玉峰等在未引入任何新元素和新材料情況下，通過多道次擠壓方法制備新型超細晶銅材料，體外實驗顯示比普通銅具有更高的強度、更低的腐蝕速率，完全可接受的Cu2+釋放行為以及更好的生物相容性[4]。在前期實驗基礎上，本研究以新型超細晶銅材料制備銅絲與現(xiàn)有IUD銅材料植入大鼠子宮，探究銅材料在動物體內(nèi)的Cu2+釋放及對子宮影響。

1 材料與方法

1.1 銅材料制備

普通銅材料由重慶南桐節(jié)育器廠(GCu200-20×22/日本銅絲，標稱純度99.99%)生產(chǎn)，銅絲直徑0.4-00.04mm。新型超細晶純銅材料由江蘇吳江永元生物科技有限公司制備，標稱純度99.99%，銅絲直徑0.3-00.03mm，制備方法按照鄭玉峰的塊體金屬制備方法[4]，并在江蘇蘇州拉制成絲。兩種銅材樣品依次經(jīng)過丙酮、無水乙醇及去離子水中超聲波清洗，吹干。普通銅材料截取5.3 cm銅絲(59 mg，表面積(2πr2+2π·r·L=0.67 cm2)，新型超細晶銅材料截取7.1 cm銅絲(45 mg，表面積0.67 cm2)后，銅絲彎曲成螺旋管狀備植入用。以TCu380 IUD用于體質(zhì)量50 kg成年人核算，250 g大鼠應用銅面積約1.9 mm2[5]，植入一節(jié)銅絲螺旋管于1只250 g大鼠銅劑量為成年人的0.67 cm2/1.9 mm2=35.2倍。

1.2 實驗動物

12周齡Wistar雌性大鼠60只(購于中國醫(yī)學科學院實驗動物中心)，體重200～250 g，按數(shù)字表法隨機分為對照組和實驗組各30只。飼養(yǎng)于本所實驗動物中心，光照周期為明暗交替各12h，每天早8：00開燈，晚20：00關燈。環(huán)境溫度21±1℃，相對濕度60%～80%，動物自由采食及飲水。實驗研究遵循本所倫理委員會相關規(guī)定。

1.3 銅材料植入及取材

大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉麻醉后，背部正中偏下方左側切口入腹腔，找到左側子宮后將子宮角輕拉出腹腔，距子宮角遠端約1 cm處將子宮壁剪開一小口，將銅絲螺管置于大鼠左側子宮腔內(nèi)并用絲線固定于子宮壁，縫合子宮壁切口，逐層關閉腹腔，縫合背部切口，對照組植入普通銅材料，實驗組植入超細晶銅材料；分別于術后12 h、1 d、3 d、7 d、15 d、30 d各處死5只大鼠。收集大鼠外周血血清，以1 ml生理鹽水灌洗雙側子宮腔并收集灌洗宮腔液，收集雙側子宮組織，其中左側與銅絲螺管接觸區(qū)域及未植入的右側子宮各取2段(3～4 mm)子宮組織、肝臟組織(0.25～0.40 g)，稱重記錄后分別保存于4%多聚甲醛和液氮中備用。

1.4 Cu2+濃度測定

采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP)檢測大鼠血清、宮腔灌洗液、子宮組織、肝臟組織中的Cu2+濃度，檢測前組織材料需消解的使用濃硝酸和去離子水消解：取全血200 μl，用1 ml硝酸+0.5 ml雙氧水消解，去離子水定容到3 ml送檢；取宮腔灌洗液300 μl，用1 ml硝酸+0.5 ml雙氧水消解，去離子水定容到3 ml送檢；肝臟組織(0.25～0.4 g)加入3 ml+1.5 ml硝酸消解，去離子水定容到30 ml，取3 ml送檢。委托北京大學分析測試中心采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP)檢測Cu2+濃度，并按照樣品初始體積或質(zhì)量換算成單位體積或質(zhì)量濃度。

1.5 組織切片染色

固定于4%多聚甲醛中子宮組織常規(guī)脫水石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟、水化，蘇木素浸染1～2min后清洗，1%鹽酸酒精分化5～10s，流水沖洗返藍，伊紅浸染20～30s，常規(guī)梯度脫水、透明、中性樹膠封片，普通顯微鏡組織學觀察。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 Cu2+在大鼠血清和肝臟中含量

植入兩種銅材料后，兩組大鼠血清中Cu2+濃度逐漸增加，在植入后3d達到高峰(P<0.05)，植入7d和15d時沒有顯著波動，至植入30d顯著下降(P<0.05)接近植入12h時水平；實驗組植入7d時血清Cu2+濃度呈下降趨勢，至植入15d時低于對照組(P<0.05)。對照組各時點肝臟中Cu2+濃度未有明顯波動，實驗組植入7d、15d和30d時Cu2+濃度均低于植入3d時(P<0.05)。見表1。

表1 兩組埋置銅絲不同時間Cu2+濃度比較

2.2 Cu2+在大鼠子宮腔灌洗液中含量

兩組放置銅絲螺管的左側子宮宮腔灌洗液Cu2+濃度呈相似變化趨勢，植入12h、1d時Cu2+濃度無明顯變化，植入3d時達高峰(P<0.05)，植入7d、15d、30d時逐漸下降，且實驗組植入3d、7d、15d時低于對照組(P<0.01。右側宮腔灌洗液Cu2+濃度低于左側，且在植入12h、1d、3d時逐漸升高，至7d后Cu2+濃度趨于穩(wěn)定。見表2。

表2 兩組埋置銅絲后不同時間宮腔液中Cu2+濃度比較

2.3 Cu2+在大鼠子宮組織中含量

在植入12h，兩組植入銅絲的左側子宮組織中Cu2+濃度無差異，植入1d、3d時下降，在植入7d、15d時實驗組低于對照組(P<0.05)。未植入銅材料的右側子宮組織中Cu2+濃度較左側低，且在植入7d、15d時實驗組低于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組埋置銅絲后子宮組織中Cu2+濃度比較

2.4 子宮組織形態(tài)學結果

組織學結果顯示，埋植銅絲1d，對照組子宮宮腔上皮廣泛脫落，腔上皮下的基質(zhì)細胞裸露，宮腔內(nèi)可見炎性滲出物及壞死脫落組織，內(nèi)膜中有大量的炎性細胞侵潤，內(nèi)膜無菌性炎癥反應累及范圍廣而深，達到內(nèi)膜中部，并部分累及到腺體；實驗組子宮雖同樣可見子宮內(nèi)膜腔上皮脫落，腔上皮下的基質(zhì)細胞裸露以及無菌性炎癥反應，但炎性反應僅局限于內(nèi)膜淺層，并未像對照組炎癥反應已經(jīng)到達子宮深層。在埋植銅絲7d，兩組子宮組織宮腔上皮仍有部分脫落，腔上皮下的基質(zhì)細胞呈現(xiàn)部分裸露，炎性反應發(fā)生在內(nèi)膜淺層，但對照組更為明顯。在埋植銅絲30d時，兩組無明顯區(qū)別，內(nèi)膜上皮被覆基本完整，內(nèi)膜淺層可見少量的炎性細胞侵潤，呈現(xiàn)慢性炎癥反應。見圖1。

圖1 不同植入組大鼠各時期子宮組織學表現(xiàn)

3 討論

盡管臨床實踐證明含銅IUD具有較理想的避孕效果，但出血、感染、腹痛、腰痛等不良反應始終困擾著使用者。Cu2+暴釋是副反應產(chǎn)生的重要因素之一，Cu2+暴釋與銅材料的腐蝕行為密切相關[6]，而塊體銅材料不同的內(nèi)部組織結構是造成腐蝕行為差異的原因。普通純銅材料內(nèi)部的晶粒平均尺寸為40μm，表面晶界密度較低；而本研究實驗組采用的新型超細晶銅材料的平均晶粒尺寸僅為0.3 μm，表面晶界密度和缺陷密度大幅增加，高密度晶界可以降低銅在模擬體液中的腐蝕速率。體外研究也顯示了超細晶銅材料具備完全可接受的Cu2+釋放行為以及更好的生物相容性[4]。

本研究中植入不同銅材料的兩組大鼠外周血和肝臟組織中Cu2+濃度變化趨勢未見差異，提示超細晶銅材料植入大鼠宮腔后釋放的Cu2+對機體系統(tǒng)性影響與普通銅材料相似。同時，宮腔灌洗液中的Cu2+濃度兩種銅材料在植入3d時達到高峰，隨后開始下降，但超細晶銅材料組下降更明顯且低于普通銅材料組，提示兩種銅材料的早期爆釋峰值時間相似，但超細晶銅材料的Cu2+爆釋持續(xù)時間更短，爆釋量更低。

大鼠植入側子宮組織中Cu2+濃度檢測結果顯示，盡管在兩種銅材料植入后前3天沒有差異，但在7d和15d時超細晶銅材料組降低明顯，植入30d時兩種含量相似。組織學觀察，在兩種銅材料植入后早期兩組子宮內(nèi)膜均經(jīng)歷急性炎性損傷，超細晶銅材料組在植入7d時內(nèi)膜組織表現(xiàn)出更好的組織修復，至植入30d兩組組織學相似，呈慢性炎癥改變。提示超細晶銅材料可能有利于減少子宮出血包括出血量和出血時間。

當前國內(nèi)外為解決含銅IUD的不良反應開展了多方面研究工作，如減少銅的暴露面積，采用銅管或鋼絲套管包繞銅線[7]。蔡水洲等研究出納米銅與低密度聚乙烯的新型納米復合材料來改善Cu2+暴釋現(xiàn)象，提高銅離子利用率[8]。Li Juan等提出了一種銅鹽與二氧化硅和聚乙烯醇的新型復合材料，消除了植入初期的暴釋[9]。由于這些研究引入了新元素或新材料，也有許多未知問題需要深入研究解決。新型超細晶銅材料制備工藝主要是通過多道次擠壓工藝改變材料晶格尺度[10]，并沒有引入新的元素或材料。本研究結果提示與傳統(tǒng)普通銅材料相比，可以降低早期Cu2+釋放峰值，縮短爆釋時間，有效緩解了Cu2+暴釋問題，進而減少和緩解由于Cu2+暴釋引起的子宮損傷等不良反應。有望能替代現(xiàn)有含銅IUD中的普通銅材料，以減少臨床應用中含銅IUD出血等不良反應。