基因可變剪切差異對蛋雞首次產(chǎn)蛋前后肝臟細(xì)胞內(nèi)吞功能的影響

李慧鋒 ，石 雄，黃 翔，張玳維，劉悅磊，張 臻，朱文進(jìn)，朱芷葳

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2.河北師范科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北昌黎 066600）

可變剪切是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白組多樣性的重要機(jī)制。真核細(xì)胞基因中存在著大量的可變剪切，動(dòng)物細(xì)胞中也存在著組織特異性[1-2]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活物1（Peroxisome Proliferator-Activated ReceptorγCoactivator 1，PGC-1）基因在動(dòng)物多個(gè)器官中有著十余種不同的可變剪切體，這些剪切體中產(chǎn)生不同蛋白，導(dǎo)致其實(shí)現(xiàn)的基因功能存在差異[3]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor，BDNF）基因在雞腦部不同部位具有多個(gè)的剪切體表達(dá)，不同可變剪切的表達(dá)可能具有影響DNA甲基化水平的功能[4]。在小鼠肝臟中，支架蛋白基因可變剪切體APPL1sv過量表達(dá)會引起肥胖和糖尿病發(fā)生，如果抑制APPL1sv的表達(dá)將會大幅度降低高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗和小鼠肝臟葡萄糖生成[5]。禽類在不同的生理功能時(shí)期也受到可變剪切這種調(diào)控方式的影響。對肌肉組織的多項(xiàng)研究表明，肌肉生長抑制素（Myostatin）基因的可變剪切可以影響雞、鴨和鵪鶉的肌纖維形成[6-8]。周敏等[9]研究得出雞血管活性腸肽受體1（Vasoactive Intestinal Peptide Receptor 1，VIPR-1）基因在4個(gè)時(shí)期6個(gè)組織中都有不同可變剪接體表達(dá)。肝臟作為各種物質(zhì)的代謝器官，對于從飼料中吸收的營養(yǎng)物質(zhì)代謝、脂類物質(zhì)合成等起重要作用。李慧鋒等[10]就蛋雞產(chǎn)蛋前后時(shí)期肝臟表達(dá)差異的基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)環(huán)脂蛋白186等一些在產(chǎn)蛋前后肝臟中表達(dá)量差異顯著的基因直接與脂類代謝有關(guān)。但哪些肝臟基因在不同的生理時(shí)期會發(fā)生可變剪切差異，以及這些基因的可變剪切差異影響肝臟的哪些功能，目前仍缺乏深入的研究。本實(shí)驗(yàn)基于蛋雞在產(chǎn)蛋前后的肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對基因的可變剪切事件、可變剪切方式在肝臟組織中不同生理時(shí)期的差異性及其與對肝臟功能的影響進(jìn)行分析，以期為禽類不同生理時(shí)期肝臟功能的調(diào)節(jié)變化在基因可變剪切差異方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為排除環(huán)境、飼料營養(yǎng)等因素對母雞開產(chǎn)前后肝臟功能差異的影響，本實(shí)驗(yàn)選用4個(gè)全同胞家系的白來航母雞，每個(gè)全同胞家系6只母雞，共24只，在完全相同的飼料營養(yǎng)和飼養(yǎng)條件下，全期單籠飼養(yǎng)，自由飲水采食。從第17周開始，每個(gè)全同胞家系中推測出的首次產(chǎn)蛋前1周和記錄的產(chǎn)蛋后1周的2個(gè)生理時(shí)期的母雞共6只，進(jìn)行屠宰取肝臟樣品并測定相關(guān)生長數(shù)據(jù)。為降低實(shí)驗(yàn)中推測產(chǎn)蛋前1周存在的判定風(fēng)險(xiǎn)，本研究通過設(shè)定冗余的全同胞家系和每個(gè)家系不少于6只母雞的辦法來確保屠宰測定的全同胞中處于產(chǎn)蛋前1周的母雞至少有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。最終，獲得符合來自3對全同胞母雞各自處于產(chǎn)蛋前1周和產(chǎn)蛋后1周的6個(gè)肝臟樣品，用于總RNA提取。

1.2 RNA樣本的提取和測序 新鮮采取的1 g肝臟樣品在盛有液氮的研缽中研磨至粉末狀，加Trizol裂解、經(jīng)氯仿和異丙醇等多步提取總RNA，沉淀于乙醇。提取的產(chǎn)蛋前和產(chǎn)蛋后2個(gè)生理階段的6只白來航蛋雞的肝臟RNA樣品送上海派森諾生物科技股份有限公司采用Illumina Hiseq高通量測序平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 測序結(jié)果分析 通過上機(jī)測序得到的原始測序數(shù)據(jù)以FASTQ格式儲存。測序所得到轉(zhuǎn)錄本序列質(zhì)量較高，將長度小于50 bp序列、序列中含有不定堿基等低質(zhì)量序列按照數(shù)據(jù)過濾。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)處理的序列片段用HISAT2軟件比對到Ensembl數(shù)據(jù)庫公布的雞參考基因組序列。

1.4 可變剪切分析 本研究使用rMATs軟件[11]對每個(gè)樣品的可變剪切事件進(jìn)行分類和表達(dá)量統(tǒng)計(jì)。rMATs為Python軟件，在終端下輸入：wget http://rnaseqmats.sourceforge.net/rmats4.0.2/index.html下載rMATs程序。使用rMATs分別按照3個(gè)生物學(xué)重復(fù)對比包含全同胞母雞的產(chǎn)蛋前后2個(gè)樣本的文件。對rMATs輸出的5種可變剪切事件的結(jié)果文件進(jìn)行對比整理，得出產(chǎn)蛋前1周和后1周母雞肝臟中發(fā)生的外顯子跳躍（Skipped Exon，SE）、外顯子互斥（Mutually Exclusive Exons，MXE）、可變5'端位點(diǎn)（Alternative 5' Splice Site，A5SS）、可變3'端位點(diǎn)（Alternative 3'Splice Site，A3SS）和內(nèi)含子保留（Retained Intron，RI）5種可變剪切事件。進(jìn)一步用rMAT軟件對可變剪切事件進(jìn)行差異分析，選取P-值的多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，將FDR＜0.05的可變剪切事件認(rèn)為是肝臟基因在產(chǎn)蛋前1周和后1周具有顯著差異的可變剪切事件，并得出發(fā)生可變剪切差異的基因列表。

1.5 獲得的可變剪切基因功能分析 應(yīng)用在線DAVID軟件[12]對發(fā)生可變剪切差異的所有基因進(jìn)行功能富集分析。富集分析得出的基因?qū)㈡溄拥終EGG、SWISSPROT等數(shù)據(jù)庫給出所涉及的代謝途徑或功能注釋信息，綜合多種結(jié)果分析與肝臟中營養(yǎng)物質(zhì)代謝相關(guān)的重要功能基因。

2 結(jié)果

在參考基因組上對比分析獲得的Reads，結(jié)果表明，產(chǎn)蛋前1周3個(gè)肝臟組織樣品讀長（Reads）比對到基因區(qū)域的Reads占所有Reads的百分比，即基因組的比對率分別為86.70%、87.05% 和87.58%，產(chǎn)蛋后1周3個(gè)肝臟樣品Reads的對比率分別為89.52%、84.38%和88.84%。這2組數(shù)據(jù)經(jīng)卡方檢驗(yàn)其P值為0.955 0，表明產(chǎn)蛋前后可變剪切的基因數(shù)量總數(shù)在基因組水平上沒有差異。分析得到可變剪切事件在產(chǎn)蛋前后分別為14 518和14 683個(gè)，涉及的基因分別為5 274個(gè)和5 337個(gè)，可變剪切涉及的基因占基因組全部已知基因的31.62%。平均每個(gè)基因有2.75個(gè)剪切體轉(zhuǎn)錄本。本文分析了雞肝臟在首次產(chǎn)蛋前后的5種可變剪切方式。由表1可見，外顯子跳躍事件最多，產(chǎn)蛋前后分別有11 669個(gè)和11 807個(gè)，5' 可變剪切位點(diǎn)事件最少，產(chǎn)蛋前后分別有325個(gè)和336個(gè)。這2組數(shù)據(jù)經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析得出產(chǎn)蛋前1周和后1周在可變剪切總量和各種可變剪切的數(shù)量上都沒有顯著差異。在雞肝臟基因表達(dá)組的可變剪切類型中，外顯子跳躍是主要剪切方式，占所有可變剪切事件80.4%，是蛋白質(zhì)形成差異的主要機(jī)制。

對rMAT結(jié)果進(jìn)行篩選，將FDR ≤0.05的事件判定為差異可變剪切事件，本次研究共發(fā)現(xiàn)20個(gè)基因在產(chǎn)蛋前后1周發(fā)生了差異可變剪切，其中1個(gè)為功能未知的長鏈非編碼RNA（ENSGALG00000053982）。在這些基因中共發(fā)現(xiàn)4種可變剪切事件在產(chǎn)蛋前后產(chǎn)生差異，各有2個(gè)基因發(fā)生了3'和5'端可變剪切位點(diǎn)事件，在內(nèi)含子保留事件中沒有找到差異的可變剪切，在選擇跳躍可變剪切類型中發(fā)生了1個(gè)差異事件，在外顯子跳躍類型中有16個(gè)差異跳躍可變剪切事件（表2）。不同的基因有著不同的剪切拼接體，其中BF2和MTTPL基因外顯子跳躍類型剪切體在產(chǎn)蛋前1周和后1周肝臟中的表達(dá)拷貝數(shù)最多。產(chǎn)蛋后BF2和MTTPL基因跳躍類型剪切體的表達(dá)量分別是產(chǎn)蛋前的3.99倍和3.47倍。產(chǎn)蛋后NAV2基因剪切體的表達(dá)量為產(chǎn)蛋前的4.83倍，但其拷貝數(shù)量較少。跳躍的剪切體拷貝數(shù)總體數(shù)量較少，多個(gè)基因的跳躍剪切體拷貝數(shù)在產(chǎn)蛋前后數(shù)量變化較小。外顯子選擇性跳躍MXE的差異基因BF2的正常剪切體拷貝數(shù)在產(chǎn)蛋后有所增加，其選擇性跳躍的剪切體拷貝數(shù)在產(chǎn)蛋后增加較大，為產(chǎn)蛋前拷貝數(shù)的4.44倍。

表1 蛋雞肝臟中可變剪切事件發(fā)生的類型與數(shù)量

表2 蛋雞肝臟中產(chǎn)蛋前后外顯子可變剪切差異的基因

應(yīng)用DAIVD分析軟件在線對所有可變剪切類型的19個(gè)已知基因進(jìn)行功能富集分析，得出細(xì)胞內(nèi)吞代謝途徑受到4個(gè)差異可變剪切基因的影響（P=0.003 9，F(xiàn)DR=0.049 0），經(jīng)KEGG代謝途徑分析，這4個(gè)基因分別是E3泛素蛋白連接酶（Neural Precursor Cell Expressed，Developmentally Down-Regulated 4，NEDD4）、E3泛素蛋白連接酶（SMAD specific E3 Ubiquitin Protein Ligase 1，SMURF1）主要組織相容復(fù)合體（Major Histocompatibility Complex Class I Antigen，BF2) 和成纖維細(xì)胞生長因子受體（Fibroblast Growth Factor Receptor，F(xiàn)GFR3）。這4個(gè)基因在細(xì)胞內(nèi)吞代謝途徑中定位于細(xì)胞膜上（圖1），它們均與肝臟細(xì)胞膜內(nèi)吞小泡的形成有著直接的關(guān)系。

3 討論

在雞的基因組上，50%～60%雞的基因存在著可變剪切現(xiàn)象，每一基因約有2.3個(gè)可變的轉(zhuǎn)錄本[13]。本次研究結(jié)果表明肝臟組織樣品讀長（Reads）與基因組的比對率最低為84.38%，說明雞肝臟的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)了所有基因中的大部分基因。這與Li等[14]報(bào)道20周齡青年雞和30周齡產(chǎn)蛋雞的基因比對率分別為83.0%和84.2%的結(jié)果較為一致。在整個(gè)基因組水平上，產(chǎn)蛋前后可變剪切的基因數(shù)量總數(shù)沒有顯著性差異。本研究得到的可變剪切事件在產(chǎn)蛋前后分別為14 518個(gè)和14 683個(gè)，涉及的基因分別為5 274個(gè)和5 337個(gè)，可變剪切涉及的基因占基因組全部已知基因的31.62%，這一結(jié)果與Tang等[13]的報(bào)道差異較大，主要由于其所做的生物信息學(xué)研究分析了2005年GenBank中的雞胚胎和成年雞器官的EST序列，樣品來源廣泛，其中涉及肝臟的樣品有7個(gè)，共6 124條EST序列。本實(shí)驗(yàn)得到的肝臟數(shù)據(jù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于當(dāng)時(shí)的數(shù)據(jù)量，可得出肝臟中的可變剪切涉及的基因數(shù)要比Tang等所預(yù)計(jì)的較少，同時(shí)，不同組織中的可變剪切基因也存在差異。平均每個(gè)基因有2.75個(gè)剪切體轉(zhuǎn)錄本。對比雞基因組2018年3月的組裝序列GRCg6a，16 878個(gè)確定的基因，基因轉(zhuǎn)錄本39 288個(gè)，平均每個(gè)基因有2.33個(gè)剪切體轉(zhuǎn)錄本。說明可變剪切在肝臟中發(fā)生的可變剪切事件比整個(gè)基因組上發(fā)生的可變剪切頻率高。

本研究得出雞肝臟中存在著各種可變剪切的類型，主要類型為外顯子跳躍，這種剪切類型占到所有可變剪切類型的80.4%。在雞產(chǎn)蛋前后1周肝臟中差異可變剪切的20個(gè)基因中，發(fā)生外顯子跳躍的基因有16個(gè)。Li等[14]報(bào)道20周齡青年雞和30周齡產(chǎn)蛋雞肝臟的可變剪切類型主要為內(nèi)含子滯留（RI32%）和外顯子跳躍（SE24%）?？赡軆煞矫嬖?qū)е铝诉@2個(gè)研究的結(jié)果不同：首先是可變剪切情況較為復(fù)雜，肝臟轉(zhuǎn)錄組中實(shí)際存在的可變剪切形式較多，不同分析軟件由于編譯的算法之間不同導(dǎo)致得出的結(jié)果存在著一定差異；其次為樣本差異，本研究采用全同胞設(shè)計(jì)，在首次產(chǎn)蛋前1周和后1周選取的肝臟樣品來源于1對全同胞姐妹，盡可能降低了樣本個(gè)體之間的差異。

本研究用rMAT軟件分析得出20個(gè)差異的可變剪切基因，通過對除去功能未知的長鏈非編碼RNA以外19個(gè)差異剪切基因進(jìn)行功能富集分析，得出產(chǎn)蛋前后1周有4個(gè)可變剪切差異基因涉及細(xì)胞內(nèi)吞作用的代謝途徑。細(xì)胞內(nèi)吞（Endocytosis）是從細(xì)胞表面除去配體、營養(yǎng)物質(zhì)、質(zhì)膜蛋白和脂質(zhì)，并將這些大分子物質(zhì)或其他物質(zhì)（如細(xì)菌病毒等）包被成為囊泡進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的方式。大部分物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的主要途徑是網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞，這種類型細(xì)胞內(nèi)吞在組織器官的發(fā)育過程中對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有至關(guān)重要的作用。細(xì)胞內(nèi)吞作用涉及到細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、細(xì)胞生長和分化、神經(jīng)突觸的活化和傳遞、細(xì)胞趨化以及免疫反應(yīng)等多種細(xì)胞生理活動(dòng)[15]。

在4個(gè)涉及細(xì)胞內(nèi)吞作用的可變剪切差異基因中，有2個(gè)是E3泛素蛋白連接酶基因NEDD4和SMURF1，這2個(gè)基因均屬于HECT（Homologous to E6AP C Terminus）家族的基因，該家族具有HECT結(jié)構(gòu)域，其中保守的Cys殘基可與E2泛素偶聯(lián)酶攜帶的泛素形成硫酯鍵，E2先將泛素傳遞給E3，再由E3傳遞給底物。NEDD4蛋白可以通過與其C2結(jié)構(gòu)域與網(wǎng)格蛋白γ2高親和力的結(jié)合使網(wǎng)格蛋白γ2泛素化來誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞作用[16]。成纖維細(xì)胞生長因子3（Fibroblast Growth Factor Receptor 3，F(xiàn)GFR3）蛋白能夠介導(dǎo)網(wǎng)格蛋白依賴和非依賴型的細(xì)胞內(nèi)吞，但FGFR3誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)持續(xù)的時(shí)間比FGFR1誘導(dǎo)的時(shí)間短[17]。

主要組織相容性復(fù)合體MHC-II參與的細(xì)胞內(nèi)吞代謝途徑是由一種稱為分子伴侶恒定鏈(Invariantchain，Ii)蛋白的引導(dǎo)，使細(xì)胞表面MHC-II與網(wǎng)格蛋白等形成復(fù)合體一起內(nèi)化，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中組裝并向內(nèi)質(zhì)體運(yùn)輸，交換內(nèi)質(zhì)體中的抗原肽，并迅速循環(huán)回質(zhì)膜[18]。MHC抗原BF2有5種SE可變剪切形式，同時(shí)還有一種MXE可變剪切形式，這些可變剪切表達(dá)的剪切體形式在產(chǎn)蛋前1周到產(chǎn)蛋后1周的表達(dá)拷貝數(shù)都是增加的，其中1種可變剪切體的表達(dá)拷貝數(shù)從1 698升高到6 772，產(chǎn)蛋后1周的絕對量為產(chǎn)蛋前的3.98倍，MXE正常外顯子連接剪切體拷貝數(shù)在產(chǎn)蛋前后分別為6 956和7 990，升高1.15倍，其跳躍連接剪切體拷貝數(shù)則從924拷貝升到4 103拷貝，有4.44倍的變化。不同的剪切體在不同組織中表達(dá)，其功能可能存在著一定差異。雞肝臟不同生理時(shí)期的1-?；视?3-磷酸O-?；D(zhuǎn)移酶2（1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 2，AGPAT2）基因研究表明，該基因的2個(gè)轉(zhuǎn)錄本能夠在不同程度上促進(jìn)磷脂酸以及甘油三酯的合成[19]。Han等[20]采用定量PCR技術(shù)研究了珍珠雀卵黃蛋白原/ 低密度脂蛋白受體 (Vitellogenin/Very Low Density Lipoprotein Receptor，VTG/VLDL-R)mRNA在不同組織和卵母細(xì)胞生長不同階段的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VTG/VLDL-RmRNA在卵黃原卵母細(xì)胞和骨骼肌中高水平表達(dá)短型LR8-型剪切體，而在肝臟和骨骼肌中也可檢測到不同的LR8+型剪切體。這種組織間的不同剪切體差異是如何被調(diào)控的，以及這些差異是否會影響該VTG/VLDL-R功能的實(shí)現(xiàn)或者VTG/VLDL-R功能在效率上是否有差異等問題仍需進(jìn)一步研究。

MHCBF2基因剪切體拷貝數(shù)增加說明肝細(xì)胞的胞吞作用在產(chǎn)蛋后比產(chǎn)蛋前有所增強(qiáng)。肝臟細(xì)胞通過增加胞吞作用加速一些營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入肝臟細(xì)胞，快速合成大量產(chǎn)蛋所需的各類物質(zhì)，以滿足生理狀態(tài)變化的需要。在雌激素控制下，肝臟中合成這些卵黃化合物在雞性成熟時(shí)被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。產(chǎn)蛋開始后，大量卵黃脂質(zhì)和蛋白質(zhì)前體在肝臟合成，然后分泌到血液中，到達(dá)卵巢，轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞中。有研究表明肝臟中合成和分泌的脂蛋白和大多數(shù)卵黃前體蛋白也是通過卵母細(xì)胞表面特定受體的內(nèi)吞過程被卵母細(xì)胞所吸收[21]。在肝臟中，雞性成熟時(shí)肝臟載脂蛋白的表達(dá)增加40倍，開產(chǎn)蛋雞的肝臟脂肪生成和血脂比青年雞分別增加了15倍和20倍[22-23]。肝臟細(xì)胞內(nèi)吞作用在脂肪合成代謝中所起的作用有著十分重要的研究價(jià)值。

本研究得到蛋雞在產(chǎn)蛋前后肝臟轉(zhuǎn)錄組中的可變剪切差異基因，這些基因涉及了多種肝細(xì)胞的功能，其中細(xì)胞內(nèi)吞作用受到了多個(gè)可變剪切差異基因的影響。本研究中得到的可變剪切差異基因不同的剪切體及其表達(dá)的拷貝數(shù)可能會影響到物質(zhì)通過胞吞作用進(jìn)入肝臟細(xì)胞的效率。這些可變剪切是否通過胞吞作用影響肝臟細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)（如脂類、糖類物質(zhì)）的吸收和傳化還需在細(xì)胞水平上進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究得出雞肝臟中的基因表達(dá)在產(chǎn)蛋前后存在著各種可變剪切的類型，主要類型為外顯子跳躍。蛋雞部分肝臟基因表達(dá)的可變剪切方式也在其首次產(chǎn)蛋前1周和產(chǎn)蛋后1周發(fā)生了較大變化，比起基因表達(dá)量差異的變化，基因可變剪切方式的變化在總體數(shù)量上較少。在蛋雞首次產(chǎn)蛋前后，4個(gè)定位于細(xì)胞膜上的可變剪切體表達(dá)差異基因NEDD4、SMURF1、BF2和FGFR3通過細(xì)胞內(nèi)吞代謝途徑影響了肝臟對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。本研究可以為基因表達(dá)層面上研究產(chǎn)蛋前后肝臟生理功能和深入理解肝臟細(xì)胞內(nèi)吞作用對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)化提供一些剪切體功能研究基礎(chǔ)。

致謝：本研究在試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)動(dòng)物等方面得到了中國農(nóng)業(yè)大學(xué)楊寧和李俊英等多位老師的幫助，在轉(zhuǎn)錄組分析部分得到了山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李旭凱老師的幫助。在此對所有幫助過此項(xiàng)試驗(yàn)工作的老師和同學(xué)表示衷心的感謝！