哺乳動(dòng)物GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍研究進(jìn)展

張培培 ，郝海生，杜衛(wèi)華，龐云渭，權(quán)國(guó)波，趙善江，朱化彬，趙學(xué)明*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，家畜胚胎工程與繁殖創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，北京 100193；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明 650224）

近年來(lái)，哺乳動(dòng)物GV期卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍保存技術(shù)取得很大進(jìn)展，但在冷凍過(guò)程中也遇到很多問(wèn)題。冷凍保護(hù)劑和冷凍-解凍過(guò)程均會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞產(chǎn)生損害，影響卵母細(xì)胞存活及其發(fā)育能力[1]。前期研究表明，冷凍GV期卵母細(xì)胞會(huì)引起許多異?，F(xiàn)象，如膜完整性喪失、皮質(zhì)顆粒的分布改變、減數(shù)分裂紡錘體的混亂或消失，這可能導(dǎo)致染色體分散，非整倍性或多倍性[2-3]，同時(shí)，玻璃化冷凍對(duì)GV期卵母細(xì)胞表觀遺傳也會(huì)產(chǎn)生一定影響。本文綜述了近年來(lái)哺乳動(dòng)物GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的研究進(jìn)展，并對(duì)冷凍損傷及對(duì)策進(jìn)行了系統(tǒng)分析，為哺乳動(dòng)物GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的后續(xù)研究提供參考。

1 GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存的意義

1.1 家畜GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的意義 在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，GV期是卵母細(xì)胞在其細(xì)胞質(zhì)中積累蛋白質(zhì)和母體mRNA的一個(gè)階段，被稱為“分子成熟”的過(guò)程，當(dāng)卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄失活時(shí)，能夠促進(jìn)成熟卵母細(xì)胞受精后細(xì)胞周期的進(jìn)展[4]。冷凍保存GV期卵母細(xì)胞可提供穩(wěn)定的卵母細(xì)胞來(lái)源，建立卵子庫(kù)，提高了卵母細(xì)胞的利用率，對(duì)季節(jié)性繁殖動(dòng)物非常重要[5]。同時(shí)，GV期卵母細(xì)胞冷凍保存可用于瀕危物種遺傳物質(zhì)保存，是維持家畜遺傳資源多樣性的重要手段。

1.2 人類GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的意義 冷凍保存GV期卵母細(xì)胞可滿足不孕病人生育子女的要求。在人類輔助生殖中，GV期卵母細(xì)胞的冷凍保存具有一些臨床優(yōu)勢(shì)，玻璃化冷凍GV期卵母細(xì)胞可減少藥物對(duì)卵巢的刺激作用，降低卵巢過(guò)度刺激綜合征和激素敏感性惡性腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[6]。此外，經(jīng)過(guò)化學(xué)療法或放射療法治療的患者無(wú)法獲得正常的卵母細(xì)胞，而在化療或放療之前將GV期卵母細(xì)胞冷凍保存則可有效解決該問(wèn)題[7]，因此在輔助生殖醫(yī)學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。

1.3 動(dòng)物GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的優(yōu)勢(shì) 與MII期卵母細(xì)胞相比，GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，主要是因?yàn)镚V期卵母細(xì)胞處于減數(shù)分裂的雙線期，尚未形成紡錘體，染色體解聚在核膜內(nèi)，可有效避免玻璃化冷凍MII期卵母細(xì)胞所導(dǎo)致的紡錘體解聚、染色體失活、多倍體和非整倍體的形成等問(wèn)題[8]。

2 GV期卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍保存

自從1998年第一例GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍取得成功以來(lái)，玻璃化冷凍GV期卵母細(xì)胞在人[9]、小鼠[10]、豬[11]均取得了成功，并獲得了后代。

2.1 玻璃化冷凍小鼠GV期卵母細(xì)胞 研究表明，小鼠GV期卵母細(xì)胞采用不同冷凍方法其冷凍效率差距較大。以細(xì)管為冷凍工具對(duì)小鼠GV期卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍，采用二步法較一步法有更高的存活率（88.96%）和成熟率（73.23%）[12]。Nazmara等[13]用Cryotop法冷凍小鼠GV期卵母細(xì)胞，體外成熟（IVM）、體外受精（IVF）后得到24.75%的囊胚率。最小體積法能夠控制冷凍液滴的體積，可提高冷凍效率，用該方法冷凍小鼠GV期卵母細(xì)胞的囊胚率高達(dá)42.9%[10]。

2.2 玻璃化冷凍人GV期卵母細(xì)胞 研究表明，人GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后能夠完成細(xì)胞核成熟并受精[14]。人GV卵母細(xì)胞采用封閉式細(xì)管法和開(kāi)放式拉管（OPS）玻璃化冷凍時(shí)，解凍后成熟率分別為51%[15]、71%[16]，OPS法的冷凍速率較高且可減少細(xì)胞毒性損害。

2.3 玻璃化冷凍豬GV期卵母細(xì)胞 雖然豬卵母細(xì)胞對(duì)冷凍保存很敏感，但豬GV期卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍后仍具有在IVM期間完成細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟的能力。Bali等[17]用OPS玻璃化法冷凍豬GV期卵母細(xì)胞，成熟率為54.5%，用固體表面冷凍法（SSV）得到53%的成熟率[18]。Somfai等[11]對(duì)豬GV期卵母細(xì)胞冷凍保存成功獲得了后代。

2.4 玻璃化冷凍牛和綿羊GV期卵母細(xì)胞 至今為止，許多研究使用多種不同的玻璃化方法成功保存了牛的GV期卵母細(xì)胞，用OPS玻璃化冷凍牛GV期卵母細(xì)胞后囊胚率為6.1%[19]，Cryotop法冷凍時(shí)的囊胚率達(dá)到7.3%[20]。Abe等[21]用尼龍網(wǎng)冷凍工具冷凍牛GV期卵母細(xì)胞成功生出小牛，尼龍網(wǎng)面積大，有利于冷凍細(xì)胞的恢復(fù)和減少細(xì)胞損傷。

對(duì)于綿羊GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍而言，用SSV玻璃化法時(shí)成熟率為23.7%、囊胚率5.4%[22]，而采用Cryoloop法冷凍時(shí)成熟率為43.4%、IVF后卵裂率為42.9%，囊胚率為29.4%[5]。

2.5 玻璃化冷凍單峰駱駝和馬GV期卵母細(xì)胞 采用Cryotop玻璃化法對(duì)單峰駱駝GV期卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍成熟率為51.8%、囊胚率6.4%[23]，Moawad等[24]用40%EG+40% DMSO的冷凍保護(hù)劑達(dá)到58.95%的成熟率。

研究表明玻璃化法冷凍馬GV期卵母細(xì)胞，ICSI后卵裂率為55.6%～90.4%，囊胚率11.1%～34.6%[25-26]，不同的抗凍保護(hù)劑可能是導(dǎo)致其效率差異較大的原因。

3 GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存面臨的問(wèn)題

3.1 玻璃化冷凍對(duì)GV期卵母細(xì)胞細(xì)胞器的損傷

3.1.1 紡錘體和染色體 紡錘體和染色體都是卵母細(xì)胞必不可少的細(xì)胞器，可以反映核成熟的狀態(tài)。紡錘體是在卵母細(xì)胞中期出現(xiàn)的一種獨(dú)特的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，染色體排列在位于紡錘體中心的致密的赤道板上，紡錘體畸變與染色體多倍體和非整倍體有關(guān)[27]。

研究表明，人GV期卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍、IVM之后，紡錘體和染色體的異常發(fā)生率分別達(dá)到78.9%和84.2%，較新鮮組（45%、50%）相比均提高30%左右[28]。同時(shí)，玻璃化冷凍也會(huì)導(dǎo)致馬[29]的GV期卵母細(xì)胞IVM后紡錘體異常，破壞了卵母細(xì)胞核周圍卵丘細(xì)胞的間隙連接。玻璃化冷凍小鼠GV期卵母細(xì)胞，IVM后卵母細(xì)胞染色體非整倍率增加[30]。

3.1.2 皮質(zhì)顆粒（CG）和線粒體 CG是卵母細(xì)胞胞質(zhì)中的另一種重要細(xì)胞器，其遷移與卵母細(xì)胞成熟密切相關(guān)，是影響卵母細(xì)胞發(fā)育能力的重要因素，在GV期CG均勻分布在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，到MII期CG向外周遷移，玻璃化冷凍會(huì)引起CG提前釋放導(dǎo)致透明帶硬化，還會(huì)使細(xì)胞皺縮衰老變形。解凍會(huì)引發(fā)膜溶解，改變細(xì)胞膜通透性，使酶釋放，降低了卵母細(xì)胞受精率[31]。也有研究表明冷凍不會(huì)影響豬GV期卵母細(xì)胞IVM后的CG分布，說(shuō)明冷凍豬GV期卵母細(xì)胞內(nèi)的CG能夠正常完成遷移[3]。

線粒體是細(xì)胞質(zhì)中最重要的細(xì)胞器之一。線粒體通過(guò)產(chǎn)生ATP、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定在卵母細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮重要作用。一些研究表明，卵母細(xì)胞的線粒體形態(tài)會(huì)受到玻璃化冷凍的影響，線粒體損傷或線粒體分布的變化可能對(duì)卵母細(xì)胞的活力和發(fā)育產(chǎn)生較大影響[32]。關(guān)于玻璃化冷凍對(duì)哺乳動(dòng)物GV期卵母細(xì)胞線粒體分布的影響，存在物種差異。研究表明，玻璃化冷凍不會(huì)對(duì)小鼠[13]和人[33]GV期卵母細(xì)胞線粒體分布造成顯著影響，但會(huì)造成銀狐線粒體分布異常率高達(dá)64.6%[32]。

3.2 玻璃化冷凍對(duì)GV期卵母細(xì)胞蛋白的影響 研究表明，玻璃化冷凍綿羊GV期卵母細(xì)胞的IVM后，有62.9%的卵母細(xì)胞沒(méi)有恢復(fù)減數(shù)分裂并停留在GV期，這可能是由于冷凍后蛋白質(zhì)合成異常造成的[34]。關(guān)于玻璃化冷凍對(duì)哺乳動(dòng)物GV期卵母細(xì)胞蛋白影響的研究較多，主要分為以下幾個(gè)方面。

3.2.1 細(xì)胞骨架、β-肌動(dòng)蛋白、縫隙連接蛋白 細(xì)胞骨架的穩(wěn)定對(duì)卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的成功至關(guān)重要，微管和細(xì)胞骨架纖維可以保護(hù)卵母細(xì)胞免受低溫?fù)p傷[35]。玻璃化冷凍牛GV卵母細(xì)胞導(dǎo)致12個(gè)基因顯著上調(diào)和19個(gè)基因下調(diào)，基于分子功能基因GO分析和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析，差異表達(dá)的基因與細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、凋亡有關(guān)，玻璃化冷凍導(dǎo)致牛GV期卵母細(xì)胞體外發(fā)育的降低[36]。

β-肌動(dòng)蛋白（ACTB）是細(xì)胞骨架蛋白之一，參與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、結(jié)構(gòu)和完整性。玻璃化冷凍牦牛GV期卵母細(xì)胞解凍后卵母細(xì)胞中ACTB的表達(dá)顯著降低，導(dǎo)致卵母細(xì)胞存活率降低[37]。

縫隙連接蛋白a1（GJA1）是參與組裝間隙連接通道的蛋白之一，可以將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞，維持其生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，也被認(rèn)為是卵母細(xì)胞受精潛能和胚胎質(zhì)量的基因標(biāo)志物[38]。研究表明玻璃化冷凍牦牛GV期卵母細(xì)胞解凍后卵母細(xì)胞中GJA1的表達(dá)顯著降低[37]。

3.2.2 卵母細(xì)胞成熟因子（MPF）和環(huán)磷酸腺苷（cAMP）MPF是細(xì)胞周期中重要的調(diào)節(jié)減數(shù)分裂的因子，在減數(shù)分裂成熟過(guò)程中起主導(dǎo)作用。MPF是細(xì)胞周期控制基因蛋白p34cdc2與細(xì)胞周期蛋白B組成的復(fù)合體。MPF活性降低是玻璃化GV期卵母細(xì)胞發(fā)育能力降低的原因之一[39]。

cAMP作為促性腺激素刺激的細(xì)胞內(nèi)信使，在卵母細(xì)胞中合成，并通過(guò)縫隙連接由卵丘細(xì)胞提供給卵母細(xì)胞。玻璃化冷凍GV期卵母細(xì)胞導(dǎo)致卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP水平下降，IVM后MPF和促細(xì)胞分裂激活蛋白酶（MAPK）的活性降低，說(shuō)明冷凍GV期卵母細(xì)胞導(dǎo)致參與激酶活性調(diào)控的信號(hào)通路的分子降解[39]。

3.2.3 卵母細(xì)胞受精蛋白 CD9和CD81蛋白是哺乳動(dòng)物受精所必需的，這2種四聚體蛋白在精卵膜融合中起關(guān)鍵作用。CD9在卵母細(xì)胞早期生長(zhǎng)和減數(shù)分裂成熟過(guò)程中表達(dá)，缺乏CD9會(huì)使卵母細(xì)胞的膜融合能力喪失，嚴(yán)重降低其生育能力[3]。CD81在卵母細(xì)胞表面表達(dá)，小鼠的CD81基因缺失導(dǎo)致生育力下降40%[40]。玻璃化冷凍牛GV期卵母細(xì)胞改變了其受精相關(guān)基因CD9和CD81的mRNA表達(dá)，導(dǎo)致成熟率，受精率降低，發(fā)育能力下降[41]。玻璃化冷凍豬GV期卵母細(xì)胞[3]經(jīng)IVM后CD9蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有降低，其受精能力未受到影響。

3.2.4 細(xì)胞角蛋白（CK）CK是上皮細(xì)胞中的主要結(jié)構(gòu)蛋白細(xì)胞，也存在于卵母細(xì)胞和早期胚胎中，在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中維持細(xì)胞完整性[42]。CK在卵母細(xì)胞中的分布模式是根據(jù)其核的結(jié)構(gòu)重組的，從GV期的皮質(zhì)模式到MII期的顆粒模式，CK的微絲網(wǎng)絡(luò)從GV期延伸到MII期。玻璃化冷凍小鼠GV期卵母細(xì)胞CK分布受到干擾，成熟到MII期不能形成顆粒狀分布。玻璃化過(guò)程中劇烈的溫度變化會(huì)CK微絲造成損害，使GV期卵母細(xì)胞缺乏完整的微絲網(wǎng)絡(luò)[43]。

3.3 玻璃化冷凍對(duì)GV期卵母細(xì)胞表觀遺傳的影響 表觀遺傳修飾對(duì)胚胎發(fā)育至關(guān)重要，主要的表觀遺傳重編程發(fā)生在配子和胚胎發(fā)育早期。玻璃化冷凍卵母細(xì)胞會(huì)改變細(xì)胞DNA甲基化，導(dǎo)致表觀遺傳發(fā)生異常，降低卵母細(xì)胞的發(fā)育能力[44]。DNA甲基化是參與胚胎生長(zhǎng)和發(fā)育的表觀遺傳修飾的主要機(jī)制之一，對(duì)印跡基因的活性狀態(tài)和抑制狀態(tài)的調(diào)控和維持具有重要的影響[45]。

3.2.1 單個(gè)基因甲基化 H19DMR和KvDMR1位于人類染色體11p15.5上，H19DMR在父親等位基因上甲基化，調(diào)控H19和IGF2基因的表達(dá)，這2種基因在調(diào)節(jié)胎兒生長(zhǎng)方面起著關(guān)鍵作用[46]。研究表明，玻璃化冷凍人GV期卵母細(xì)胞，解凍后體外成熟不會(huì)對(duì)H19DMR和KvDMR1造成影響[47]。

3.2.2 DNA甲基化 全基因組DNA甲基化與全基因組胞嘧啶的甲基化有關(guān)，包括印跡基因胞嘧啶-磷酸鹽-鳥嘌呤（CpG）位點(diǎn)的胞嘧啶、重復(fù)序列和一些非CpG位點(diǎn)的胞嘧啶[48]。研究表明，玻璃化冷凍小鼠GV期卵母細(xì)胞不會(huì)影響其MII卵母細(xì)胞全基因組DNA甲基化的建立[49]，玻璃化冷凍人GV期卵母細(xì)胞也不會(huì)影響其MII卵母細(xì)胞全基因組DNA甲基化的模式[29]。

4 提高GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍效率的方法

4.1 甘氨酸處理 研究表明，小鼠GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍過(guò)程中，采用1 mmol/L甘氨酸處理可降低IVM后卵母細(xì)胞的早期凋亡比例，提高IVF后囊胚率[50]。冷凍水貂GV期卵母細(xì)胞時(shí)，在玻璃化培養(yǎng)基中添加甘氨酸可以減少冷凍對(duì)線粒體的損傷，在玻璃化和成熟培養(yǎng)基中添加甘氨酸可以促進(jìn)細(xì)胞核成熟率，且添加甘氨酸組的染色體正常分布率和皮質(zhì)區(qū)正常分布率均高于未添加組[51]。由此可見(jiàn)，甘氨酸處理可提高玻璃化冷凍GV期卵母細(xì)胞的成熟率及其隨后的胚胎發(fā)育能力。

4.2 含膽固醇的β甲基環(huán)糊精（CLC）處理 在培養(yǎng)基中添加膽固醇可通過(guò)改變膜磷脂相互作用的方式，提高膜在較低溫度下的流動(dòng)性，使膜在較低溫度下收縮得更少，用CLC處理冷凍GV期卵母細(xì)胞DNMT3A、BAX表達(dá)水平與新鮮GV期卵母細(xì)胞相似[20]。該研究表明，添加CLC可減少玻璃化冷凍的GV期卵母細(xì)胞細(xì)胞膜損傷，有助于提高胚胎質(zhì)量。

4.3 抗凍蛋白 抗凍蛋白(AFP)是一類多肽，存在于南極魚類、昆蟲和植物的組織和血液中，可使組織在低溫環(huán)境中存活[52]。AFP可在GV期階段保持紡錘體、染色體和膜完整性，在玻璃化培養(yǎng)基中添加AFP對(duì)冷凍小鼠GV期卵母細(xì)胞有保護(hù)作用，促進(jìn)其對(duì)冷凍損傷的抵抗力[52]。用AFP處理冷凍GV期卵母細(xì)胞的抗凋亡基因Bcl2表達(dá)增加，提高了冷凍GV期卵母細(xì)胞的存活率、卵裂率和囊胚率[53]。由此可見(jiàn)，在玻璃化冷凍GV期卵母細(xì)胞過(guò)程中添加AFP可減少其冷凍損傷、提高發(fā)育能力。

5 展 望

近年來(lái)，隨著社會(huì)對(duì)于優(yōu)良家畜種質(zhì)資源保存以及人類生殖力保存的日益重視，哺乳動(dòng)物GV期卵母細(xì)胞的研究必將日益深入。玻璃化冷凍會(huì)對(duì)GV期卵母細(xì)胞在細(xì)胞生物學(xué)和分子遺傳學(xué)乃至表觀遺傳學(xué)方面造成影響，這也成為今后本領(lǐng)域的研究方向。隨著上述問(wèn)題的解決，將有助于推動(dòng)玻璃化冷凍GV期卵母細(xì)胞的廣泛應(yīng)用，從而為畜牧業(yè)和人類社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)保障。