熱休克蛋白70在細(xì)胞凋亡途徑中的作用研究進(jìn)展

劉松松，項(xiàng) 陽，王 劍

（西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶 400715）

細(xì)胞凋亡的概念被提出是用于描述形態(tài)學(xué)上不同的細(xì)胞死亡方式[1-2]。細(xì)胞凋亡是生命延續(xù)中不可缺少的環(huán)節(jié)，通常發(fā)生在生長、發(fā)育和衰老期間，細(xì)胞凋亡清除機(jī)體內(nèi)受損和（或）多余代謝產(chǎn)物，有利于維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，在胚胎發(fā)育、機(jī)體穩(wěn)態(tài)和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中起主要作用。另外，細(xì)胞凋亡是由熱應(yīng)激、缺氧、DNA損傷或細(xì)胞毒性等誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡[3]。細(xì)胞凋亡是一個(gè)極其復(fù)雜的、精確調(diào)控的、蛋白酶及能量依賴的分子級聯(lián)反應(yīng)過程[4-6]。熱休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）是原核生物和真核生物中一種高度保守蛋白，HSP70作為HSP家族普通的一員，其通過多種方式干擾凋亡機(jī)制防止細(xì)胞凋亡。

目前為止，研究證明存在多種凋亡途徑，外在（死亡受體）途徑和內(nèi)在（線粒體）途徑是主要的凋亡過程，均由半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族介導(dǎo)。2種途徑的信號傳導(dǎo)歸功于Caspase-3水平，Caspase-3是一種效應(yīng)Caspase，并且一條途徑中促凋亡蛋白Bid分子可以影響另外一條途徑[7]。另外，還有一種細(xì)胞凋亡途徑是穿孔素/顆粒酶介導(dǎo)信號通路，由具有細(xì)胞毒性的T細(xì)胞介導(dǎo)對細(xì)胞有穿孔性的死亡途徑，主要通過顆粒酶A或顆粒酶B導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。除了以上幾種凋亡途徑，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體在細(xì)胞凋亡中也起著重要決定作用，稱之為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族而引起的細(xì)胞凋亡，而溶酶體主要受到H2O2鞘氨醇的刺激產(chǎn)生抗凋亡蛋白組織蛋白酶（Cathepsin），從而抑制線粒體膜上Bcl家族表達(dá)。雖然這些導(dǎo)致凋亡途徑不同，但最后都會由相同的凋亡執(zhí)行者Caspase酶家族來完成凋亡。本文綜述了HSP70對以上幾種細(xì)胞凋亡途徑的研究進(jìn)展。

1 細(xì)胞凋亡的途徑

1.1 內(nèi)在途徑 細(xì)胞凋亡的內(nèi)在信號傳導(dǎo)途徑涉及多種非受體介導(dǎo)的刺激，直接作用于細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)，主要以線粒體為主。線粒體途徑既是多種促凋亡信號級聯(lián)或損傷的傳導(dǎo)者，又是機(jī)體代謝的協(xié)調(diào)者，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激因子作用，如熱應(yīng)激、缺氧、DNA損傷等，會導(dǎo)致線粒體膜電位穩(wěn)態(tài)被破壞、通透性增加，線粒體膜內(nèi)的促凋亡因子釋放到胞質(zhì)，激活線粒體途徑，引起細(xì)胞凋亡。這些蛋白主要是B細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血病原癌基因2（B-cell lymphocyticleukaemia proto-oncogene 2，Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)蛋白[7]。其中一種釋放的膜間蛋白是細(xì)胞色素c（Cytochrome c，Cyt c），進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)就會與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apoptotic Protease Activation Factor-1，Apaf-1）發(fā)生作用，從而觸發(fā)Apaf-1的ATP依賴性寡聚化而暴露出Caspase募集結(jié)構(gòu)域（Caspase Recruitment domain，CARD）[8]。最終活化的結(jié)構(gòu)與前Caspase-9相互作用形成凋亡體，即Caspase-3激活復(fù)合物[9]。另外釋放的蛋白質(zhì)有黃素蛋白細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（Apoptosis Inducing Factor，AIF）、第二線粒體源性Caspase激活劑（Second Mitochondria Derived Activator of Caspase，Smac或DIABLO）和Htra2/Omi，這些蛋白將會抑制抑制凋亡蛋白（Inhibitory Apoptotic Proteins，IAPs）的活性[10-11]。Smac/DIABLO被認(rèn)為是多種癌細(xì)胞中重要調(diào)節(jié)因子，這些因子的釋放也能調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。例如，Smac在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肌細(xì)胞（如C2C12肌源性細(xì)胞和心肌細(xì)胞）凋亡中起重要作用[12-13]。

1.2 外在途徑 細(xì)胞凋亡的外在信號傳導(dǎo)途徑涉及跨膜受體介導(dǎo)的相互作用。外在途徑是由死亡受體的腫瘤壞死因子（Tumour Necrosis Factor，TNF）受體家族的質(zhì)膜蛋白觸發(fā)并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。TNF家族的成員都具有一個(gè)相同的結(jié)構(gòu)域，稱為“死亡結(jié)構(gòu)域（Death Domain，DD）”，DD包括的配體和受體有FasL/FasR、TNF-α/TNFR1、Apo3L/DR3、Apo2L/DR4和Apo2L/DR5[14-15]。DD的功能是將細(xì)胞外信號傳到細(xì)胞內(nèi)，DD與細(xì)胞溶質(zhì)蛋白TNF受體死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TNF Receptor Death Domain Protein，TRADD）或Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（Fas Associated Death Domain Protein，F(xiàn)ADD）的DD相互作用。配體和受體的結(jié)合導(dǎo)致銜接蛋白TRADD與FADD和RIP的募集結(jié)合[16]。最后FADD通過死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的二聚體與前體Caspase-8結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）并導(dǎo)致前體Caspase-8活化，引起細(xì)胞凋亡[17-18]。

1.3 穿孔素/顆粒酶途徑 T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性是IV型超敏反應(yīng)的變體，通過激活CD8+細(xì)胞可以殺死攜帶抗原的細(xì)胞。這些細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（Cytotoxic T Lymphocytes，CTLs）能夠通過外在途徑殺死靶細(xì)胞，F(xiàn)asL/FasR相互作用是誘導(dǎo)CTL細(xì)胞凋亡的主要方法。然而，CTL可通過腫瘤細(xì)胞和感染細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，即CTL生成的穿孔素作用于細(xì)胞膜，使其產(chǎn)生穿孔蛋白通道，然后向胞內(nèi)釋放細(xì)胞質(zhì)顆粒，顆粒酶A和顆粒酶B是這些顆粒的主要物質(zhì)。顆粒酶是絲氨酸蛋白酶家族的成員，其中顆粒酶B是一種32 ku的蛋白，可誘導(dǎo)多種組織的細(xì)胞凋亡，并代表自然殺傷細(xì)胞（Natural Killer Cell，NK）和CTL的細(xì)胞毒性顆粒的關(guān)鍵組分[19-20]。其中顆粒酶A途徑是通過對DNA損傷，并且不依賴Caspase的細(xì)胞死亡途徑[21]。顆粒酶B所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑主要經(jīng)由激活Caspase-10和Caspase-7而誘導(dǎo)Caspase酶的活化，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。盡管位于CTL和NK細(xì)胞內(nèi)部的顆粒酶具有細(xì)胞溶解作用，但非免疫細(xì)胞（顆粒細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和支持細(xì)胞）中的許多顆粒酶變體具有非凋亡的細(xì)胞外功能，如誘導(dǎo)炎癥和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[22]。例如，睪丸中顆粒酶的過表達(dá)將會從生精小管腔過早釋放圓形精子，最終調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞凋亡[23]。穿孔素是膜攻擊復(fù)合物/穿孔素/膽固醇依賴性溶血素超家族的一部分[24]。穿孔素是一種成孔蛋白，在CTL和NK細(xì)胞中表達(dá)，并與促凋亡絲氨酸蛋白酶顆粒酶通過胞吐作用分泌并一起誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡。顆粒-胞吐作用途徑激活凋亡Caspase的細(xì)胞死亡途徑，但它也能在Caspase沒有被激活的情況下導(dǎo)致細(xì)胞死亡。然而，它們還能夠通過一種新的途徑對不正常的細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，這種途徑主要是分泌跨膜孔形成分子穿孔素，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另外還包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體途徑導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族而引起的細(xì)胞凋亡。最新研究發(fā)現(xiàn)，還可以通過調(diào)控抗凋亡蛋白的轉(zhuǎn)化效率控制細(xì)胞凋亡，如使eIF2α大量磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞變異蛋白蓄積，從而降低BclxL等抗凋亡因子表達(dá)效率，最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[25]。熱應(yīng)激下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ca2+受到影響從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。溶酶體主要受到H2O2鞘氨醇的刺激產(chǎn)生抗凋亡蛋白組織蛋白酶，從而抑制線粒體膜上Bcl家族表達(dá)。

2 HSPs

HSPs是機(jī)體在各種應(yīng)激條件下產(chǎn)生的一類對細(xì)胞具有保護(hù)作用的高保守蛋白質(zhì)分子家族。HSP具有強(qiáng)大的細(xì)胞保護(hù)作用，并且表現(xiàn)為其他細(xì)胞蛋白的分子伴侶。分子伴侶作用是糾正錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)重新折疊或降解的作用。根據(jù)分子量、功能和同源性，HSPs包括幾個(gè)蛋白家族，其中HSP70家族在進(jìn)化上是高度保守的，也是目前為止研究最深入的一族，特別是在細(xì)胞凋亡途徑已經(jīng)取得了不錯(cuò)的研究[5,26]。值得注意的是，熱刺激誘導(dǎo)HSP的表達(dá)和積累，證明了死亡刺激可以在細(xì)胞中引起保護(hù)性反應(yīng)，HSP具有重要的抗細(xì)胞凋亡特性。HSP與關(guān)鍵應(yīng)激信號傳導(dǎo)和凋亡分子相關(guān)，從而阻斷細(xì)胞死亡并促進(jìn)存活、增殖或分化。

3 HSP70在細(xì)胞凋亡途徑中的作用

3.1 HSP70通過內(nèi)在途徑對細(xì)胞凋亡的影響 HSP70作為抗凋亡蛋白，保護(hù)細(xì)胞免受TNF、單核細(xì)胞、氧化應(yīng)激、化學(xué)藥物、神經(jīng)酰胺和輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性[27-28]。由一氧化氮和熱應(yīng)激刺激的凋亡級聯(lián)觸發(fā)Bax從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至線粒體，其被HSP70的過表達(dá)抑制而引起細(xì)胞凋亡[29]。HSP70是細(xì)胞凋亡線粒體途徑的決定性負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過抑制應(yīng)激誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)，可以在前線粒體階段阻斷不同水平的細(xì)胞凋亡；在線粒體階段，通過阻斷Bax易位來阻止線粒體膜透化；最后，在線粒體后水平，通過與AIF和Apaf-1相互作用或通過保護(hù)必需的核蛋白免受Caspase-3裂解[5]。在線粒體前水平，HSP70抑制應(yīng)激激活的激酶。HSP70與c-Jun N末端激酶（JNK1）的天然抑制蛋白結(jié)合并起作用[30]。HSP70的ATP酶結(jié)構(gòu)域?qū)τ谶@種結(jié)合是不必要的。HSP70似乎也影響B(tài)id依賴性細(xì)胞凋亡途徑。Bid純合缺失的MEF細(xì)胞中缺乏HSP70介導(dǎo)的針對TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的保護(hù)作用[31]。在線粒體水平，HSP70阻止熱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，阻礙Bax易位并插入外膜，從而阻止線粒體膜透化和細(xì)胞色素c和AIF的釋放[29]。這種HSP70功能依賴于伴侶蛋白和ATP水解結(jié)構(gòu)域[32]。據(jù)報(bào)道，在線粒體后水平，HSP70可抑制細(xì)胞色素c釋放和Caspase-3活化上游細(xì)胞凋亡[6]。

HSP70與Apaf-1直接相互作用，并抑制功能性凋亡復(fù)合物形成在內(nèi)在途徑的最下游端[33]。HSP70不僅可預(yù)防晚期Caspase依賴性事件，如細(xì)胞溶質(zhì)磷脂酶A2的激活和核形態(tài)的變化，而且還可以保護(hù)細(xì)胞免受Caspase-3的強(qiáng)制表達(dá)[34]。HSP70的水平升高可以在線粒體的上游和下游阻斷不同類型誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

在TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，HSP70不會阻止Caspase-3活化，但會阻止下游形態(tài)變化，這種是瀕臨死亡細(xì)胞的特征，如磷脂酶A2的激活和核形態(tài)變化[34]。凋亡末期，Caspase激活后導(dǎo)致染色體DNA降解，這種降解DNA的酶稱為Caspase活化的DNA酶（Caspase Activated DNase，CAD）。在TCR刺激的T細(xì)胞中也報(bào)道了HSP70結(jié)合CAD并增強(qiáng)其活性[35]。

3.2 HSP70通過在外在途徑對細(xì)胞凋亡的影響 HSP70通過外在途徑發(fā)揮多種功能從而對細(xì)胞起到保護(hù)作用，這些功能包括抵抗功能、抑制功能、載體功能和磷酸化功能。HSP70通過死亡受體介導(dǎo)疾病中Bcr-Abl依賴性對細(xì)胞凋亡的抵抗性：一方面，HSP70與死亡受體DR4和DR5結(jié)合，從而抑制TRAIL誘導(dǎo)的死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）的組裝和活性[36]；另一方面，HSP70可通過抑制Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來保護(hù)心肌細(xì)胞免受應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷[37]。HSP70作為抗原呈遞細(xì)胞活化細(xì)胞因子或抗原肽，發(fā)揮載體蛋白的作用；HSP70的磷酸化形式直接與Daxx相互作用，將Fas信號傳導(dǎo)與蛋白激酶Ask1連接，并且不依賴Caspase的細(xì)胞死亡[38]，而Caspase-8一旦被激活，就會觸發(fā)細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段，源于死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡稱為c-FLIP的蛋白抑制，該蛋白將與FADD和Caspase-8結(jié)合，抑制了凋亡程序?？傊?，TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子是FLIP。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體途徑在細(xì)胞凋亡也起著重要確定性作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)一種重要的細(xì)胞器，參與蛋白合成后折疊、細(xì)胞對應(yīng)激的反應(yīng)等活動，同時(shí)也是Ca2+的最主要儲存庫[39]。當(dāng)機(jī)體受到熱應(yīng)激刺激，體內(nèi)的蛋白合成受到影響，特別是HSP70的合成增加，嚴(yán)重時(shí)則能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在許多不同的細(xì)胞死亡情況下，溶酶體還可作為細(xì)胞死亡信號的整合體。溶酶體可以分泌蛋白酶，其中組織蛋白酶是研究最深入的，組織蛋白酶從溶酶體腔釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而對多種凋亡刺激做出反應(yīng)[40]。組織蛋白酶釋放還可以對細(xì)胞造成凋亡，其不依賴于Cyt c或AIF的線粒體釋放。HSP70存在于許多腫瘤和應(yīng)激細(xì)胞的內(nèi)溶酶體膜中，它抑制溶酶體組織蛋白酶釋放到胞質(zhì)溶膠中，從而保護(hù)細(xì)胞抗凋亡[41]。

3.3 HSP70通過穿孔素/顆粒酶途徑對細(xì)胞凋亡的影響穿孔素是CTL介導(dǎo)和顆粒酶促進(jìn)的細(xì)胞內(nèi)過程的主要調(diào)節(jié)劑。顆粒酶A和顆粒酶B誘導(dǎo)多個(gè)獨(dú)立細(xì)胞死亡途徑而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。活化的NK細(xì)胞殺死膜HSP70陽性腫瘤細(xì)胞的機(jī)制與促凋亡絲氨酸蛋白酶顆粒酶B的產(chǎn)生和釋放增加相關(guān)[42-43]。此外，顆粒酶B誘導(dǎo)的HSP70陽性腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生在穿孔素不存在，并且顆粒酶B與HSP70膜形式的相互作用依賴于顆粒酶B的真核糖基化模式[44]。

4 小結(jié)與展望

總之，細(xì)胞凋亡是一個(gè)極其復(fù)雜的、精確調(diào)控的、蛋白酶及能量依賴的分子級聯(lián)反應(yīng)過程，其中Caspase的活化起重要決定作用。HSP70家族是高度保守的蛋白，與其他蛋白有很多互作。熱應(yīng)激導(dǎo)致HSP70升高，HSP70通過不同的死亡途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且熱應(yīng)激是誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。如果HSP70通過線粒體外膜透化作用來阻止細(xì)胞凋亡，則需要抑制Caspase、凋亡誘導(dǎo)因子、核酸內(nèi)切酶G以及可能是其他不依賴于caspase的細(xì)胞死亡介質(zhì)的活性。HSP70通過穿孔素/顆粒酶調(diào)節(jié)死亡途徑，這有可能是一種新的凋亡途徑。此外，熱應(yīng)激下HSP70的表達(dá)和分布與細(xì)胞損傷的程度之間存在明顯的相關(guān)性。