牦牛不同肌肉組織的肌內(nèi)脂肪含量與脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性分析

張海波，官久強(qiáng)，周建旭，廖曉鵬，郭冬生*，羅曉林*

（1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西宜春 336000；2.四川省草原科學(xué)研究院，四川成都 625014；3.小金縣畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心，四川小金 624200；4.小金縣圣源牦牛養(yǎng)殖專業(yè)合作社，四川小金 624200；5.宜春學(xué)院繼續(xù)教育學(xué)院，江西宜春 336000）

牦牛作為能適應(yīng)高原特殊氣候的牛種，其與當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)、文化和政治等息息相關(guān)。牦牛肉因具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值在國內(nèi)外引起廣泛關(guān)注。牛肉肌內(nèi)脂肪（IMF）含量是評(píng)價(jià)肉品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)之一，直接決定肉的嫩度、多汁性及風(fēng)味等性狀[1-2]。因此，解析IMF在肌肉中的沉積機(jī)制對(duì)于改善牦牛肉質(zhì)有著重要意義。牛肉IMF沉積是脂肪酸合成與分解共同作用的結(jié)果，受到脂肪酸合成酶與脂肪酸分解酶等相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD1）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（SREBP-1）、脂肪酸合成酶（FAS）、過氧化物酶增殖激活受體γ（PPARγ）等脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)決定了脂肪酸的合成能力[3-4]，激素敏感脂肪酶（HSL）和肉堿轉(zhuǎn)移酶1（CPT-1）等脂肪酸分解相關(guān)基因的表達(dá)決定了脂肪酸的分解能力[5-6]。以前的研究多集中在牦牛肉品質(zhì)及風(fēng)味物質(zhì)[7-8]，而較少有關(guān)于這些脂肪代謝相關(guān)基因調(diào)控牦牛不同肌肉組織IMF形成的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究牦牛不同肌肉組織的肉品質(zhì)和脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)水平，并分析IMF含量與脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性，以期為鑒定牦牛肌肉組織IMF沉積的關(guān)鍵調(diào)控基因提供基本參數(shù)，也為揭示牦牛不同肌肉組織IMF形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 于四川省阿壩州紅原縣選取體重為（211.50±18.77）kg、4歲的健康麥洼公牦牛10頭，清晨空腹屠宰，立即采集小黃瓜條、辣椒條和外脊（第12～13胸肋）的肌肉組織樣品，經(jīng)DEPC水清洗后裝入無RNA酶的冷凍管中后迅速放入液氮罐中保存，用于組織總RNA的提取，然后測(cè)定相關(guān)基因的表達(dá)。同時(shí)采集小黃瓜條、辣椒條和外脊樣各300 g，-20℃保存，用于肌肉IMF含量和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。另取小黃瓜條、辣椒條和外脊樣品用于剪切力的測(cè)定。

1.2 樣品分析

1.2.1 肉品質(zhì)分析 常溫解凍-20℃小黃瓜條、辣椒條和外脊的肌肉樣品，將肌肉上的結(jié)締組織、脂肪組織和黏膜去除干凈，采用索氏脂肪抽提法分析樣品IMF含量[1]，并且采用凱氏定氮法《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5-2016）測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)含量。參考Baublits等[9]方法測(cè)定牦牛肌肉組織樣品的剪切力，即切取3 cm×3 cm×2 cm的肌肉組織樣品，其中2 cm方向?yàn)榧±w維方向，用塑料薄膜袋密封后放入80℃恒溫水浴鍋加熱樣品，當(dāng)中心溫度為75℃后保持5 min，室溫自然冷卻后沿肌纖維方向鉆取直徑1.27 cm肉柱，每個(gè)樣品平行取3個(gè)肉柱，用C-LM型嫩度儀分析其剪切力，每個(gè)肉柱測(cè)3個(gè)重復(fù)后取平均值即為剪切力值。

1.2.2 基因表達(dá)分析 采用TRIzol方法[1]提取小黃瓜條、辣椒條和外脊的肌肉樣品總RNA，即100 mg肌肉樣品加入1 mL TRIzol后勻漿，4 ℃ 10 000×g離心10 min，保留澄清的勻漿液加入0.2 mL氯仿，振蕩15 s后靜置15 min，4℃ 12 000×g離心15 min，收集上清液加入0.5 mL異丙醇，放置10 min，4 ℃ 12 000 ×g離心8 min，棄上清，用1 mL 75 % 乙醇清洗RNA沉淀，4℃ 7 500 ×g離心5 min后棄上清，晾干RNA沉淀后加入無RNase水溶解沉淀，得到總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，USA）分析樣品總RNA的濃度。參考TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將肌肉樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，即4 μL（400 ng）總RNA加入1 μL隨機(jī)引物，72℃ 5 min，42℃ 5 min，接著加入MgCl24.8 μL、3.7 μL DEPC水、4.0 μL 5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、1.0 μL ImProm-IITMReverse Transcription System、1 μL dNTP，42 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min。采用Primer Premier 5.00軟件根據(jù)GenBank中公布的牛的基因序列設(shè)計(jì)β-肌動(dòng)蛋白、SCD1、SREBP-1、FAS、PPARγ、HSL和CPT-1基因的引物序列（表1）。用美國伯樂CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀測(cè)定基因表達(dá)水平。反應(yīng)體系為20 μL：上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，6 μL cDNA，10 μL 2×FASt SYBR?Green Master Mix，3.2 μL無菌水。反應(yīng)程序：95℃ 2 min，95℃ 5 s，58℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCt計(jì)算基因表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 經(jīng)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析后，用Duncan's方法進(jìn)行多重比較。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)IMF含量與脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 牦牛不同肌肉組織的肉品質(zhì)分析 由表2可知，外脊的IMF含量顯著高于小黃瓜條和辣椒條。小黃瓜條和辣椒條的剪切力顯著高于外脊，小黃瓜條的剪切力顯著高于辣椒條。3個(gè)部位蛋白質(zhì)含量差異不顯著。

2.2 牦牛不同肌肉組織的脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)水平 由表3可知，外脊的SCD1、SREBP-1、FAS、PPARγ基因表達(dá)顯著高于小黃瓜條和辣椒條，辣椒條的SCD1、SREBP-1、FAS、PPARγ基因表達(dá)顯著高于小黃瓜條。外脊的HSL、CPT-1基因表達(dá)顯著低于小黃瓜條。外脊的CPT-1基因表達(dá)顯著低于辣椒條。辣椒條的HSL基因表達(dá)顯著低于小黃瓜條。辣椒條與外脊的HSL基因表達(dá)差異不顯著。

表2 牦牛不同肌肉組織的肉品質(zhì)分析

表3 牦牛不同肌肉組織的脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)水平分析

2.3 牦牛不同肌肉組織的IMF與脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性分析 由表4可知，小黃瓜條的SCD1基因表達(dá)與IMF含量呈極顯著正相關(guān)。辣椒條和外脊的SCD1基因表達(dá)與IMF含量呈顯著正相關(guān)。小黃瓜條、辣椒條和外脊的HSL、CPT-1基因表達(dá)與IMF含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論

3.1 牦牛不同肌肉組織間的肉品質(zhì)分析 牛胴體部位是影響肉質(zhì)的重要因素之一，肉的嫩度、脂肪含量等肉質(zhì)指標(biāo)受不同部位影響較大。IMF含量與肉的口感、風(fēng)味及嫩度相關(guān)，是評(píng)價(jià)肉品質(zhì)的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，外脊的IMF含量高于小黃瓜條和辣椒條，其含量由高到低依次為外脊＞辣椒條＞小黃瓜條。相比較于小黃瓜條和辣椒，外脊運(yùn)動(dòng)相對(duì)較少，負(fù)荷較輕，因而有利于IMF沉積。亢其鵬等[10]研究結(jié)果表明新疆褐牛和加系褐牛外脊中脂肪含量都顯著高于肩肉和大黃瓜條。牛蕾等[11]測(cè)定了中國西門塔爾牛13個(gè)分割部位間的脂肪含量，其含量由高到低依次為外脊＞眼肉＞上腦＞里脊＞辣椒條＞板腱＞大黃瓜條＞脖肉＞米龍＞臀肉＞肩肉＞霖肉＞小黃瓜條。肌肉嫩度是影響牛肉品質(zhì)的重要因素，而剪切力是反映肌肉嫩度的關(guān)鍵指標(biāo)，剪切力值越大說明肉的嫩度越差。本實(shí)驗(yàn)中，外脊的剪切力低于小黃瓜條和辣椒條，其值由高到低依次為小黃瓜條＞辣椒條＞外脊。外脊的剪切力最低，辣椒條次之，這2個(gè)部位運(yùn)動(dòng)相較于辣椒肉運(yùn)動(dòng)少，肌肉負(fù)荷較輕，有助于脂肪沉積，因而肌肉較嫩。本研究中剪切力結(jié)果也間接證明了牦牛不同部位的IMF含量由高到低依次為外脊＞辣椒條＞小黃瓜條。

表4 牦牛不同肌肉組織的IMF與脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性分析

3.2 牦牛不同肌肉組織間的脂代謝相關(guān)基因表達(dá)分析首先，IMF沉積受到脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控。SREBP-1和PPARγ是控制脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子，主要作用是正向調(diào)控SCD1、FAS等脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)，參與脂肪酸的合成[3-4]。SCD1主要功能是催化飽和脂肪酸（主要包括棕櫚酰CoA、硬脂酰CoA等）生成單不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶之一，對(duì)肌肉脂肪沉積有著重要調(diào)控作用[12]。FAS主要負(fù)責(zé)催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A生成脂肪酸，是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶之一[3]。本實(shí)驗(yàn)中，牦牛不同部位的SCD1、SREBP-1、FAS、PPARγ基因表達(dá)由高到低依次為外脊＞辣椒條＞小黃瓜條，說明外脊脂肪酸的合成能力比小黃瓜條和辣椒條強(qiáng)，從而外脊IMF沉積能力強(qiáng)于小黃瓜條和辣椒條。李健[13]研究發(fā)現(xiàn)西雜牛在背最長?。ㄍ饧梗┑腜PARγ基因表達(dá)量高于半腿肌（小黃瓜條）。其次，IMF沉積受到脂肪分解相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控。HSL參與脂肪酸分解的限速酶之一，將甘油三酯水解為游離脂肪酸、甘油和甘油二酯[5]。CPT-1參與脂肪酸的β氧化，是脂肪酸分解的關(guān)鍵酶之一[6]。本實(shí)驗(yàn)中，牦牛不同部位的HSL、CPT-1基因表達(dá)由高到低依次為小黃瓜條＞辣椒條＞外脊，說明外脊脂肪酸的分解能力比小黃瓜條和辣椒條弱，從而外脊IMF沉積能力強(qiáng)于小黃瓜條和辣椒條。這可能是因?yàn)樾↑S瓜條和辣椒條的運(yùn)動(dòng)多于外脊，而運(yùn)動(dòng)越多其脂肪分解相關(guān)基因表達(dá)越高，使脂肪酸分解的越多，進(jìn)而脂肪酸儲(chǔ)存的就越少，故外脊IMF含量高于小黃瓜條和辣椒條。

3.3 IMF含量與脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性分析在脂肪合成方面，本實(shí)驗(yàn)中小黃瓜條、辣椒條和外脊的SREBP-1、FAS和PPARγ基因表達(dá)與IMF含量無顯著相關(guān)性，這可能是因?yàn)镮MF含量是數(shù)量性狀，影響基因比較多，本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的基因?qū)儆谖⑿Щ?，故影響不顯著。但本研究中小黃瓜條、辣椒條和外脊的SCD1基因表達(dá)與IMF含量呈顯著正相關(guān)，這與金世杰等[14]在延邊黃牛上的研究結(jié)果一致。SCD1基因在成都麻羊和簡(jiǎn)州大耳羊中3個(gè)不同部位肌肉組織（背最長肌、后腿股二頭肌及臂三頭）中的表達(dá)均與IMF含量呈顯著的正相關(guān)[15]。本研究結(jié)果表明，SCD1基因可作為調(diào)控牦牛IMF形成的候選基因，并且該基因可能對(duì)牦牛肌肉IMF沉積有正向調(diào)控的作用。而在脂肪分解方面，本實(shí)驗(yàn)中小黃瓜條、辣椒條和外脊的HSL、CPT-1基因表達(dá)與IMF含量呈顯著負(fù)相關(guān)。日本和牛肌肉的HSL基因表達(dá)與IMF含量呈顯著負(fù)相關(guān)[16]。哈薩克族羊和新疆羊背最長肌的HSL基因表達(dá)與IMF含量呈顯著負(fù)相關(guān)[17]。本研究結(jié)果表明，HSL和CPT-1基因可作為調(diào)控牦牛IMF形成的候選基因，并且該基因可能對(duì)牦牛肌肉IMF沉積有負(fù)向調(diào)控的作用。

4 結(jié)論

牦牛不同肌肉部位之間IMF也有較明顯的差異，外脊IMF含量最高，其脂肪合成相關(guān)基因（SCD1、SREBP-1、FAS和PPARγ）的表達(dá)水平更高，脂肪分解相關(guān)基因（HSL和CPT-1）的表達(dá)水平最低；辣椒條的IMF含量、脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)次之；小黃瓜IMF含量最低，其脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)水平最低，脂肪分解相關(guān)基因的表達(dá)水平最高。SCD1基因正向調(diào)控牦牛肌肉組織IMF沉積，HSL和CPT-1基因負(fù)向調(diào)控肌肉組織IMF沉積。