都安山羊和隆林山羊mtDNA D-loop區(qū)遺傳多態(tài)性研究

李芳玉 ，黃光云，王自豪，滕少花，曹艷紅，孫俊麗，雷初朝，廖玉英*

（1.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西家畜遺傳改良重點實驗室，廣西南寧 530001；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100）

家養(yǎng)山羊是在人類生產(chǎn)生活中發(fā)揮重要作用的家畜品種之一。通過山羊形態(tài)多樣性研究，《中國羊品種志》提出彎角野山羊（Capra aegagrus）和旋角野山羊（Caprafalconeri）是現(xiàn)代家養(yǎng)山羊的野生祖先[1]。由于哺乳動物mtDNA具有母系遺傳、不重組、進化速度相對較快等特點，因此mtDNA是研究動物遺傳多樣性和起源進化的重要遺傳標(biāo)記。基于mtDNA序列研究發(fā)現(xiàn)，全世界山羊共有7個支系（A-G）[2-7]。利用現(xiàn)代生物技術(shù)研究山羊的分子遺傳多樣性，對了解山羊的起源、分化以及山羊的品種資源保護和利用有重要作用。

都安山羊和隆林山羊均為廣西壯族自治區(qū)的地方肉用山羊品種，具有抗逆性強、耐粗飼的優(yōu)點[1]。但近年來，由于生態(tài)環(huán)境惡化和選留種不科學(xué)等原因，都安山羊和隆林山羊出現(xiàn)生產(chǎn)質(zhì)量下降和品質(zhì)退化的現(xiàn)象[8]，因此，保護這2個地方山羊品種資源刻不容緩。本研究采用PCR擴增、DNA測序和生物信息學(xué)方法，對都安山羊和隆林山羊共58個個體的mtDNA D-loop區(qū)全序列進行檢測，以研究這2個地方山羊品種的遺傳多樣性和母系起源，為我國地方山羊品種資源的保護和育種利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及基因組DNA的提取 在廣西壯族自治區(qū)大化縣養(yǎng)殖場采集35只都安山羊，在隆林縣隆林山羊保種場采集23只隆林山羊的耳組織樣，所采個體符合品種特征，為避開樣本個體間的親緣關(guān)系，本研究根據(jù)家系信息來采取山羊耳組織樣品，低溫保存帶回實驗室，用常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA，稀釋濃度至10～20 ng/μL，保存?zhèn)溆谩腘CBI網(wǎng)站上查找并下載2條野山羊序列作為對照，一條為彎角野山羊序列（登錄號：AB044306）；另一條為旋角野山羊序列（登錄號：AB004076）。下載家山羊mtDNA D-loop區(qū)全序列A、B、C及D支系各1條做對照，登錄號分別為AB004082、KM464500、AB110555和AB110587。

1.2 引物合成和擴增 本研究引用劉若余等[9]和郝榮超等[10]對中國山羊mtDNA D-loop區(qū)全序列研究所用的引物。上游引物F：5′-CAGTCGAACATCCCTACATTA TTATTGG-3′，下游引物R：5′-TTAGTCTTATTGATTT GGAGGGCGTTA-3′，中間引物I：5′-ATGCGTATCC CGTCCACTAGATC-3′，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR體系25 μL：2×PrimeSTAR Max Premix（上海寶生物公司）10.5 μL，上、下游物（10 pmol/μL）各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，超純水12.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃復(fù)性 60 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠（含GoldView核酸染料）電泳后，凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測，對擴增效果進行檢查。將符合要求的PCR產(chǎn)物送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析 用seqman對山羊mtDNA D-loop全序列測序結(jié)果進行拼接和校正。用MEGA7將都安山羊和隆林山羊的mtDNA D-loop序列與標(biāo)準(zhǔn)序列進行同源序列比對分析，并輔以人工校正。用MEGA7構(gòu)建這2個山羊品種的單倍型NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。用DnaSP6軟件計算山羊的mtDNA D-loop單倍型多樣度、核酸多樣度以及平均核酸差異數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 都安山羊和隆林山羊mtDNA D-loop全序列長度和堿基構(gòu)成 從35只都安山羊和23只隆林山羊mtDNA D-loop區(qū)的PCR產(chǎn)物中隨機選取10個樣本，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，條帶明亮清晰，沒有雜帶，長度在1 000～2 000 bp（圖1）。通過測序測定58個個體的mtDNA D-loop全序列長為1 212～1 213 bp，其中有42個個體為1 212 bp，16個個體為1 213 bp，這是由于在1 074 bp處插入1個堿基C造成的。4種堿基A、T、G和C平均百分比分別為31.3%、28.8%、13.9%和26.0%。A+T含量為60.1%，G+C含量為39.9%，A+T含量顯著高于G+C含量。

2.2 都安山羊和隆林山羊mtDNA D-loop區(qū)全序列多態(tài)性分析 通過對都安山羊和隆林山羊共58個個體的mtDNA D-loop區(qū)全序列進行測序分析，檢測到83個多態(tài)位點（圖2），定義32個單倍型，其中都安山羊有22個單倍型，隆林山羊有16個單倍型，二者有6個單倍型是共享的。都安山羊和隆林山羊的單倍型多樣度分別為0.956和0.960，其核苷酸多樣度均為0.018，其平均核苷酸差異數(shù)（k）分別為21.2和21.5。

2.3 都安山羊和隆林山羊mtDNA D-loop序列的聚類分析將都安山羊和隆林山羊32個mtDNA D-loop區(qū)單倍型與旋角野山羊、彎角野山羊以及家養(yǎng)山羊A、B、C和D支系對應(yīng)序列進行聚類分析（圖3），發(fā)現(xiàn)都安山羊和隆林山羊分為2個支系，分別為A支系和B支系，其中A支系包含彎角野山羊，而旋角野山羊作為外群，單獨聚為一支。

3 討論

本研究測定的35只都安山羊和23只隆林山羊的mtDNA D-loop區(qū)全序列長為1 212～1 213 bp。劉若余等[9]測定了9個中國山羊品種共128個個體的mtDNA D-loop區(qū)序列，結(jié)果得出9個中國山羊品種的單倍型多樣度均高于0.9，表明中國山羊遺傳多樣性豐富。郝榮超等[10]測定了10個中國南部山羊品種140個個體的mtDNA D-loop區(qū)序列，其平均單倍型多樣度和核苷酸多樣度分別為0.988、0.021，說明中國山羊具有豐富的遺傳多樣性。在都安山羊和隆林山羊中共發(fā)現(xiàn)83個多態(tài)位點，32個單倍型，其單倍型多樣度分別為0.956和0.960，核苷酸多樣性均為0.018，說明都安山羊和隆林山羊也具有豐富的遺傳多樣性。

由于山羊最初家養(yǎng)的地方與彎角野山羊的地理分布（中亞西亞的諸多山脈）有高度的相關(guān)性，因此有研究者推測彎角山養(yǎng)是最可能的母系起源[11]。通過mtDNA D-loop區(qū)序列研究，發(fā)現(xiàn)中國山羊共有4個支系（A-D）[7,9-10,12]。李祥龍等[13]研究中國18個地方山羊品種的mtDNA RFLP多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)2個基本單倍型I和II，提出中國山羊可能是彎角野山羊與旋角野山羊的混合起源，由于該文并沒有使用彎角野山羊與旋角野山羊樣本進行分析，因此，李祥龍等[13]提出的中國山羊混合起源學(xué)說僅僅是推測。劉若余等[10]研究發(fā)現(xiàn)，中國山羊品種主要為A和B支系，且只在西藏山羊中發(fā)現(xiàn)C和D 2個支系。此外，有研究對來自不同地理區(qū)域的中國山羊品種進行分析，在太行、內(nèi)蒙古等地區(qū)的山羊品種中檢測到D支系，而其他地區(qū)的家山羊品種則為A和B支系[12]。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，都安山羊和隆林山羊32個單倍型分為A和B 2個支系，說明都安山羊和隆林山羊有2個母系起源，其中彎角野山羊與A支系聚在一起，而旋角山羊單獨聚為一支，說明彎角野山羊是都安山羊和隆林山羊的母系起源，尚未有證據(jù)表明旋角山羊?qū)Χ及采窖蚝吐×稚窖虻哪赶颠z傳有貢獻。

4 結(jié)論

本研究對35只都安山羊和23只隆林山羊的mtDNA D-loop區(qū)進行多態(tài)性分析，結(jié)果表明都安山羊和隆林山羊具有豐富的遺傳多樣性；通過構(gòu)建NJ發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)都安山羊和隆林山羊主要分為A支系和B支系，其中A支系與彎角野山羊聚在一起，而旋角野山羊單獨聚為一支，說明彎角野山羊是都安山羊和隆林山羊的母系祖先。