王文濤,李燕,黃婷,張亞莉
我國成年人患慢性腎臟病(CKD)的比例為10.8%,預(yù)計(jì)我國現(xiàn)有的成年人CKD患者達(dá)1.2億[1]。腎間質(zhì)纖維化(RIF)是CKD發(fā)展至終末期腎病(ESRD)的主要病理基礎(chǔ)[1],也是反映腎功能下降嚴(yán)重程度、判斷預(yù)后的重要指標(biāo)之一[2]。而目前臨床缺乏診斷RIF簡單易行的可靠指標(biāo)。本研究旨在探討Masson染色聯(lián)合圖像半定量分析對(duì)RIF的診斷價(jià)值,找到客觀易行的評(píng)價(jià)RIF的指標(biāo),以盡早進(jìn)行預(yù)防和抑制這一變化過程,對(duì)延緩CKD病情進(jìn)展具有十分重要的意義。
1.1 研究對(duì)象 收集2016年1—9月于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科行腎活檢、排除繼發(fā)性腎臟疾病、診斷為慢性間質(zhì)性腎炎(CIN)及慢性腎小球疾?。–GD)患者149例作為RIF組,其可分為CIN亞組(包括病理診斷為小管間質(zhì)性炎,伴或不伴系膜增生性腎小球腎炎患者,n=26)、CGD亞組(n=123)。根據(jù)CGD常見類型,分為IgA腎病(IgAN,包括伴有腎小球硬化的IgAN患者,n=79)、慢性腎小球腎炎(n=44);根據(jù)LEE氏標(biāo)準(zhǔn)[3]將IgAN分為IgAN Ⅱ級(jí)(n=3)、IgAN Ⅲ級(jí)(n=35)、IgAN Ⅳ級(jí)(n=25)、IgAN Ⅴ級(jí)(n=16),根據(jù)慢性腎小球腎炎硬化程度分為局灶硬化性腎小球腎炎(FSGN,n=31)、增生硬化性腎小球腎炎(PSGN,n=10)、硬化性腎小球腎炎(SGN,n=3)。將同期于本院行腎臟穿刺活檢明確無RIF的Ⅰ~Ⅱ期膜性腎病患者27例作為對(duì)照組。
1.2 生化檢查 全自動(dòng)生化檢測(cè)儀測(cè)定研究對(duì)象在入院期間的血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、胱抑素C。全自動(dòng)流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定研究對(duì)象在入院期間的血紅蛋白(Hb)。放射免疫法測(cè)定研究對(duì)象在入院期間的血及尿β2微球蛋白(β2-MG)。
1.3 圖像軟件處理 將西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科制好的Masson染色的腎臟病理切片,使用Nikon801 正置熒光顯微鏡 Plan Fulor 40X/0.75 物鏡、目鏡 10X/22(×400)采集圖像,輸入 Image-Pro Plus 6.0圖像分析儀測(cè)量系統(tǒng),選擇HSI模式(將吸管顏色設(shè)定為黃色),設(shè)置H、S、I參數(shù),當(dāng)H在“117~200”、S在“0~255”、I在“180~240”時(shí)基本可以選中圖片中所有的膠原纖維。測(cè)量陽性區(qū)域總積分光密度,每張病理切片取5個(gè)視野(上、下、左、右及中央)定量檢測(cè)Masson染色的腎臟病理切片的積分光密度,總積分光密度與測(cè)量區(qū)域總面積相除,計(jì)算出平均光密度(MOD)。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(±s)表示,兩組間比較采用成組t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25,P75)表示,兩組間比較采用秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),構(gòu)建MOD診斷RIF的受試者工作特征曲線(ROC曲線),計(jì)算最佳截?cái)嘀怠R訮<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 RIF組與對(duì)照組
2.1.1 基本資料 RIF組和對(duì)照組性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表1)。
2.1.2 RIF組與對(duì)照組的臨床指標(biāo) RIF組BUN、Scr、胱抑素C、血及尿β2-MG高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);RIF組和對(duì)照組Hb比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.173,見表2)。
本文創(chuàng)新點(diǎn):
本研究通過測(cè)量腎間質(zhì)的平均光密度(MOD)來間接反映腎臟間質(zhì)纖維化程度,減少病理科醫(yī)師主觀影響,希望能為腎臟間質(zhì)纖維化患者的診斷提供新的依據(jù)。
本文不足:
(1)本課題僅檢測(cè)了Masson染色的病理組織切片中腎間質(zhì)的MOD,未對(duì)其他染色方法的MOD做相關(guān)研究;(2)本文病例數(shù)較少,如有條件,可通過大樣本量的病例研究以減小誤差影響;(3)如有條件,可通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)并同步進(jìn)行與纖維化相關(guān)的因子檢測(cè)并進(jìn)行比較,以助于進(jìn)一步確定診斷界值。
表1 RIF組和對(duì)照組基本資料比較Table 1 General characteristics of RIF group and control group
表2 RIF組和對(duì)照組臨床指標(biāo)比較Table 2 Clinic indicators of RIF group and control group
2.1.3 RIF組MOD與臨床指標(biāo)的相關(guān)性 RIF組MOD為 0.017 9(0.015 2,0.023 3)。RIF 組的 MOD 與 Scr、血及尿β2-MG呈正相關(guān),與Hb呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);RIF組的MOD與BUN、胱抑素C無相關(guān)關(guān)系(P>0.05,見表3)。
表3 RIF組MOD與臨床指標(biāo)相關(guān)性Table 3 Correlations of MOD and clinic indicators in RIF group
2.1.4 RIF組與對(duì)照組MOD比較 對(duì)照組MOD為0.005 6(0.004 1,0.007 3)。RIF組的MOD高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-7.954,P=0.001)。
2.1.5 MOD診斷RIF的價(jià)值 MOD診斷RIF的ROC曲線下面積為0.982〔95% CI(0.961,1.000)〕,最佳截?cái)嘀禐?.012 3,靈敏度為0.886,特異度為0.963,見圖1。
圖1 MOD診斷RIF的ROC曲線Figure 1 The AUC of MOD in the diagnosis of RIF
2.2 CIN亞組、CGD亞組、對(duì)照組比較
2.2.1 基本資料 三組性別比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。三組年齡比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CIN亞組年齡高于CGD亞組、對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);CGD亞組和對(duì)照組年齡比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表4)。
表4 CIN亞組、CGD亞組、對(duì)照組基本資料比較Table 4 General characteristics of CIN and CGD subgroups and control group
2.2.2 臨床指標(biāo) 三組BUN、Scr、胱抑素C、Hb、血及尿β2-MG比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CIN亞組BUN、Scr、胱抑素C、血及尿β2-MG高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);CIN亞組Hb低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CGD亞組BUN、Scr、胱抑素C、血及尿β2-MG高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。CIN亞組BUN、Scr、胱抑素C、血及尿β2-MG高于CGD亞組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);CIN亞組Hb低于CGD亞組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表5)。
2.2.3 MOD CIN 亞組 MOD 為 0.019 1(0.015 6,0.025 2),CGD 亞組 MOD 為 0.017 6(0.015 1,0.023 3)。三組的MOD比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=64.536,P<0.05)。CIN亞組MOD高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-6.138,P<0.05)。CGD亞組MOD高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-7.790,P<0.05)。CIN亞組和CGD亞組MOD比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.298,P>0.05)。
表5 CIN組、CGD組、對(duì)照組臨床指標(biāo)比較Table 5 Clinic indicators of CIN and CGD subgroups and control group
2.2.4 MOD診斷CIN亞組、CGD亞組RIF的價(jià)值 以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),MOD診斷CIN亞組RIF的ROC曲線下面積為0.991〔95% CI(0.975,1.000)〕,最佳截?cái)嘀禐?.011 8,靈敏度為1.000,特異度為0.926,見圖2。
MOD診斷CGD亞組RIF的ROC曲線下面積為0.980〔95% CI(0.958,1.000)〕,最佳截?cái)嘀禐?.008 0,靈敏度為0.992,特異度為0.852,見圖2。
圖2 MOD診斷CIN亞組、CGD亞組RIF的ROC曲線Figure 2 The ROC curves of MOD in the diagnosis of RIF in CIN and CGD subgroups
2.2.5 三組MOD與臨床指標(biāo)的相關(guān)性 CIN亞組和對(duì)照組的MOD與臨床指標(biāo)無相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。
CGD亞組MOD與胱抑素 C、血及尿β2-MG呈正相關(guān),與Hb呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);CGD亞組MOD與BUN、Scr無相關(guān)關(guān)系(P>0.05,見表6)。
2.3 對(duì)照組與不同IgAN分級(jí)患者M(jìn)OD比較 IgAN患者 MOD 為 0.007 7~0.036 5,對(duì)照組 MOD 為 0.003 0~0.014 9。對(duì)照組、不同IgAN分級(jí)患者M(jìn)OD比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IgAN Ⅱ、IgAN Ⅲ、IgAN Ⅳ、IgAN Ⅴ級(jí)患者M(jìn)OD均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.800、-6.126、-5.925、-5.402,P值均<0.001);且IgAN Ⅳ、IgAN Ⅴ級(jí)患者M(jìn)OD均高于IgAN Ⅲ級(jí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.122、-2.395,P=0.034、0.017,見表7)。
2.4 對(duì)照組與不同慢性腎小球腎炎硬化程度患者M(jìn)OD比較 慢性腎小球腎炎患者 MOD 為 0.009 1~0.035 8。對(duì)照組與不同慢性腎小球腎炎硬化程度患者M(jìn)OD比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中FSGN、PSGN、SGN患者的MOD高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-6.337、-4.617、-2.800,P值均<0.001);PSGN的MOD高于FSGN,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.398,P<0.05,見表 8)。
表6 CIN亞組、CGD亞組、對(duì)照組的MOD與臨床指標(biāo)的相關(guān)性Table 6 Correlations of MOD with clinic indicators in CIN and CGD subgroups and control group
表8 不同慢性腎小球腎炎硬化程度患者與對(duì)照組的MOD比較〔M(P25,P75)〕Table 8 Comparison of MOD between patients with different degree of chronic glomerulonephritis and control group
3.1 RIF概述 RIF是腎臟疾病發(fā)展至ESRD的主要病理基礎(chǔ),RIF程度越重,提示腎功能損害越嚴(yán)重,預(yù)后越差。近年來諸多研究表明,無論是原發(fā)性腎小球疾病還是繼發(fā)性腎小球疾病,小管間質(zhì)病變的嚴(yán)重性與腎小球病變的活動(dòng)性、腎臟組織學(xué)活動(dòng)指標(biāo)、腎功能受損程度均呈正相關(guān)[4-6]。腎小管間質(zhì)內(nèi)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤的程度與腎功能損傷程度密切相關(guān),并且腎功能減退的程度與小管間質(zhì)纖維化有密切的關(guān)系。因此,早期診斷,盡早進(jìn)行干預(yù),對(duì)于改善CKD患者生活質(zhì)量意義重大。目前關(guān)于RIF評(píng)估的臨床指標(biāo)有限,臨床常用的BUN、Scr等血清學(xué)指標(biāo)可反映腎功能,而尿β2-MG主要反映近端腎小管重吸收功能,尿液濃縮-稀釋試驗(yàn)主要反映遠(yuǎn)端腎小管及集合管的功能,均無法反映RIF的程度。有報(bào)道超聲、核磁共振等[7-9]檢查可評(píng)價(jià)RIF,病理切片的積分光密度[10-13]間接反映RIF,且需要檢測(cè)各種因子的表達(dá),目前公認(rèn)腎臟中的結(jié)締組織生長因子、單核細(xì)胞趨化因子蛋白1及轉(zhuǎn)化生長因子β1[10]是RIF發(fā)生發(fā)展的重要細(xì)胞因子,其表達(dá)越高提示RIF的程度可能越高,但因檢測(cè)要求技術(shù)高,費(fèi)用高昂,目前主要應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,也有報(bào)道可以通過檢測(cè)血或尿中的單核細(xì)胞趨化因子蛋白1、轉(zhuǎn)化生長因子β1、結(jié)締組織生長因子表達(dá)來反映RIF程度[14-16]。目前病理檢查為診斷RIF的金標(biāo)準(zhǔn),其中Masson對(duì)膠原纖維的特殊染色,依靠病理醫(yī)師在顯微鏡下觀察來評(píng)定RIF程度,受醫(yī)師水平的影響,存在著主觀性且無法量化的指標(biāo)評(píng)價(jià)纖維化程度,目前的計(jì)算機(jī)輔助病理診斷在臨床診斷方面逐漸得到應(yīng)用,但其主要通過檢測(cè)免疫組化病理切片的陽性面積或積分光密度來間接反映RIF,需要進(jìn)行特殊染色以檢測(cè)各種因子,臨床操作復(fù)雜,費(fèi)用高。本研究通過Masson染色聯(lián)合圖像處理軟件,計(jì)算不同腎組織間質(zhì)的MOD,以量化指標(biāo)對(duì)RIF進(jìn)行評(píng)價(jià)。
3.2 MOD與RIF 本研究結(jié)果顯示,CIN亞組、CGD亞組的MOD均高于對(duì)照組,提示該方法可以反映腎臟的纖維化病變,原因可能為:在慢性腎小球腎炎的病理改變中,早期以腎小球病變?yōu)橹鳎S著疾病的進(jìn)展,腎臟間質(zhì)及小管也會(huì)發(fā)生改變。而在CIN中,腎間質(zhì)及小管的損害也可以通過增加腎小球后的阻力、降低腎小球?yàn)V過率,繼而引起腎小球硬化。
本研究結(jié)果顯示,MOD預(yù)測(cè)RIF的最佳截?cái)嘀禐?.012 3,靈敏度為88.6%,特異度為96.3%;CIN亞組及CGD亞組的最佳截?cái)嘀捣謩e是0.011 8、0.008 0,靈敏度分別是100.0%、99.2%,特異度分別是92.6%、85.2%,提示MOD可以間接反映RIF程度,且均有較高的特異度及靈敏度。建議對(duì)CIN及CGD可以取不同的界值。
目前我國主要按照LEE氏標(biāo)準(zhǔn)對(duì)IgAN進(jìn)行分級(jí)[3]:IgANⅠ級(jí),在絕大多數(shù)是正常的腎小球中,偶爾可見輕度系膜增寬伴或不伴細(xì)胞增生,腎間質(zhì)及小管無病變。IgANⅡ級(jí),腎小球局灶性系膜增生和硬化程度小于50%,小新月體罕見,腎間質(zhì)及小管無病變。IgAN Ⅲ級(jí),系膜彌漫增生、增寬(偶爾為局灶節(jié)段),小新月體少見,可出現(xiàn)局灶間質(zhì)水腫,細(xì)胞浸潤少見,腎小管萎縮罕見。IgAN Ⅳ級(jí),腎小球重度彌漫增生和硬化,腎小球可呈部分或全部硬化,新月體≤45%,腎小管萎縮,腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤,間質(zhì)泡沫細(xì)胞少見。IgAN Ⅴ級(jí),病變比Ⅳ級(jí)更重,腎小球新月體>45%,腎小管和間質(zhì)病變比Ⅳ級(jí)重,原因可能為IgAN硬化程度越重,RIF程度越重有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,慢性腎小球腎炎不同硬化程度患者的MOD不同。FSGN的腎小球呈局灶節(jié)段性分布,病變腎小球系膜基質(zhì)增多,呈無細(xì)胞性硬化,腎間質(zhì)及小管病變常伴發(fā);PSGN的腎小球硬化程度在50%左右,伴有其他腎小球的增生性病變及腎間質(zhì)和小管的嚴(yán)重病變;SGN的腎小球硬化超過75%以上,伴有腎間質(zhì)和小管的嚴(yán)重病變[17],原因可能為硬化程度越重,RIF程度越重。
3.3 RIF與臨床指標(biāo)的關(guān)系 本研究結(jié)果顯示,RIF組的MOD水平與Scr、血及尿β2-MG呈正相關(guān),與Hb呈負(fù)相關(guān),提示有RIF的患者,其RIF程度越重腎功能損害也越重,原因可能為CIN隨病變進(jìn)展也會(huì)累及腎小球。本研究結(jié)果顯示,CGD亞組的MOD與Hb呈負(fù)相關(guān),與胱抑素 C、血及尿β2-MG呈正相關(guān),提示慢性腎小球腎炎組的RIF程度越重,腎功能損害也越重,原因可能為臨床上CGD早期是以腎小球病變?yōu)橹鳎S著病變進(jìn)展會(huì)合并間質(zhì)及小管病變。
綜上,通過Image-Pro Plus 6.0軟件采集腎臟病理間質(zhì)圖像,計(jì)算出MOD是一種簡單、易操作,可重復(fù)性的檢測(cè)方法,并可以以量化的指標(biāo)反映RIF程度,為臨床治療提供依據(jù)及幫助,以改善患者生活質(zhì)量,延長生命。但因?yàn)楸狙芯繛榛仡櫺匝芯浚谊P(guān)于界值、靈敏度及特異度也沒有參考,臨床診斷與病理類型對(duì)RIF的關(guān)系也未進(jìn)行相關(guān)研究,因此還需大量的基礎(chǔ)研究及臨床研究來進(jìn)一步探索。
本文無利益沖突。