黃芩炭止血作用與吸附力的相關(guān)性研究

趙玉升 趙金莉 劉楚妤

摘要：目的 探索黃芩炭（Charred Radix Scutellariae，CRS）體內(nèi)止血作用與體外吸附力之間的相關(guān)性。方法 利用小鼠斷尾出血模型和肝臟出血模型，以出血時(shí)間為指標(biāo)，評(píng)價(jià)市售黃芩炭（CRS-SH）和馬弗爐燒制品（250℃，300℃，350℃）對(duì)止血效果的影響;以紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定各組黃芩炭對(duì)亞甲基藍(lán)的吸附力。結(jié)果 在小鼠斷尾出血實(shí)驗(yàn)和肝臟出血實(shí)驗(yàn)中，與生黃芩（SB）組比較，黃芩炭均能顯著減少出血時(shí)間（P<0.01），且隨著馬弗爐燒制溫度的增高，出血時(shí)間減少，出血時(shí)間長(zhǎng)短順序?yàn)椋篠B>CRS-SH>CRS-250>CRS-300>CRS-350;吸附力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，吸附力大小順序?yàn)椋篊RS-350>CRS-300>CRS-250>CRS-SH>SB。在一定范圍內(nèi)，黃芩炭的止血作用隨著吸附力的增大而增大，兩者呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)大于0.97。結(jié)論 黃芩炭止血作用與吸附力的相關(guān)性良好，吸附力的大小可以反映止血作用的強(qiáng)弱，該研究為黃芩炭質(zhì)量控制的體外評(píng)價(jià)方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃芩炭;止血作用;吸附力

【Abstract】Objective：To study the correlation between the hemostatic effect of Charred Radix Scutellariae（CRS）in vivo and the adsorption capacity in vitro. Methods：The mouse tail bleeding model and liver bleeding model were used to evaluate the hemostatic effect of commercially available CRS-SH and muffle furnace burned products（250℃，300℃ and 350℃）with bleeding time as the index. The UV-Vis spectrophotometric method was used to determine the adsorption of methylene blue by CRS in each group. Results：In the mouse tail bleeding experiment and the liver bleeding experiment，when compared with the raw scutellaria baicalensis（SB）group，the CRS could significantly reduce the bleeding time（P<0.01），and with the increase of the muffle furnace firing temperature，the bleeding time reduced. The order of bleeding time was as SB>CRS-SH>CRS-250>CRS-300>CRS-350. The results of the adsorption force experiment showed that the order of adsorption force was as CRS-350>CRS-300>CRS- 250>CRS-SH>SB. Within a certain range，the hemostatic effect of CRS increased with the increase of the adsorption force，and the two were positively correlated，and the correlation coefficient was greater than 0.97. Conclusion：The hemostatic effect of the CRS has a good correlation with the adsorption force. The size of the adsorption force can reflect the strength of the hemostatic effect. This study provides an experimental basis for the in vitro evaluation method of the quality control of the CRS.

【Key words】Charred Radix Scutellariae，hemostatic effect，adsorption force

黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi.簡(jiǎn)稱SB）的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎的功效[1]。黃芩制炭后，其止血作用增強(qiáng)[2-3]，黃芩炭（Charred Radix Scutellariae.簡(jiǎn)稱CRS）主要用于血熱導(dǎo)致的吐血、衄血、血崩等各種出血癥[3]。而有關(guān)黃芩炭的炮制方法的研究很少，現(xiàn)今中醫(yī)藥理論對(duì)于黃芩炭“燒炭存性”的標(biāo)準(zhǔn)一直停留在傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)的判斷上。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]，黃芩炒炭后吸附力明顯增加，推測(cè)是其產(chǎn)生止血的主要原因，但是到目前為止，對(duì)于止血作用與吸附力的相關(guān)性研究報(bào)道較少。本文將研究黃芩、市售黃芩炭和馬弗爐悶煅法不同溫度炮制的黃芩炭，其吸附力大小與止血效果之間的相關(guān)性，以期為黃芩炭質(zhì)量控制的體外評(píng)價(jià)方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 紫外分光光度計(jì)（CECI，英國(guó)，CECI公司）;馬弗爐（TL0612，北京中科（中國(guó)澳博科技股份有限公司）;高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（PFT-100A，溫嶺市林大機(jī)械有限公司），水浴鍋（HH-1，金壇市畫成開(kāi)元實(shí)驗(yàn)儀器廠），電子分析天平（SA1245-CW，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，），渦旋混合器（QL-901，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DGG-9240B，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），亞甲基藍(lán)為分析純（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)220D029）

1.2 材料 黃芩、市售黃芩炭購(gòu)于北京仟草中藥飲片有限公司;生理鹽水購(gòu)于石家莊四藥有限公司;白眉蛇毒血凝酶購(gòu)于錦州奧鴻藥業(yè)有限公司，水合氯醛購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙醇和其它分析級(jí)化學(xué)試劑均購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司。所有實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠，雄性，體重（30±2）g，購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物均飼養(yǎng)于同一環(huán)境下，保持室溫（25±1）℃左右，空氣濕度55%～65%，環(huán)境安靜，動(dòng)物隨意進(jìn)食進(jìn)水，明、暗12 h循環(huán)飼養(yǎng)。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前24 h禁食不禁水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 燒制黃芩炭溶液制備 每次稱取黃芩生藥100 g，放于坩堝中，鋁箔紙密封并加蓋于馬弗爐中燒制。馬弗爐程序升溫：第一階段5 min升溫至70 ℃，保溫20 min;第二階段 25 min升溫至250℃（300℃，350℃），保溫1 h。獲得的黃芩炭分別命名為CRS-250，CRS-300，CRS-350，將稱量好的黃芩放置在中藥粉碎機(jī)中粉碎。稱取粉末50 g，放置在十倍去離子水中用水浴鍋加熱，溫度設(shè)定為100℃，時(shí)間為1 h。用濾紙粗過(guò)濾殘?jiān)偈褂?.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾殘?jiān)?，合?次濾液，濃縮濾液，將濃縮后的濾液于4℃保存，留置待用。

2.1.2 黃芩生藥與市售黃芩炭溶液制備 每次稱取黃芩生藥與市售黃芩炭（CRS-SH）100 g，將稱量好的黃芩與市售黃芩炭放置在中藥粉碎機(jī)中粉碎。稱取粉末50 g，放置在十倍去離子水中用水浴鍋加熱，溫度設(shè)定為100℃，時(shí)間為1 h。用濾紙粗過(guò)濾殘?jiān)?，再使?.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾殘?jiān)喜?次濾液，濃縮濾液，將濃縮后的濾液于4℃保存，留置待用。

2.2 止血作用的研究

2.2.1 試藥配制 樣品的制備：將2.1中獲得的濃縮液放置于蒸發(fā)皿上烘干，精密稱取粉末，加入去離子水制備成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，備用。

陽(yáng)性藥的配制：取白眉蛇毒凝血酶粉末0.5 KU，加入5 mL質(zhì)量濃度為9 g/mL的氯化鈉溶液，搖勻，使其完全溶解，制得濃度為0.1 KU/mL的陽(yáng)性藥溶液，避光保存，備用。

麻醉劑：精密稱量4.0 g水合氯醛粉末，倒入磨口具塞三角瓶中，加入100 mL去離子水，震蕩使完全溶解，備用。

2.2.2 小鼠斷尾出血實(shí)驗(yàn) 取健康昆明小鼠35只，稱重并標(biāo)號(hào)，隨機(jī)分成七組，每組5只，分別為生理鹽水組（NS），白眉蛇毒血凝酶陽(yáng)性藥組（HC，白眉蛇毒血凝酶0.1 KU/mL，0.67 KU/Kg），生黃芩組（SB），黃芩炭炒制組（CRS-SH），黃芩炭不同制備溫度組（CRS-250組，CRS-300組，CRS-350組），給藥劑量為0.5 mL/30 g。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)一段時(shí)間后開(kāi)始給藥，陽(yáng)性藥組皮下注射給藥，其余各組均腹腔注射給藥。給藥后小鼠自由活動(dòng)1 h，然后用4%水合氯醛對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉。用潔凈的手術(shù)剪在距離小鼠尾尖1 cm處將小鼠尾尖剪斷，誘導(dǎo)出血，每隔30 s，使尾尖出血處接觸濾紙片，觀察出血情況，以出血開(kāi)始到出血停止的時(shí)間記為出血時(shí)間，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2.3 小鼠肝臟出血實(shí)驗(yàn) 分組和給藥同上述斷尾出血實(shí)驗(yàn)。將小鼠麻醉后，用手術(shù)剪將小鼠沿腹中線剪開(kāi)，暴露肝臟。用生理鹽水浸潤(rùn)的紗布將小鼠的肝臟墊起。用2 mL注射器針頭在小鼠肝臟刺深度為2 mm的創(chuàng)口，按下秒表開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔30 s用生理鹽水浸潤(rùn)的小濾紙片蘸一次傷口，直至濾紙片上沒(méi)有血跡，從扎破肝臟開(kāi)始出血到停止出血的時(shí)間記為出血時(shí)間，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x±s）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用方差分析。單因素ANOVA分析方法用于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，同時(shí)方差齊。組間差異則運(yùn)用LSD方法統(tǒng)計(jì)。P<0.05表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01 表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 黃芩炭的外觀性狀 馬弗爐燒制的3個(gè)不同溫度的黃芩炭、生黃芩、市售黃芩炭的外觀性狀，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，市售黃芩炭與馬弗爐不同溫度燒制的黃芩炭顏色質(zhì)地差別明顯。隨著溫度的升高，黃芩炭的炭化程度加深，顏色越來(lái)越深，而炭化產(chǎn)率逐漸降低（CRS-250的產(chǎn)率69.5%，CRS-300的產(chǎn)率56.3%，CRS-350的產(chǎn)率44.93%）。

2.4.2 出血實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在小鼠斷尾出血和肝臟出血實(shí)驗(yàn)中，與生理鹽水組比較，陽(yáng)性藥組和生黃芩組、各組黃芩炭均能顯著減少出血時(shí)間（P<0.01），結(jié)果見(jiàn)表1。在小鼠斷尾出血實(shí)驗(yàn)中，HC組與CRS-350組沒(méi)有顯著性差異，CRS-SH組與CRS-250組、CRS-300組沒(méi)有顯著性差異。在小鼠肝臟出血實(shí)驗(yàn)中，HC組與各黃芩炭組均沒(méi)有顯著性差異，CRS-350組與HC組、CRS-300組沒(méi)有顯著性差異。這表明，CRS-300組與CRS-350組在小鼠肝臟出血實(shí)驗(yàn)中具有較好的止血作用，CRS-350組在小鼠斷尾出血實(shí)驗(yàn)中有較好的止血作用，綜合兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，CRS-350組的止血效果更明顯。實(shí)驗(yàn)表明小鼠斷尾出血和肝臟出血模型的出血時(shí)間大小排列順序一致，為：SB>CRS-SH>CRS-250>CRS-300>CRS-350。

2.5 吸附力的測(cè)定

2.5.1 亞甲基藍(lán)中水分的測(cè)定 取亞甲基藍(lán)約0.2 g，置于已在105℃干燥至恒重的扁形錐形瓶中，精密稱定，于105℃干燥 5 h 后，測(cè)定其水分。結(jié)果表明亞甲基藍(lán)的含水量為 10.62%。

2.5.2 亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 取亞甲基藍(lán)約0.17 g，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加入pH≈7的磷酸鹽緩沖溶液溶解并稀釋至刻度，按公式計(jì)算，得含亞甲基藍(lán)干燥品濃度為1.5306mg/mL的亞甲基藍(lán)對(duì)照品母液，再?gòu)闹芯芰咳?.4 mL至100 mL量瓶中，加pH≈7的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度，制成每1 mL含0.02143 mg的亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液，即得。

其中：C1——以干燥品計(jì)算的亞甲基藍(lán)溶液的濃度

m——未干燥的亞甲基藍(lán)的質(zhì)量

E——亞甲基藍(lán)的水分

V——溶液體積

2.5.3 供試品溶液的制備 取2.2.1中制備的SB、CRS-SH，CRS-250，CRS-300，CRS-350粉末，各約0.1 g，精密稱定，置100 mL磨口具塞錐形瓶中，精密加入濃度為0.02143mg/mL的亞甲基藍(lán)溶液20 mL，置恒溫振蕩器上，室內(nèi)環(huán)境溫度控制在25℃左右，振蕩器轉(zhuǎn)速為150r/min，震蕩40min，濾過(guò)，即得。

2.5.4 方法學(xué)考察

2.5.4.1 線性關(guān)系考察 精密移取亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL，0.5 mL，1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，分別置25 mL容量瓶中，加pH≈7的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻。以第一份溶液為空白，在665nm處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，亞甲藍(lán)的量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程為：Y=9.1634X+0.0176，r=0.999，表明亞甲基藍(lán)在0.010715 mg～0.10715 mg之間呈良好的線性關(guān)系（表2）。

2.5.4.2 精密度試驗(yàn) 精密量取亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液3 mL置25 mL容量瓶中，加pH≈7的磷酸鹽緩沖溶液至刻度，取該溶液連續(xù)測(cè)定6次，RSD為0.21% 表明本方法精密度良好（表3）。

2.5.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取2.2.1中制備的CRS-SH粉末 0.1 g，按2.5.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，以PBS緩沖溶液為空白對(duì)照，在665 nm處測(cè)定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品溶液中游離的亞甲基藍(lán)量，并根據(jù)吸附力=吸附量/樣品量，計(jì)算出吸附力。重復(fù)性結(jié)果表明CRS的平均吸附力為1.253，RSD為0.29%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好（表4）。

2.5.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 取2.2.1中制備的CRS-SH粉末0.1 g，共6份，精密稱定，置100 mL磨口具塞錐形瓶中，每份均精密加入濃度為0.02143 mg/mL的亞甲基藍(lán)溶液20 mL，置于振蕩器上，保持室溫在20℃左右，振蕩器轉(zhuǎn)速150 r/min，震蕩40 min，濾過(guò)，測(cè)定吸光度，計(jì)算得平均回收率為103.68%，RSD為1.03%。結(jié)果見(jiàn)表5。

公式：理論未吸附量=已知準(zhǔn)確加入的亞甲基藍(lán)的量-樣品中吸附亞甲基藍(lán)的量。

回收率（%）=檢出量理論未吸附量×100%

2.5.5 樣品吸附力的測(cè)定 取2.2.1中制備的SB，CRS-SH，CRS-250，CRS-300，CRS-350的粉末，依法處理，以PBS緩沖液為空白，測(cè)定吸光度，計(jì)算出亞甲基藍(lán)未被吸附的量，進(jìn)一步計(jì)算出吸附力。結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可以得出黃芩炭比生黃芩的吸附性增加，由馬弗爐燒制的黃芩炭的吸附力更大，其排列順序?yàn)椋篊RS-350>CRS-300>CRS-250>CRS-SH>SB。

2.6 止血作用與吸附力的相關(guān)性 本研究中小鼠斷尾和肝臟出血時(shí)間反應(yīng)的是止血作用強(qiáng)弱，出血時(shí)間越短，止血作用越強(qiáng)。從圖2可以看出，在一定范圍內(nèi)，黃芩炭的出血時(shí)間與吸附力呈負(fù)相關(guān)，即止血作用與吸附力呈正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)大于0.97，相關(guān)性良好。

3 討論

馬弗爐悶煅法炮制溫度的選擇：本研究在馬弗爐悶煅法制備黃芩炭的過(guò)程中，曾設(shè)置了較低溫度200℃和較高溫度400℃兩個(gè)溫度點(diǎn)，但是200℃下制備的黃芩炭炭化程度比較低，表面呈焦黃色，與炒炭的要求相差較大，屬于炮制程度“不及”;而400℃下制備的黃芩炭已經(jīng)出現(xiàn)了明顯灰化，屬于炮制“太過(guò)”，故在兩個(gè)溫度下制備的黃芩炭均沒(méi)有進(jìn)行止血藥效實(shí)驗(yàn)。

止血實(shí)驗(yàn)：由于止血涉及多途徑的相互作用，體外止血實(shí)驗(yàn)具有一定的片面性，故本研究選擇小鼠進(jìn)行體內(nèi)止血實(shí)驗(yàn)，更能反映止血的整體效應(yīng)。在止血模型的選擇上，選取了斷尾出血和肝臟針刺出血兩個(gè)典型的出血模型[5-8]來(lái)評(píng)價(jià)黃芩炭的止血作用，結(jié)果陽(yáng)性藥物組與生理鹽水組在出血時(shí)間上有顯著差異，不同炮制方法制備的黃芩炭均表現(xiàn)出一定的止血作用。

以吸附力作為炭藥質(zhì)量控制的指標(biāo)，對(duì)炭藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和炮制工藝的研究重要意義。據(jù)報(bào)道，藕節(jié)炒炭后，吸附力增強(qiáng)，對(duì)小鼠的凝血作用增強(qiáng)[9];干姜炒炭后吸附力比生品增強(qiáng)，其止血作用也相應(yīng)增強(qiáng)[10]。而黃芩炒炭后的吸附力變化與止血藥效之間的直接關(guān)系，目前還未見(jiàn)報(bào)道。本研究明確了黃芩炭止血作用與吸附力之間呈正相關(guān)，并在一定程度上篩選出了馬弗爐悶煅法制備黃芩炭的較優(yōu)工藝條件。為將來(lái)以吸附力為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)選黃芩炭的炮制工藝、提取工藝和質(zhì)量控制等研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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