紫紅曲霉A13、Fen發(fā)酵紅曲米中莫納克林K的含量測(cè)定

劉潤(rùn)璞，孫曉東，李雨恒，韋睿

(大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連 116600)

紅曲米是我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，外表呈現(xiàn)棕紅色，質(zhì)地脆，斷面紅色，略有酸味，是利用紅曲霉在大米中發(fā)酵而成[1]。制作時(shí)將大米蒸制熟透，以紅曲霉接種，使得真菌能夠相互擴(kuò)散、傳播、生長(zhǎng)發(fā)酵。紅曲霉(Monascus)是一種典型的絲狀真菌[2，3]，也是我國(guó)在釀造微生物方面重要的一個(gè)屬，迄今已有上百年歷史。古籍中對(duì)其在食品中的應(yīng)用及功效早有記載，早在北宋時(shí)期，“紅曲煮肉”就已在陶古的《清異錄》中被提及，李時(shí)珍撰寫(xiě)的《本草綱目》中也提及紅曲霉能夠“健脾燥胃，治赤白痢”[4]。紅曲霉是能夠產(chǎn)生多種具有聚酮結(jié)構(gòu)次生代謝產(chǎn)物的菌種[5，6]，其中的次級(jí)代謝產(chǎn)物——日本遠(yuǎn)藤章教授從紅曲霉中分離出的莫納克林K，能夠有效抑制膽固醇合成，高效且低毒地降低血脂[7]。其市場(chǎng)需求量很大，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品等相關(guān)領(lǐng)域。眾多學(xué)者對(duì)其功能性、安全性、結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理等進(jìn)行了廣泛且深入的研究，取得了令人矚目的成果[8]。本研究是利用從丹東家庭自制豆醬中分離得到的紫紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生紅曲米，并從中粗提莫納克林K，對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。該研究為提高紅曲米的品質(zhì)及藥用價(jià)值，篩選莫納克林K生產(chǎn)菌奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紫紅曲霉A13、Fen：均分離自丹東地區(qū)家庭自制豆醬。

1.1.2 試劑

磷酸、甲醇、乙醇(均為色譜純)：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；高效液相用乙腈(色譜純)：德國(guó)默克公司；莫納克林K標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)：上海源葉生物科技有限公司；水(超純水)。

1.1.3 主要培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，葡萄糖15 g，水1000 mL，pH自然，用于紅曲霉菌株的純化；液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖60 g，蛋白胨25 g，NaNO32 g，KH2PO4·3H2O 1 g，MgSO4·7H2O 1 g，水1000 mL，pH 5.5；大米固體培養(yǎng)基：泰國(guó)秈米，購(gòu)于超市。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-Q全溫震蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；101-3AB電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海坤天實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；752N分光光度計(jì) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；LS-100HD壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；HH-3D恒溫水浴鍋 上海儀純實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-2D雙人凈化工作臺(tái) 上海滬凈凈化設(shè)備有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將低溫保存的紫紅曲霉菌株A13、Fen轉(zhuǎn)接于PDA平板中，于25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d。

1.3.2 液體發(fā)酵

將活化的紫紅曲霉A13、Fen分別接種于裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，加入少量滅菌的玻璃珠(打碎菌絲)，于28 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d。

1.3.3 固體發(fā)酵

使用秈米制作大米固體培養(yǎng)基。選取優(yōu)質(zhì)秈米進(jìn)行浸泡處理，使米粒充分吸水膨脹后打散，瀝干水分，分裝至500 mL罐頭瓶中，每瓶裝100 g米及50 g水，調(diào)pH至5.0，使用封口膜封緊瓶口，于121 ℃滅菌60 min。在超凈臺(tái)中將液體發(fā)酵得到的菌液接種到大米固體培養(yǎng)基中，接種量為20 mL。分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)15 d。

發(fā)酵結(jié)束后，將得到的紅曲米散開(kāi)攤平，置于60 ℃烘干箱中，直至其干燥并碾碎保存。

1.3.4 莫納克林K含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取20 mg莫納克林K標(biāo)準(zhǔn)品，使用甲醇溶解并定容到100 mL，得到200 mg/L標(biāo)樣作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別配制5，10，20，50，100，150 μg/mL 6份標(biāo)準(zhǔn)液，于4 ℃保存。

準(zhǔn)確稱(chēng)取烘干并粉碎的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物紅曲米0.50 g于25 mL比色管中，用70%乙醇分3次進(jìn)行萃取，定容至刻度線(xiàn)，萃取溫度為50 ℃。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱溫：28 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：238.0 nm；流動(dòng)相：乙腈∶0.1%磷酸溶液為65∶35(V/V)；進(jìn)樣量20 μL；流速：1.0 mL/min；所有樣品均經(jīng)過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾后方可使用。

莫納克林K含量計(jì)算公式：

式中：M為紅曲米中莫納克林K的含量，mg/g；ρ為通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算的莫納克林K的濃度，μg/mL；V為加入萃取液的體積，mL；m為樣品稱(chēng)取的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 莫納克林K標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

標(biāo)準(zhǔn)溶液依照上述方法進(jìn)樣檢測(cè)后，以峰面積為縱坐標(biāo)，莫納克林K濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到回歸方程為y=1.3949x+47.917(R2=0.9998)，莫納克林K在5～150 μg/mL內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 莫納克林K溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of Monacolin K solution

2.2 莫納克林K含量的測(cè)定

通過(guò)計(jì)算得到紫紅曲霉A13和Fen固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物紅曲米中莫納克林K的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 紫紅曲霉A13和Fen固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)莫納克林K含量Table 1 The content of Monacolin K fermented by Monascus purpureus A13 and Fen

由表1可知，兩種紫紅曲霉發(fā)酵物中產(chǎn)生莫納克林K的平均含量：A13為1.79 mg/g，F(xiàn)en為8.53 mg/g。實(shí)驗(yàn)中，每種菌設(shè)置的3個(gè)重復(fù)均呈現(xiàn)出一定程度的差異，由此推測(cè)兩株紫紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)莫納克林K具有相對(duì)的穩(wěn)定性，繼代接種后菌株個(gè)體存在差異，這直接導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)生莫納克林K的能力也存在小范圍的差異。

3 討論

紅曲霉發(fā)酵所得的次級(jí)代謝產(chǎn)物莫納克林K對(duì)治療由高膽固醇引起的高血脂、冠心病等有明顯的療效。研究表明，與人工合成或從其他微生物中提取得到的莫納克林K相比，紅曲霉發(fā)酵而成的莫納克林K具有溶解度更高、毒副作用較小等特點(diǎn)，因此療效更顯著[9]。本實(shí)驗(yàn)所使用的紫紅曲霉A13、Fen均分離自丹東家庭自制豆醬，在相同固態(tài)發(fā)酵條件下，紫紅曲霉Fen較A13發(fā)酵產(chǎn)莫納克林K的量更高。常聰?shù)壤米贤庹T變的方法得到紅曲霉QH12，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中莫納克林K產(chǎn)量為1.68 mg/g[10]；劉穎等從不同的紅曲類(lèi)產(chǎn)品中篩選得到的紅曲霉NW3-2產(chǎn)量為3.20 mg/g[11]。Suraiya Sharmin 等以褐海藻作為發(fā)酵基質(zhì)，盧穎以燕麥作為發(fā)酵基質(zhì)，分別得到莫納克林K產(chǎn)量高達(dá)13.98 mg/g和19.81 mg/g[12,13]。利用大米為發(fā)酵基質(zhì)，紫紅曲霉Fen發(fā)酵得到的次級(jí)代謝產(chǎn)物莫納克林K較上述報(bào)道的紅曲米中的產(chǎn)量略高，而低于改良或者其他基質(zhì)中的產(chǎn)量。研究表明，紫紅曲霉Fen具有一定的發(fā)酵產(chǎn)莫納克林K的能力，可以在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中挖掘最優(yōu)的培養(yǎng)基質(zhì)，并優(yōu)化其發(fā)酵條件。

本研究為首次從丹東家庭豆醬中分離得到紫紅曲霉，從豆醬中分離得到的紫紅曲霉在豆醬發(fā)酵過(guò)程中亦起著重要作用。紅曲霉分泌的糖化酶能夠與α-淀粉酶共同作用將淀粉徹底降解為葡萄糖，進(jìn)而為其他代謝提供原料，同時(shí)也成為豆醬甜味的重要來(lái)源。某些紅曲霉也能夠分泌酯化酶，催化低級(jí)脂肪酸酯的合成以及酯的水解[14]。此外，紅曲霉還有一定的抑菌作用[15]。A13和Fen分離自豆醬發(fā)酵后期，推測(cè)其也為豆醬后期顏色加深起到了一定的作用。

本研究將為篩選功能優(yōu)良的紅曲霉菌種、提高次生代謝產(chǎn)物莫納克林K產(chǎn)量和品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。