UHPLC-MS/MS同位素內(nèi)標(biāo)法測定豆制品中16種喹諾酮類藥物殘留

廖朝選，黃永橋，毛敏霞，王波娜，王正強(qiáng)，楊昌彪

(貴州省分析測試研究院，貴陽 550014)

喹諾酮類藥物(Quinolones)是近年來研究較多的一類抗菌藥，因其具有抗菌譜廣、高效、低毒性等優(yōu)點(diǎn)，常作為飼料添加劑用于畜禽及水產(chǎn)品養(yǎng)殖，廣泛用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療以及促生長等作用[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，長期使用喹諾酮類藥物會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物食品中存在藥物殘留，影響人體健康。喹諾酮類藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不良反應(yīng)，可致重癥肌無力癥狀加重、呼吸肌無力而危及生命，有潛在的致癌性和遺傳性，且易導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性等危害[3-6]，引起了人們的廣泛關(guān)注。我國、日本及世界衛(wèi)生組織、歐盟等國家和組織都將喹諾酮類藥物列入限制使用的獸藥名單中，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部2015年公布的第2292號(hào)公告中規(guī)定禁止在動(dòng)物食品中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種獸藥。

有報(bào)道顯示，為了防止豆制品變酸，延長其保質(zhì)期，有商販非法添加抗生素[7,8]。喹諾酮類主要用于動(dòng)物疾病的防治，由于其優(yōu)良的抗菌活性，非法用于食品生產(chǎn)已有相關(guān)報(bào)道[9]，豆制品不易保存的特點(diǎn)，也是喹諾酮類抗生素潛在的非法添加目標(biāo)。當(dāng)前，關(guān)于食品中喹諾酮類藥物的檢測方法較多，多集中于動(dòng)物源食品[10-12]，對于水、蔬菜及麻辣燙等不同基質(zhì)的檢測方法也有相關(guān)報(bào)道[13-15]，已經(jīng)較為成熟，但關(guān)于豆制品中的檢測方法研究較少。為了遏止一些不法商販非法使用喹諾酮類抗生素，產(chǎn)生食品安全問題，建立豆制品中快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測方法十分必要。本研究采用同位素內(nèi)標(biāo)法結(jié)合UHPLC-MS/MS聯(lián)用儀建立了同時(shí)測定豆制品中16種喹諾酮類藥物殘留的同時(shí)確證分析方法，為食品安全監(jiān)管相關(guān)工作提供了可靠的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

依諾沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、奧比沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、惡喹酸、萘啶酸、氟甲喹(純度>97%)16種喹諾酮類混標(biāo)溶液：100 μg/mL；諾氟沙星-D5溶液：100 μg/mL；環(huán)丙沙星-D8溶液：100 μg/mL；恩諾沙星-D5溶液：100 μg/mL，均購于天津阿爾塔科技有限公司；乙腈、甲醇(色譜純)：德國Merck公司；甲酸(色譜純)、HLB(200 mg/6 mL)：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；陶瓷均質(zhì)子：迪馬科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q制備的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290超高效液相色譜儀、Agilent 6470 QQQ三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜(配有電噴霧離子源) 美國Agilent公司；Blixer 3攪拌機(jī) 法國ROBOT COUPA公司； LT2002電子天平 常熟市天量儀器有限公司；UMV-2多管渦旋混合器 北京普立泰科儀器有限公司；離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；XW-80A渦旋混合器 上海米青科實(shí)業(yè)有限公司；Milli-Q超純水機(jī) 美國 Millipore公司；0.22 μm PTFE針式濾膜 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別從16種喹諾酮類混標(biāo)溶液、諾氟沙星-D5溶液、環(huán)丙沙星-D8溶液、恩諾沙星-D5溶液安瓿瓶中準(zhǔn)確移取1.00 mL于不同10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，混勻，配制成濃度為10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃下保存3個(gè)月。

中間標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確移取0.50 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于不同10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋成500 ng/mL的中間標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：移取不同體積的中間標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于不同10 mL容量瓶中，用初始流動(dòng)相稀釋成0.50～50.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中內(nèi)標(biāo)為5.0 ng/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus-C18反相色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)，美國Agilent公司；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液流動(dòng)相，B：乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積2.0 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure of mobile phase

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；毛細(xì)管電壓：4.0 kV；霧化器壓力：45 psi；干燥氣流速：10 L/min；干燥氣溫度：300 ℃；鞘氣流速：10 L/min；鞘氣溫度：300 ℃；其他質(zhì)譜條件見表2。

表2 質(zhì)譜條件Table 2 MS parameters

續(xù) 表

1.3.3 樣品前處理

提?。悍Q取5.0 g均勻樣品(精確至0.001 g)，置于50 mL離心管中，精密加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0.1 mL，加入1粒陶瓷均質(zhì)子，加入25 mL 0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，渦旋混勻10 min，4500 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL比色管中，殘?jiān)?.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液重復(fù)提取2次，每次10 mL，合并上清液至同一比色管中，用0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液定容至刻度，混勻。用濾紙過濾(必要時(shí)離心后過濾)，續(xù)濾液待凈化。

凈化：精密吸取上述待凈化液10.0 mL，以約1 mL/min的流速全部通過HLB固相萃取小柱(上樣前依次用5 mL甲醇和5 mL水活化)，用3 mL 5%甲醇水溶液淋洗，抽干，用6 mL甲醇洗脫并收集，45 ℃氮吹至近干，準(zhǔn)確加入1.0 mL流動(dòng)相初始比例復(fù)溶液溶解殘?jiān)^0.22 μm PTFE濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理優(yōu)化

本研究對比了使用0.1%甲酸乙腈溶液提取后，氮吹干用正己烷去除油脂和0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液提取，經(jīng)HLB固相萃取小柱凈化的凈化效果。結(jié)果表明，使用0.1%甲酸乙腈溶液的方法雖然快速簡單，但其去除干擾物質(zhì)的能力比HLB固相萃取小柱略差。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對使用渦旋振蕩提取和超聲提取效果及其提取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，最終確立樣品加入0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液，渦旋振蕩提取10 min，HLB固相萃取小柱凈化的樣品前處理過程。

2.2 色譜條件優(yōu)化

本研究采用超高效液相反相C18色譜柱對喹諾酮類化合物進(jìn)行分離，因?yàn)?6種喹諾酮類化合物均為正離子模式，研究表明[16]在水相中加入一定比例的甲酸能有效促進(jìn)目標(biāo)物的電離，故實(shí)驗(yàn)選用0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星等化合物很難在色譜條件下將其完全分離，實(shí)驗(yàn)對比了甲醇和乙腈對16種喹諾酮類藥物化合物分離的影響。當(dāng)使用甲醇作為有機(jī)相時(shí)，目標(biāo)物雖然響應(yīng)值更大，但目標(biāo)物的分離度較差，尤其是氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星等基本重合，無法分開；使用乙腈作為有機(jī)相時(shí)，氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星等化合物有較好的分離度，且各化合物的響應(yīng)值較好。因此綜合考慮，實(shí)驗(yàn)使用0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動(dòng)相體系，具體洗脫條件見表1。16種喹諾酮類化合物混標(biāo)溶液的重構(gòu)離子色譜圖見圖1。

圖1 16種喹諾酮類化合物混標(biāo)溶液重構(gòu)離子色譜圖(5 μg/L)Fig.1 Reconstructed ion chromatogram of mixed standard solution of 16 quinolones注：1～16分別表示依諾沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、奧比沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、惡喹酸、萘啶酸、氟甲喹。

2.3 質(zhì)譜條件選擇

根據(jù)喹諾酮類藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，易得到H+而形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子，故本研究選擇正離子模式監(jiān)測，采取直接接雙通的方法，在正離子模式下一級全掃描質(zhì)譜得到相應(yīng)準(zhǔn)分子離子峰，優(yōu)化錐孔電壓，再分別以準(zhǔn)分子離子峰為母離子進(jìn)行二級子離子掃描，選擇特征碎片中離子中響應(yīng)值高、基線噪聲低、干擾小的兩對離子對作為定性、定量離子對，通過優(yōu)化其碰撞能量、毛細(xì)管電壓、霧化器壓力、干燥和鞘氣的溫度和壓力等質(zhì)譜參數(shù)，盡可能使目標(biāo)物的響應(yīng)值達(dá)到最大，經(jīng)優(yōu)化后得到表2的質(zhì)譜參數(shù)。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

采用ESI源質(zhì)譜儀分析食品中獸藥殘留時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)是影響儀器靈敏度和重現(xiàn)性的常見因素，同位素內(nèi)標(biāo)法因其性質(zhì)與目標(biāo)物相似，在樣品中損失和受基質(zhì)影響程度相同，是常用來降低基質(zhì)效應(yīng)、提高定量準(zhǔn)確性的一種方法[17]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樣品對16種喹諾酮類化合物均存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，結(jié)果見表3，抑制效應(yīng)在47.4%～90.9%之間，基質(zhì)效應(yīng)對目標(biāo)物的影響較大。為降低基質(zhì)效應(yīng)，確保方法的靈敏度、重現(xiàn)性和定量分析的準(zhǔn)確性，本方法在樣品處理和配制標(biāo)準(zhǔn)工作液時(shí)加入已知濃度的內(nèi)標(biāo)物。方法選用諾氟沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8、恩諾沙星-D5作為相應(yīng)16種喹諾酮類化合物的內(nèi)標(biāo)物，每種化合物內(nèi)標(biāo)依據(jù)農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008[18]，16種喹諾酮類化合物對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物見表2。

表3 16種喹諾酮類化合物基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Matrix effects of 16 quinolones

續(xù) 表

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在本研究所確定的色譜和質(zhì)譜條件下，以定溶溶液配制系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以待測物標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品定量離子對與內(nèi)標(biāo)物離子對峰面積的比值為縱坐標(biāo)，分別繪制16種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線。通過向陰性樣品中添加目標(biāo)物來考察方法的檢出限(LOD，S/N=3)，見表4。結(jié)果表明，16種喹諾酮類藥物在0.50～50.00 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)在0.99以上，檢出限(LOD)均為0.50 μg/kg。

表4 線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 4 The linear equations, regression coefficients and limits of determination

2.5.2 方法精密度和回收率

采用空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)，選取豆腐陰性樣品，分別在檢出限的1倍、2倍和10倍添加濃度下，每個(gè)添加水平做6個(gè)平行，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，豆腐樣品加標(biāo)色譜圖見圖2，結(jié)果見表5。16種喹諾酮類藥物平均回收率在80.7%～107.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.5%～10.6%之間，說明該方法具有較高的回收率和精密度，適用于豆制品中不同濃度的喹諾酮類藥物殘留定性定量的檢測分析要求。

圖2 豆腐中16種喹諾酮類化合物加標(biāo)MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of 16 quinolones in tofu (5 μg/kg)

表5 加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 5 The recovery rates and precision (n=6)

3 結(jié)論

本研究建立了豆制品中16種喹諾酮類藥物殘留的同位素內(nèi)標(biāo)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測分析方法。樣品以0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液提取，經(jīng)HLB固相萃取小柱凈化和同位素內(nèi)標(biāo)法補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)，使方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均能滿足喹諾酮類藥物殘留分析檢測的要求。實(shí)驗(yàn)表明，16種喹諾酮類藥物在9 min內(nèi)完成分析，在0.50～50.00 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99，檢出限為0.5 μg/kg，在檢出限的1倍、2倍和10倍添加濃度下，16種喹諾酮類藥物平均回收率在80.7%～107.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.5%～10.6%之間。該方法分析結(jié)果能滿足16種喹諾酮類藥物對限量、回收率和精密度的分析要求，適用于豆制品中喹諾酮類藥物殘留的分析檢測。