月腺大戟素A 干預(yù)CXCR4 表達(dá)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌梗死區(qū)遷移的影響

趙玥，王瑩，趙亮，李蘭英，王奕，牌銘欣，張貴振，王強(qiáng)利

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203；3.上海寶山區(qū)羅店醫(yī)院，上海 201908；4.同濟(jì)大學(xué)附屬第四人民醫(yī)院，上海 200081

目前，干細(xì)胞治療是修復(fù)梗死心肌組織、抑制心室重構(gòu)、增強(qiáng)心功能的有效手段。然而，極低的留存率嚴(yán)重限制了干細(xì)胞修復(fù)心肌組織的潛能[1]。CXC 趨化因子受體 4（CXCR4）是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）重要受體之一，在心肌梗死后機(jī)體干細(xì)胞的動(dòng)員和向受損心肌組織遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。上調(diào)CXCR4 表達(dá)水平能明顯增強(qiáng)干細(xì)胞的遷移能力，并促使其在心肌梗死區(qū)定居，進(jìn)而增加心室壁厚度和新生血管密度，提高心功能[3-5]。因此，促進(jìn)干細(xì)胞表達(dá)CXCR4 是促進(jìn)移植干細(xì)胞向心肌梗死區(qū)遷移，增強(qiáng)干細(xì)胞治療心肌梗死作用的有效途徑。有研究顯示，中藥制劑或中藥有效成分能通過(guò)促進(jìn)干細(xì)胞表達(dá)CXCR4，增強(qiáng)其治療作用[6-7]?；谇捌谘芯繕?gòu)建了293-CXCR4 細(xì)胞株并篩選出能增強(qiáng)CXCR4 啟動(dòng)子活性的月腺大戟素A（ebracteolatain A，EA），本研究進(jìn)一步探索EA 促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）CXCR4表達(dá)的作用，并驗(yàn)證其在促進(jìn)MSCs 遷移和向梗死心肌區(qū)歸巢中的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠，雌性12 只，雄性1 只，體質(zhì)量（200±20）g，上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（滬）2014-0008。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由攝食飲水。

1.2 藥物及細(xì)胞系

EA（純度＞98%）購(gòu)于上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)ST206201-7110。293-CXCR4 細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室建立[8]。

1.3 主要試劑與儀器

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，Promega 公司；CCK-8 試劑盒，上海翊圣生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)所需的DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、100×青-鏈霉素和0.25%胰酶（含0.02%EDTA），Bioind 公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板和8.0 μmol/L Transwell 小室，Corning 公司；兔抗大鼠多克隆抗體CXCR4，Novus公司；基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase2，MMP2）、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP），Cell Signaling Technology 公司；磷酸化Akt、GAPDH，Proteintech 公司；小鼠單克隆抗體Akt，SBI公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔、抗小鼠二抗，Proteintech公司；Alexa Fluor?488 AffiniPure 山羊抗兔熒光二抗，Jackson 公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），Sigma公 司； Lipofectamine MAX 和 Opti-MEM ，ThermoFisher 公司。酶標(biāo)儀（Synergy 2，BioTek 公司），全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（Tanon 5200，上海天能），倒置熒光顯微鏡（IX51，Olympus）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

37 ℃恒溫水浴復(fù)蘇293-CXCR4 細(xì)胞，用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，每3 d 傳代1 次。

2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

將293-CXCR4 細(xì)胞以1×105/mL 的密度鋪于96孔板，待細(xì)胞匯合度約90%～95%后更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，設(shè)為4 組，分別加入終濃度為0、5、10、20 μmol/L EA，每組6 個(gè)平行孔。孵育24 h 后，用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性值。

2.3 間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)

應(yīng)用差速貼壁法分離雄性大鼠骨髓中MSCs。脫頸處死大鼠，浸泡于75%乙醇中消毒8 min，取出雙側(cè)股骨和脛骨。剔除骨組織周?chē)M織后，暴露骨髓腔，用注射器抽取10 mL PBS 沖洗骨髓腔，收集于15 mL離心管中，1000 r/min 離心10 min，棄上清液，用含10%FBS、1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以5×105個(gè)/mL 的細(xì)胞密度均勻接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3 日更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合70%～80%時(shí)傳代，取3～5 代MSCs 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 細(xì)胞毒性檢測(cè)

將MSCs 以1×105/mL 的密度接種于96 孔板，24 h 后各孔分別加入0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 μmol/L EA，每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)平行孔。孵育72 h 后按照說(shuō)明書(shū)用CCK-8 試劑盒檢測(cè)各孔細(xì)胞活力。使用Graphpad Prism 5.0 處理數(shù)據(jù)并計(jì)算IC50。

5 討論

EA 是從中藥狼毒中分離提取的一種乙酰間苯三酚類(lèi)化合物，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[10-11]。目前EA 對(duì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。在前期研究中，我們構(gòu)建了293-CXCR4 細(xì)胞株，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)篩選出能夠激活CXCR4啟動(dòng)子的中藥單體EA[8]。本研究進(jìn)一步明確EA 增強(qiáng)CXCR4 啟動(dòng)子活性的量效關(guān)系。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)低濃度（0～20 μmol/L）EA 對(duì)MSCs 無(wú)明顯細(xì)胞毒性。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用Transwell 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)EA 具有增強(qiáng)MSCs 向SDF-1 遷移的作用，且與EA 濃度呈正相關(guān)。應(yīng)用大鼠心肌梗死模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)EA 具有促進(jìn)MSCs 向心肌梗死區(qū)遷移的作用。

CXCR4 是EA 促進(jìn)MSCs 遷移的關(guān)鍵蛋白。應(yīng)用Western blot 技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)EA 能上調(diào)MSCs 的CXCR4 蛋白表達(dá)，且與EA 濃度呈正相關(guān)。因此，CXCR4 可能是參與EA 促進(jìn)MSCs 向SDF-1 遷移的關(guān)鍵蛋白。為證明這一假設(shè)，我們使用siRNA 敲低MSCs 的CXCR4 表達(dá)，結(jié)果顯示EA 促進(jìn)MSCs 遷移的能力明顯減弱。因此認(rèn)為，CXCR4 是EA 促進(jìn)MSCs遷移的關(guān)鍵蛋白。

Akt 和MMP2 是SDF-1/CXCR4 信號(hào)通路下游重要的信號(hào)分子，在細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用[12-13]。為進(jìn)一步探索EA 促進(jìn)MSCs 遷移的分子機(jī)制，我們應(yīng)用Western blot 技術(shù)檢測(cè)EA 對(duì)MSCs Akt 活性和MMP2 表達(dá)的影響，結(jié)果顯示EA 能增強(qiáng)MSCs 的Akt 活性，并促進(jìn)MMP2 表達(dá)。

綜上，本研究首次揭示EA 通過(guò)上調(diào)CXCR4 表達(dá)促進(jìn)MSCs 遷移的作用和分子機(jī)制，能為干細(xì)胞治療心肌梗死提供先導(dǎo)化合物。