miR-223-5p、BMP4與大鼠脊髓損傷的相關(guān)性分析

彭川 胡明亮 李圣杰

【摘 ?要】目的：分析miR-223-5p、BMP4與大鼠脊髓損傷的相關(guān)性;方法：選取40只標準大鼠，隨機分為觀察組和對照組，每組各20只。觀察組大鼠采用Allens法制備，對照組僅暴露脊髓。分別觀察兩組大鼠在術(shù)后2h、6h和12h的脊髓損傷情況。其中，miR-223-5p進行基因擴列，觀察其轉(zhuǎn)錄有的TNFR1 和 DR6靶向蛋白，分析兩組大鼠的miR-223-5p、BMP4陽性表達率;結(jié)果：觀察組隨著損傷時間的延長，受損脊髓段神經(jīng)元的水腫、纖維消失程度加劇，且出現(xiàn)出血性的囊腔，且上述指標的嚴重程度明顯高于對照組。同時，兩組大鼠受損脊髓段的TNFR1 、DR和BMP4陽性率顯著上述，觀察組的上述率高于對照組，存在顯著差異（p<0.05）。結(jié)論：minR-223-5p的靶向蛋白TNFR1、DR和BMP4與大鼠脊髓損傷程度正相關(guān)，可以作為SD大鼠脊髓損傷的提示指標。

【關(guān)鍵詞】脊髓損傷;靶向蛋白;miR-223-5p;BMP4

【中圖分類號】R651 ? ? ?【文獻標識碼】A ? ? ?【文章編號】1672-3783（2020）08-0045-02

脊髓損傷是受損段出現(xiàn)神經(jīng)細胞凋亡，不能正確傳輸外界刺激信號。實驗研究顯示：miR-223-5p信號通路是神經(jīng)信號傳輸?shù)慕橘|(zhì)[1]，但其與損傷神經(jīng)間的相關(guān)性尚不明確。又有研究顯示，BMP4（transforming growth factor β，TGF-β）參與脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)，是受損組織壞死的反應(yīng)，但其參與的程度尚不明確?；谏鲜鲈?，本文以miR-223-5p和BMP4為研究對象，分析兩者與大鼠脊髓損傷的相關(guān)性。

1.材料與方法

1.1材料

選擇40只SD雄性大鼠，隨機分為兩組，每組各20只。兩組大鼠的年齡、體重等方面資料無顯著差異，可以進行統(tǒng)計學分析。

1.2脊髓損傷模型制備

兩組大鼠采用不同的制備方式，觀察組先對大鼠進行1%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔麻醉，對其T10棘突位置進行切口，分離周圍肌肉。同時，用直蚊式有齒血管鉗對棘突和兩側(cè)椎板進行破壞，充分暴露硬脊膜，并用重物打擊硬膜囊造成脊髓損傷;對照組僅進行脊髓暴露，但不進行重物擊打兩組大鼠制備完成后[2]，進行單籠飼養(yǎng)，人工排尿。

1.3實驗方法和指標

兩組大鼠分別采用和PCR染色檢驗，對比大鼠的脊髓損傷程度，以及神經(jīng)元水腫和神經(jīng)纖維消失情況。其中，下肢運動功能評分以傾斜板評分和改良的Tarlov評分為主，傾斜板評分分值為1～5分，分值越高代表受損越嚴重;Tarlov評分分值為1～50分，分值越低代表受損越嚴重。

1.4統(tǒng)計學分析

利用Spss17.0統(tǒng)計軟件和Excel軟件進行分析。其中，計量采用x ?±s，計數(shù)的獨立樣本t檢驗。p<0.05代表存在顯著差異。

2.結(jié)果

2.1兩組大鼠的下肢運動評分

觀察組的IP評分和Tarlov評分均遜于對照組，存在顯著性差異（p<0.05），結(jié)果如下表所示：

2.2 miR-223-5p、BMP4與損傷程度

觀察組中大鼠的miR-223-5p的與其轉(zhuǎn)化的靶向蛋白，以及BMP4的陽性率與脊髓損傷之間存在顯著正相關(guān)（r=2.823，p=0.021），存在顯著差異，具有統(tǒng)計學意義。

3.討論

基礎(chǔ)實驗結(jié)果顯示：脊髓受損后，脊髓灰質(zhì)與白質(zhì)區(qū)的神經(jīng)元受損程度不同。白質(zhì)區(qū)域神經(jīng)元損傷主要是由于繼發(fā)損傷所致。又有臨床研究顯示，繼發(fā)性脊髓損傷所致的神經(jīng)細胞損傷經(jīng)歷水腫、壞死和凋亡等過程，BMP4是白質(zhì)區(qū)域神經(jīng)元凋亡的主要蛋白。在白質(zhì)神經(jīng)元損傷過程中，分泌大量神經(jīng)影響因子TNFR1、DR6，所以對影響因子的分析和檢測，可以判斷損傷的位置和原因，更好地為臨床治療提供幫助[3]。

3.1 脊髓損傷釋放大量miR-223-5p、BMP4

對照組大鼠脊髓組織相對比較密集，細胞核比較大，染色比較淺，且內(nèi)核清晰。大鼠脊髓損傷后12h，出現(xiàn)片狀出血，且呈現(xiàn)壞死性囊腔，神經(jīng)元水腫明顯，組織間隙較大，組織間的膠質(zhì)細胞溶解，從影像學證實大鼠脊髓出現(xiàn)損傷。TNFR1、DR6是miR-223-5p轉(zhuǎn)錄后的靶向蛋白，基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示，上述蛋白參與神經(jīng)細胞的增殖、凋亡和分化，從基因角度證實大鼠脊髓出現(xiàn)損傷。BMP4屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β范疇，是小膠質(zhì)細胞增殖和活化的反應(yīng)，出現(xiàn)于組織的炎癥反應(yīng)后。脊髓損傷后出現(xiàn)一定的嚴重，受損組織周圍細胞壞死，凋亡，釋放大量的BMP4。本文研究結(jié)果顯示，觀察組大鼠的BMP4量顯著高于對照組，進一步說明脊髓損傷與BMP4有關(guān)。同時，部分研究結(jié)果顯示，神經(jīng)組織損傷，或者缺血性損傷，會導致受損組織出現(xiàn)磷酸化，增加BMP4的釋放量。兩組大鼠在12h后，miR-223-5p釋放量增加，導致TNFR1、DR6的陽性率提高，而且組織的磷酸化使得BMP的釋放量進一步增強。由此可知，大鼠脊髓發(fā)生繼發(fā)性損傷后，TNFR1、DR6和BMP4的釋放量增加，進而陽性率提高。

3.2 miR-223-5p、BMP4促使損傷加劇

研究結(jié)果顯示，兩組大鼠的3h、6h和12h 后miR-223-5p的靶向蛋白TNFR1、DR6， 以及BMP4均呈現(xiàn)增加趨勢，說明大鼠脊髓損傷后，炎癥反應(yīng)逐漸增強。已有研究表明，在神經(jīng)元損傷后，膠質(zhì)細胞的凋亡加快，致使miR-223-5p轉(zhuǎn)錄表達增強，TNFR1、DR6的陽性率升高。研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在大鼠脊髓損傷3h時，觀察組和對照組的miR-223-5p的表達增加量差異較小，而在6h、12h時增加量飆升。同時，伴隨TNFR1、DR6表達的增強，BMP的表達也隨之急劇增加， 初步證實TNFR1、DR6與BMP4參與脊髓神經(jīng)細胞的凋亡，與繼發(fā)性脊髓損傷相關(guān)。另外一個方面，脊髓損傷會增加周圍組織的磷酸化，使得BMP4的活性受到抑制，使得膠質(zhì)細胞的增殖和活化能力減弱，進一步促進組織凋亡，增強損傷后的炎癥反應(yīng)。大鼠的脊髓受損后，血液中炎性細胞數(shù)量激增，而炎性細胞與內(nèi)皮細胞產(chǎn)生會產(chǎn)生活氧化物（ROS，reactive oxygen species）和炎性因子，本文研究結(jié)果中TNF-α、IL-1β和BMP4隨著大鼠脊髓損傷的加劇，三者的陽性率顯著提高。國內(nèi)研究結(jié)果顯示，TNF-α、IL-1β是神經(jīng)炎凋亡、脊髓白質(zhì)的主要炎性介質(zhì)，而且TNF-α與BMP4的結(jié)合，可以活化RIP1復合物參，使得脊髓受損組織出現(xiàn)再灌注血，增加組織內(nèi)的炎性因子量。所以，本研究中，觀察組大眾的miR-223靶向蛋白TNF-α和IL-1β陽性率激增。另外，有研究結(jié)果顯示，BMP4是神經(jīng)元組織間膠質(zhì)消失的標志物，所以觀察組的BMP4在3h、6h和12h階段量顯著增加，而且在12h的增加量激增，提示隨著損傷的延長，脊髓中的神經(jīng)元、神經(jīng)纖維消失加快。12h時出現(xiàn)血液再灌注的問題，進一步增加組織的炎癥因子量，促使神經(jīng)細胞消亡，加劇神經(jīng)組織的損傷。

綜上所述，minR-223-5p的靶向蛋白TNFR1、DR和BMP4與大鼠脊髓損傷程度正相關(guān)，可以作為SD大鼠脊髓損傷的提示指標。

參考文獻

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墊江縣技術(shù)研發(fā)與示范應(yīng)用項目，項目名稱：miR-223-5p通過BMP4調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞分化在脊髓損傷修復中的研究，項目編號：djkjxm2018jsyfysfyy031