熒光免疫層析法與試管凝集試驗檢測布魯氏菌病抗體的分析比較

高樹朋 張明飛 張賀森 高永士

（1.阜陽市動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽阜陽 236000；2.成都微瑞生物科技有限公司，四川成都 610000）

布魯氏菌?。╞rucellosis）簡稱布病，是由布魯氏桿菌屬細菌引起牛、羊、豬、鹿、犬等哺乳動物和人類共患的一種傳染病。布魯氏菌屬分6個種19個型，即羊種布魯氏桿菌（3個型）、牛種布魯氏桿菌（8個型）、豬種布魯氏桿菌（5個型）、綿羊附睪種布魯氏桿菌（1個型）、沙漠森林野鼠種布魯氏桿菌（1個型）和狗種布魯氏桿菌（1個型）。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病，流行的主要是羊、牛、豬三種布魯氏菌病，其中以羊布魯氏菌病最為多見，其次是牛布魯氏菌病。近年來，隨著我國家畜飼養(yǎng)量不斷增加，動物及其產(chǎn)品流通頻繁，部分地區(qū)布魯氏菌病等人畜共患病呈持續(xù)上升勢頭，不僅嚴重影響畜牧業(yè)生產(chǎn)，也嚴重危及人民身體健康和公共衛(wèi)生安全。

根據(jù)《國家布魯氏菌病防治計劃》（2016-2020年）要求，安徽省作為二類地區(qū)采取以監(jiān)測凈化為主的防控策略，亟需開展家畜布魯氏菌病抗體監(jiān)測。實驗室一般依據(jù)《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T18646-2018）標準，通常采用“虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗”開展家畜布魯氏菌病診斷檢測。隨著熒光免疫層析技術(shù)發(fā)展，廣泛應(yīng)用于動物疫病診斷檢測方面?，F(xiàn)就“熒光免疫層析法”與試管凝集試驗進行分析比較。

1 樣品來源

2018年承擔實施全省牛羊布魯氏菌病監(jiān)測凈化項目，開展奶牛、種羊監(jiān)測全覆蓋，其他牛羊按比例抽樣監(jiān)測。全年合計監(jiān)測22451份血清（包括第一次抽樣監(jiān)測10421份，第二次抽樣監(jiān)測12030份）。考慮檢測成本，所有樣品經(jīng)虎紅平板凝集試驗初篩，陽性血清351份（其中第一次抽樣中134份，第二次抽樣中217份），開展試管凝集試驗和熒光免疫層析法檢測分析比較。

2 試驗材料

2.1 試管凝集試驗

抗原（5ml/瓶）、陽性血清（1ml/瓶）、陰性血清（2ml/瓶），恒溫培養(yǎng)箱、離心機，其他試劑及試驗耗材。

2.2 高敏熒光免疫層析法

高敏熒光分析儀配套檢測箱、布魯氏桿菌抗體定量檢測試劑卡（采用熒光免疫層析技術(shù)），試驗耗材。

3 試驗方法

3.1 試管凝集試驗

步驟參照《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T18646）執(zhí)行，需倍比稀釋并置37～40℃溫育24h。

3.2 熒光免疫層析法

3.2.1 準備：①試劑卡與被檢樣本復(fù)溫；②按熒光儀電源鍵（燈亮）；③啟動手機微瑞云檢測APP；④掃描試劑盒上的二維碼，在線獲取標準曲線；⑤建立工作目錄，選擇標準曲線；⑥按待測樣本在EP管上做好標識；

3.2.2 稀釋：10倍稀釋。即每支稀釋管中先加入180μl稀釋液，再加被檢樣本20μl，混勻待檢；

3.2.3 加樣：取80μl稀釋混勻待檢樣本，按對應(yīng)編號依次有序加入試劑卡加樣孔中；

3.2.4 檢測：靜置15min（注意避光），將檢測卡放入高敏熒光儀完成“檢測”操作，顯示檢測結(jié)果。在確保依次加樣和依次檢測的時間間隔一致時，只需第一份加樣后等待15min，然后進行連續(xù)檢測。

4 試驗結(jié)果

（1）通過虎紅平板凝集試驗初篩陽性血清351份，經(jīng)試管凝集試驗檢測結(jié)果詳見表1，判定其中339份為陽性，6份為陰性，6份為可疑。

表1

（2）通過熒光免疫層析法檢測（虎紅平板凝集試驗初篩陽性血清351份）結(jié)果詳見表2，判定其中335份為陽性，12份為陰性，4份可疑。

表2

結(jié)果判定標準為布病抗體效價（1～1600效價）。效價＞50為陽性，代表保護抗體有保護或被布魯氏桿菌感染；效價＜25以下為陰性，代表保護抗體不保護或尚未被布魯氏桿菌感染；效價25～50之間為可疑，需30天后采血重檢，如果仍為可疑，判為陽性。

（3）熒光免疫層析法與試管凝集試驗的陽性檢出率詳見表3，陽性檢出率差值1.2%（其中第一次陽性檢出率差值0，第二次陽性檢出率差值1.9%）。熒光免疫層析法與試管凝集試驗的檢出率符合度為335/339*100%=98.8%（其中第一次132/132*100%=100%，第二次203/207*100%=98.1%）。

5 分析討論

5.1 試驗時間要求

按照《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T18646），對虎紅平板凝集試驗初篩陽性樣本進一步開展試管凝集試驗核查。該試驗耗時較長，除操作步驟外，需置37～40℃溫育24h，方可觀察結(jié)果；熒光免疫層析法在確保依次加樣和依次檢測的時間間隔一致時，只需第一份加樣后等待15min，然后進行連續(xù)檢測，實現(xiàn)高通量檢測。

5.2 實驗人員要求

布病試管凝集試驗操作復(fù)雜，需要專業(yè)技術(shù)人員開展，結(jié)果判定需肉眼對比觀察，需具備一定試驗經(jīng)驗；熒光免疫層析法操作簡便，采用手機操控高敏熒光分析儀檢測、云計算，人為因素影響小，靈敏度高。

5.3 試驗條件要求

布病試管凝集試驗必須在實驗室內(nèi)進行，需具備實驗臺、培養(yǎng)箱等儀器設(shè)備及化學(xué)試劑、耗材等；熒光免疫層析法所用儀器設(shè)備、耗材等均放置便攜式檢測箱，更適于基層畜牧獸醫(yī)部門和養(yǎng)殖場戶現(xiàn)場開展檢測。

表3

5.4 實驗結(jié)果分析

兩種試驗方法檢測布魯氏菌病抗體陽性檢出率符合度達98.8%，說明熒光免疫層析法適用于布魯氏菌病抗體檢測，結(jié)果科學(xué)準確。布病試管凝集試驗僅對被檢樣品進行陰、陽性的定性判定，無法進行定量計算；熒光免疫層析法直接對被檢樣品進行定量計算，通過手機自動顯示、保存，實現(xiàn)即時布魯氏菌抗體定量精準檢測。