Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化黃柏鹽酸小檗堿的提取工藝

胡玲玲

(安康學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院， 陜西 安康 725000)

黃柏(Cortexphellodendri )是由蕓香科黃檗屬落葉喬木黃檗或黃皮樹(shù)(PhellodendronchinenseSchneid)的干燥樹(shù)皮制成。是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材之一，藥用價(jià)值很高，生用性寒苦，能清熱解毒，治療熱毒瘡瘍等[1-3]，也可經(jīng)炮制使用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃柏具有與黃連相似的抗病原微生物作用[4]，其提取物中含有多種生物堿，如小檗堿、黃柏堿、巴馬亭、藥根堿、木蘭花堿等。這些生物堿有降壓利膽、抗?jié)?、?zhèn)靜等作用[5-7]。鹽酸小檗堿是黃柏提取物中的主要有效成分之一，具有廣譜的抗菌活性。黃柏小檗堿的傳統(tǒng)提取方法有石灰乳法、酸水法和醇提法等。近年來(lái)發(fā)展的酶輔助法和超聲輔助法[ 8-10]避免了高溫引起的藥物活性成分結(jié)構(gòu)的變化，且具有省時(shí)、節(jié)能的特點(diǎn)。試驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法[11-14]，研究超聲輔助提取不同因素對(duì)提取率的影響，優(yōu)化超聲輔助法提取黃柏小檗堿的工藝，提高其提取率，以期為黃柏的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材 黃柏：購(gòu)自于安康市藥材公司。

1.1.2 試劑 無(wú)水乙醇(AR) ，天津市天力化學(xué)試劑有限公司； 鹽酸小檗堿對(duì)照品，上海源葉生物科技有限公司；濃鹽酸(AR)， 天津市東麗區(qū)新中村； 去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.3 儀器 L5S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；KQ2200E型超聲波清洗儀(40 kHz，250 w)，昆山市超聲儀器有限公司；中草藥粉碎機(jī)(FW177型)， 天津市泰斯特儀器有限公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋，上海科偉永興儀器有限公司；FD-1A-80臺(tái)式冷凍干燥機(jī)，上海予騰生物科技有限公司； 電子分析天平(AE224)，舜宇恒平儀器。

1.2 方法

1.2.1 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 用電子分析天平(AE224)稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品20 mg，加熱溶解，容量瓶中定容至100 mL，配制成0.2 mg/mL的鹽酸小檗堿的儲(chǔ)備液。用吸量管分別吸取儲(chǔ)備液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL于25 mL的容量瓶中，用去離子水定容，制成系列濃度的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。用去離子水做空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)掃描波長(zhǎng)，345 nm處有最大吸光度。故在波長(zhǎng)345 nm處測(cè)定對(duì)照品溶液的吸光度[15-16]。分別以吸光度和鹽酸小檗堿濃度為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，得到回歸方程y=0.009 6x+0.184 4 ；R2=0.999 2。鹽酸小檗堿濃度在4～40 μg/mL線(xiàn)性關(guān)系良好。

1.2.2 鹽酸小檗堿的提取和提取率的計(jì)算 將黃柏用中藥粉碎機(jī)粉碎，過(guò)16目篩，精密稱(chēng)取黃柏粉末5 g于具塞錐形瓶，加入一定量的提取溶劑，浸泡24 h，設(shè)定提取的超聲溫度和超聲時(shí)間。提取液趁熱抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至粘稠狀態(tài)后轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中用去離子水定容，吸量管吸取1 mL溶液并稀釋至100 mL，在波長(zhǎng)345 nm處分別測(cè)其吸光度并計(jì)算鹽酸小檗堿的提取率。

式中，C為鹽酸小檗堿濃度(μg/mL)；V為濃縮液定容體積；n為稀釋倍數(shù)；m為黃柏粉末的質(zhì)量(g)。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1) 超聲時(shí)間。以HCl-70%乙醇(1∶100)為提取溶劑，液料比30∶1(mL∶g，下同)，超聲溫度60℃，分別超聲提取20 min、30 min、40 min、50 min和60 min，取其濾液，定容稀釋、測(cè)定吸光度并計(jì)算鹽酸小檗堿的提取率。

2) 超聲溫度。以HCl-70%乙醇(1∶100)為提取溶劑，液料比30∶1，分別在30℃、40℃、50℃、60℃和70℃的條件下超聲提取50 min，取其濾液，定容稀釋、測(cè)定吸光度并計(jì)算鹽酸小檗堿的提取率。

3) 乙醇濃度。液料比30∶1， 超聲溫度60℃，超聲提取時(shí)間50 min,分別以HCl-50%乙醇、HCl-60%乙醇、HCl-70%乙醇、HCl-80%乙醇及HCl-90%乙醇(1∶100)為提取溶劑進(jìn)行超聲處理，取其濾液，定容稀釋、測(cè)定吸光度并計(jì)算鹽酸小檗堿的提取率。

4) 液料比。用HCl-70%乙醇(1∶100)為溶劑，液料比分別為10∶1、20∶1，30∶1、40∶1、50∶1，超聲溫度60℃，超聲提取50 min，取其濾液，定容稀釋、測(cè)定吸光度并計(jì)算鹽酸小檗堿的提取率。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選出影響鹽酸小檗堿提取較顯著的3個(gè)因素采用Design-Expert 8.0.6，結(jié)合Box-Benhnken的中心試驗(yàn)原理，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。其因素水平見(jiàn)表1。

表1 黃柏鹽酸小檗堿提取的響應(yīng)面因素及水平

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Design Expert8.0.6對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析，建立回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)黃柏鹽酸小檗堿提取率的影響

從圖1可知不同超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比及乙醇濃度條件下黃柏鹽酸小檗堿的提取率。

2.1.1 超聲時(shí)間 黃柏鹽酸小檗堿的提取率隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，在50～60 min雖為增長(zhǎng)趨勢(shì)，但增幅降低。提取率趨于平穩(wěn)，可能是因?yàn)槌晻r(shí)間增長(zhǎng)使得破壁更碎，雜質(zhì)析出更多，與小檗堿競(jìng)爭(zhēng)溶于提取液，使得鹽酸小檗堿的提取率增幅減緩。故選擇超聲提取時(shí)間為40 min。

2.1.2 超聲溫度 隨著溫度的升高，黃柏鹽酸小檗堿的提取率也快速上升。60℃時(shí)，提取率最大，為6.68%。隨著溫度的繼續(xù)上升提取率呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，鹽酸小檗堿的結(jié)構(gòu)在超聲條件下，隨著溫度的提高受到了破壞，表現(xiàn)出提取率下降。故選擇超聲提取的溫度為60℃。

2.1.3 液料比 隨加入提取溶劑量的增多，黃柏鹽酸小檗堿的提取率呈先升后降趨勢(shì)。在30∶1時(shí)提取率最大，為6.46%。故選擇液料比為30∶1。

2.1.4 乙醇濃度 隨提取液乙醇濃度的增大，黃柏鹽酸小檗堿的提取率呈先升后降趨勢(shì)，當(dāng)溶劑中乙醇濃度為70%時(shí)，黃柏鹽酸小檗堿提取率最大，為6.38%。推測(cè)可能是鹽酸小檗堿的極性與70%的乙醇的極性相似，所以溶解度最大。故選擇提取溶劑的乙醇濃度為70%。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化黃柏鹽酸小檗堿提取工藝

2.2.1 回歸模型的建立 從表2可知不同處理的黃柏小檗堿提取率。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析得線(xiàn)性回歸方程模型：Y=6.75+0.064A-0.047B+0.23C-0.19AB+0.020AC-0.0075BC-0.55A2-0.30B2-0.76C2。方差分析表明，該回歸模型P<0.000 1，該模型極顯著；且失擬值項(xiàng)中P=0.611 4，不顯著；R2=0.995 7，RAdj2=0.990 3，表明該模型可靠。方差分析表明，超聲時(shí)間P=0.014 9(<0.05)，料液比P<0.0001。各因素對(duì)提取率的影響依次為C(液料比)>A(超聲時(shí)間)>B(超聲溫度)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)各處理的黃柏鹽酸小檗堿提取率

2.2.2 不同因素的交互作用 從圖2可知，液料比和超聲時(shí)間的響應(yīng)曲面較陡，表明液料比和超聲時(shí)間對(duì)黃柏鹽酸小檗堿提取率的影響顯著；超聲溫度和料液比的曲面相對(duì)較平緩，說(shuō)明超聲溫度和料液比對(duì)提取率的影響不顯著，與方差分析結(jié)果一致。超聲時(shí)間和超聲溫度的等高線(xiàn)呈明顯的橢圓形，響應(yīng)面曲線(xiàn)較陡，表明超聲時(shí)間和超聲溫度間的交互作用較強(qiáng)，且方差分析結(jié)果中，交互項(xiàng)AB的P=0.000 3(<0.01)，也說(shuō)明超聲時(shí)間和超聲溫度因素間存在顯著的交互作用。液料比與超聲時(shí)間，液料比與超聲溫度的等高線(xiàn)不呈明顯的橢圓形，表明交互作用不明顯，與方差分析結(jié)果一致(AC項(xiàng)和BC項(xiàng)P>0.05)。

2.2.3 最佳提取條件的確定 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得的結(jié)果和回歸方程，預(yù)測(cè)超聲波輔助提取黃柏鹽酸小檗堿的最優(yōu)工藝為超聲時(shí)間40.77 min，超聲溫度58.95℃，液料比為31.54∶1(mL∶g)，該條件下，預(yù)測(cè)黃柏鹽酸小檗堿的提取率為6.77%；考慮到實(shí)際操作，將最佳提取工藝修正為超聲時(shí)間40 min，超聲溫度59℃，液料比30∶1(mL∶g)，經(jīng)3次平行測(cè)試，黃柏鹽酸小檗堿的提取率為6.73%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.59%，說(shuō)明，該工藝可靠。

3 小結(jié)

以HCL-70%乙醇(1∶100)為溶劑，對(duì)超聲輔助提取黃柏鹽酸小檗堿的工藝優(yōu)化結(jié)果表明，最佳提取工藝為超聲時(shí)間40 min，超聲溫度59℃，液料比為30∶1(mL∶g)，在該條件下，黃柏鹽酸小檗堿的提取率較高，為6.73%。