鐵皮石斛基因克隆的研究進(jìn)展

楊鶴同， 史 俊， 席剛俊

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 江蘇 句容 212400)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)(干品稱鐵皮楓斗)屬國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物。在我國(guó)自然分布于浙江、安徽、福建、湖南、廣西、四川和云南等地人跡罕至的懸崖峭壁背陰處的石縫里，生長(zhǎng)期3～5 a，是名貴的藥食同源滋補(bǔ)佳品，除此以外，鐵皮石斛還有“藥中黃金”、“藥界大熊貓”、“中華九大仙草之首”等美譽(yù)。其顯著的藥用價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值導(dǎo)至其在20世紀(jì)80-90年代遭到掠奪性采挖，加上鐵皮石斛種子微小，需與真菌共生才能萌發(fā)，其萌發(fā)率極低，造成鐵皮石斛野生資源瀕臨滅絕。

多年來(lái)，為改變其瀕危狀態(tài)，科研人員對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行了大量研究，但研究多集中于種質(zhì)資源調(diào)查，種苗快繁、栽培等應(yīng)用研究方面。近年隨著研究的不斷深入，種苗快繁、規(guī)模化栽培等技術(shù)相繼被攻克。為了更好地提高鐵皮石斛產(chǎn)量及品質(zhì)，增加有效成分含量，提高抗逆水平等，對(duì)鐵皮石斛重要基因的研究提上了日程。到目前為止，人們已通過(guò)圖位克隆、RACE、RT-PCR、mRNA差別顯示等技術(shù)成功分離克隆了多個(gè)基因，通過(guò)對(duì)其功能進(jìn)行初步分析發(fā)現(xiàn)，這些基因大多與鐵皮石斛有效成分合成、生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆等方面相關(guān)。筆者等通過(guò)對(duì)鐵皮石斛基因克隆相關(guān)研究進(jìn)行綜述，以期為鐵皮石斛功能基因組的研究提供參考。

1 與有效成分合成相關(guān)的基因克隆

1.1 多糖

鐵皮石斛的主要有效成分為石斛多糖，是水溶性多糖，合成石斛多糖所需的單糖主要有葡萄糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖等，其中，葡萄糖含量達(dá)64.7%，而這些單糖主要來(lái)源于蔗糖的水解產(chǎn)生和衍生。孟衡玲等[1-2]于2011年和2013年采用RT-PCR和RACE法分別克隆了鐵皮石斛蔗糖合成酶基因(DOSS1)[1]和蔗糖磷酸合成酶(SPS)[2]基因，鐵皮石斛蔗糖合成酶基因的cDNA全長(zhǎng)2 424 bp，編碼807個(gè)氨基酸，與蘭科植物同源性高達(dá)95%，具有分解和合成蔗糖的雙重屬性，在調(diào)控蔗糖代謝中可能起著重要作用，但普遍認(rèn)為蔗糖合成酶的主要功能是分解蔗糖，為多糖的合成提供前體。何春梅等[3]以鐵皮石斛莖段為材料，分離克隆了多糖合成代謝途徑中的磷酸甘露糖酶(phosphomannomutase;DoPMM)基因、GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-Mannose pyrophosphorylase;GMPase)基因以及β型甘露糖糖基轉(zhuǎn)移酶(4-beta-Mannosyl-transferase)基因。GDP-Mannose 焦磷酸酸化酶(GMPase)以 D-Mannose-1-phosphate 為底物，催化生產(chǎn)甘露糖的活化形式 GDP-Mannose，為多糖的合成底物。β 型甘露糖糖基轉(zhuǎn)移酶(4-beta-mannosyltransferase)，以 GDP-Mannose 為底物，將甘露糖轉(zhuǎn)移到糖鏈上，主要參與β型的甘露聚糖的合成。張春柳等[4]從鐵皮石斛原球莖中克隆了 2 個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因(DoGAUT1 和DoPGSIP6)，其表達(dá)產(chǎn)物能識(shí)別不同類(lèi)型受體，最終生成多糖、復(fù)合糖、糖苷化合物等次生代謝產(chǎn)物。張琳等[5]從云南野生鐵皮石斛中分離克隆了鐵皮石斛丙酮酸激酶基因DoPK，其表達(dá)產(chǎn)物是糖酵解途徑最后一步關(guān)鍵限速酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)將高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移給 ADP 生成ATP 和一分子丙酮酸，對(duì)石斛多糖合成代謝有一定的調(diào)控作用。

1.2 生物堿

生物堿是鐵皮石斛重要的有效成分之一，具有止痛解熱、抗腫瘤的功效，對(duì)心血管、胃腸道等疾病有抑制作用[6]。鐵皮石斛的生物堿大多屬于倍半萜類(lèi)生物堿或萜類(lèi)吲哚生物堿，兩類(lèi)生物堿生物合成均起源于萜類(lèi)途徑(MEP 途徑、MVA途徑)[7]。吳秋菊等[8-9]從鐵皮石斛中分離克隆了4-羥基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸還原酶(HDR)基因，該基因的表達(dá)產(chǎn)物是萜類(lèi)合成 MEP 途徑中的末端活性酶，為萜類(lèi)合成提供前體并進(jìn)行限速，表明該基因與鐵皮石斛生物堿的合成與積累有關(guān)。張琳等[10-11]從鐵皮石斛和霍山石斛中分離克隆了3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶 A 還原酶(HMGR)基因，該基因的表達(dá)產(chǎn)物是萜類(lèi)合成 MVA 途徑中的第一個(gè)限速酶。張崗等[12]克隆了鐵皮石斛萜類(lèi)合成 MVA 途徑中另一個(gè)關(guān)鍵酶基因鯊烯合酶基因(DoSS)，為鐵皮石斛萜類(lèi)物質(zhì)合成代謝途徑的分子調(diào)控作用研究奠定基礎(chǔ)。林榕燕[11]從霍山石斛中克隆了2條FPS基因全長(zhǎng)cDNA，基因表達(dá)的試驗(yàn)結(jié)果表明，該基因參與倍半萜類(lèi)生物堿合成相關(guān)，且其表達(dá)水平與生物堿的含量呈正相關(guān)。苯丙烷類(lèi)途徑是植物次生代謝產(chǎn)物包括生物堿前體產(chǎn)生的主要途徑，苯丙氨酸解氨酶是這一途徑的關(guān)鍵酶和限速酶。姚瑤[13]首次從鐵皮石斛中分離克隆了鐵皮石斛苯丙氨酸解氨酶基因(DcPLA)，對(duì)解決石斛生物堿含量較低的問(wèn)題具有重要意義。

2 與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因克隆

2.1 光合作用

鐵皮石斛為景天酸(CAM)代謝途徑植物，隨著環(huán)境條件的變化，其光合作用在CAM 與C3 途徑間變化[14]。鐵皮石斛磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pepc)全長(zhǎng)2 895 bp，編碼964個(gè)氨基酸，表達(dá)產(chǎn)物催化C4 和CAM 代謝途徑中的第一步反應(yīng)，是光合作用源頭的關(guān)鍵酶，在F型鐵皮石斛中的表達(dá)量要遠(yuǎn)高于H型[15]。Rubisco是所有光合生物進(jìn)行光合碳同化的關(guān)鍵酶，但只有處于活化態(tài)時(shí)，才能催化CO2固定。Rubisco活化酶(Rubisco activase，RCA)是一種核編碼的可溶性葉綠體蛋白，具有調(diào)節(jié)和控制Rubisco活性的作用。崔波等[16]首次從鐵皮石斛中分離克隆了Rubisco活化酶基因(DoRAC)，發(fā)現(xiàn)DoRAC有明顯的光誘導(dǎo)表達(dá)特性。AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子是具有1～2個(gè)編碼高度保守的AP2/EREBPDNA結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含有約60個(gè)氨基酸殘基[17]。王瑜等[18]從鐵皮石斛的文庫(kù)中篩選得到3條AP2/EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子cDNA，分別命名為T(mén)EREB5、JEREB1和AP1，對(duì)TEREB5進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，TEREB5可能對(duì)葉綠素合成有一定的抑制作用。

2.2 真菌共生

蘭科植物是一種獨(dú)特的菌根植物，菌根真菌可以侵染鐵皮石斛等多種蘭科植物根皮層，形成典型的蘭科菌根，為鐵皮石斛等蘭科植物提供全部或部分的營(yíng)養(yǎng)[19]。鐵皮石斛中多個(gè)生理代謝途徑參與真菌共生機(jī)制。趙明明等[20]從鐵皮石斛中克隆了S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因 (DoSAMDC)，其表達(dá)產(chǎn)物為多胺合成的關(guān)鍵酶，該酶通過(guò)調(diào)節(jié)多胺的代謝途徑參與植物的多項(xiàng)生理生化過(guò)程，具有受真菌侵染誘導(dǎo)表達(dá)的特性，表明其可能通過(guò)參與多胺調(diào)控途徑在鐵皮石斛-真菌共生方面發(fā)揮作用。張崗等[21-22]克隆了鐵皮石斛鈣依賴蛋白激酶基因DoCPK2、DoCPK3、DoCDPK1、DoCDPK32-like，這些基因在鐵皮石斛與真菌共生中起重要作用，DoCDPK1 基因與DoCDPK32-like基因在接菌共生萌發(fā)的種子中均上調(diào)表達(dá)，廣泛參與了鐵皮石斛種子共生萌發(fā)的基因調(diào)控途徑。促分裂原活化蛋白激酶基因DoMPK1 在小菇真菌侵染鐵皮石斛30 d的根中，表達(dá)量顯著上調(diào)，表明DoMPK1 可能在小菇真菌-鐵皮石斛菌根共生早期互作過(guò)程中起作用[23]。

3 與抗逆相關(guān)的基因克隆

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列用于調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng)發(fā)育、抵御生物和非生物脅迫逆境的機(jī)制。有多個(gè)基因和基因家族參與抗逆反應(yīng)。植物存在一個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，在其接受到脅迫信號(hào)后，并作出應(yīng)答反應(yīng)，最終誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)抵御各種脅迫。該系統(tǒng)通過(guò)一系列的信號(hào)傳遞最終激活或抑制某些相關(guān)基因的表達(dá)，以達(dá)到抵抗逆境的目的[24]。在調(diào)節(jié)抗逆基因表達(dá)的過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子起著重要作用[25]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答休戚相關(guān)，是植物中非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子因其 N-末端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列而得名[26-27]，廣泛參與植物的抗逆反應(yīng)，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控和抗病防御反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控子[28-29]。目前已從擬南芥中分離74 個(gè)WRKY基因，水稻中也分離出 109 個(gè)成員。鐵皮石斛WRKY基因克隆研究工作開(kāi)展較晚，到目前為止，已從鐵皮石斛中克隆了5個(gè)WRKY基因家族成員，分別是DoWRKY1[30]、DoWRKY2[31]、DoWRKY5[32]、DoWRKY11[33]和DoWRKY29[34]。

4 其他

為進(jìn)一步了解鐵皮石斛生理生化代謝，相關(guān)研究人員還從鐵皮石斛中克隆了多個(gè)其他基因，如在鐵皮石斛種子萌發(fā)中起重要調(diào)控作用的赤霉素3-氧化酶基因DoGA3ox[35]；廣泛參與鐵皮石斛胚胎發(fā)生過(guò)程及其他生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程體細(xì)胞胚胎發(fā)生類(lèi)受體激酶基因DoSEPK[36]及NAC基因家族[37]；與細(xì)胞分裂相關(guān)的鐵皮石斛促分裂原活化蛋白激酶基因DoMPK2[38]和DoMPK4[39]；與鐵皮石斛木質(zhì)素合成相關(guān)的鐵皮石斛咖啡酰輔酶A氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因DoOMT[40]；控制鋅離子在鐵皮石斛內(nèi)的生理平衡，維持鐵皮石斛正常生理代謝的鐵皮石斛鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因DoZIP1[41]等。

5 小結(jié)

長(zhǎng)期以來(lái)，鐵皮石斛的研究多集中于種苗組培繁育、栽培技術(shù)和植保生防等應(yīng)用領(lǐng)域，分子生物學(xué)等基礎(chǔ)研究較少，還沒(méi)有建立鐵皮石斛的純合系，因此在鐵皮石斛基因克隆上也多采用RACE、差減抑制雜交等同源克隆法。到目前為止，鐵皮石斛研究人員雖然從鐵皮石斛中克隆了約50個(gè)基因，涉及鐵皮石斛多糖合成、生物堿合成、抗逆和光合作用等多個(gè)方面，但由于鐵皮石斛未建立起高效轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，基因如何表達(dá)，具體功能是什么，基因間相互作用的機(jī)制尚不明確，這將是以后的研究方向。