紅肉火龍果 TST基因家族的生物信息學分析

鄭乾明， 王小柯， 馬玉華

(貴州省農(nóng)業(yè)科學院 果樹科學研究所， 貴州 貴陽 550006)

火龍果是仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereus)多年生果樹，其果實色澤鮮艷、營養(yǎng)豐富，深受消費者歡迎。研究表明，成熟火龍果果實積累的可溶性糖主要是葡萄糖和果糖，蔗糖含量較低[1-2]?？扇苄蕴呛亢蜆?gòu)成是決定火龍果果實品質(zhì)和商品價值的關(guān)鍵因子。研究火龍果果實的可溶性糖積累，對調(diào)控和改良果實品質(zhì)，提高果品價值具有重要意義。當前對火龍果果實可溶性糖積累的分子機制尚無研究，參與可溶性糖積累的功能基因未見分離。

液泡是植物細胞中可溶性糖的主要貯藏場所，液泡膜上的糖轉(zhuǎn)運蛋白參與可溶性糖的跨膜輸入或輸出，從而影響液泡乃至整個細胞可溶性糖的積累[3-4]。植物TST基因家族是近年逐步證明其糖轉(zhuǎn)運特性和參與可溶性糖積累的糖轉(zhuǎn)運蛋白。TST蛋白定位于液泡膜，通過偶聯(lián)質(zhì)子的方式反向轉(zhuǎn)運蔗糖、葡萄糖或果糖，因而是一個負責糖輸入的糖轉(zhuǎn)運蛋白[5-7]。目前在蘋果、葡萄、甜橙、梨和森林草莓基因組序列中克隆獲得TST基因家族，其表達模式與果實可溶性糖積累密切相關(guān)[8-12]。西瓜、甜瓜和梨相關(guān)TST基因在草莓或番茄果實中過表達，均證明其促進果實可溶性糖積累，是控制果實可溶性糖含量的重要正調(diào)控基因[13-15]。

目前尚無火龍果基因組序列發(fā)布，前期針對火龍果果實和莖進行多次轉(zhuǎn)錄組測序，獲得的序列數(shù)據(jù)可用于目的基因分離[16]。研究對火龍果果實和莖轉(zhuǎn)錄組測序獲得的Unigene進行分析，分離TST基因家族并進行生物信息學分析，為研究火龍果TST基因的生理功能，探討果實可溶性糖積累的分子機制，調(diào)控和改良果實品質(zhì)奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

研究從以下數(shù)據(jù)中篩選目的基因：2015年11月采集火龍果成熟果實和成熟莖樣品轉(zhuǎn)錄組測序，獲得Unigene數(shù)據(jù)量為55.0 Mb，Unigene數(shù)量79 658個[16]。2017年9-10月采集5個時期火龍果果實共15份樣品轉(zhuǎn)錄組測序，獲得Unigene數(shù)據(jù)量為84.7 Mb，Unigene數(shù)量為63 958條。2018年9月采集火龍果成熟果實和成熟莖共6份樣品轉(zhuǎn)錄組測序，獲得Unigene數(shù)據(jù)量為58.8 Mb，Unigene數(shù)量為6 6253條。

1.2 火龍果 TST基因分離

從上述轉(zhuǎn)錄組測序獲得的序列注釋結(jié)果中檢索tonoplast sugar transporters、tonoplast monosaccharide transporters或monosaccharide-sensing protein相關(guān)的Unigene序列，使用BioEdit程序進行序列拼接，獲得的一致性Contig序列用Blastx程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)再次檢索。

1.3 序列分析

開放讀碼框(Open reading frame，ORF)預測使用ORF Finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)，相對分子量和理論等電點預測使用在線Protparam程序(https://web.expasy.org/compute_pi/)；HMMTOP程序(http://www.enzim.hu/hmmtop/index.php)；亞細胞定位預測使用WoLF PSORT程序(網(wǎng)站中的Conserved Domain Database(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫下載擬南芥AtTMT1-3家族(At1g20840、At4g35300和At3g51490)、葡萄VvTMT1-3家族(HQ323282、HQ323283和HQ323284)、西瓜ClTST1-3家族(KY367354、KY367352和KY367355)、甜瓜CmTST1-3(XP_008464819.1、XP_008448165.1和XP_016899284.1)和甜菜TST家族(BvTST1：XP_010686712.1、BvTST2.1：XP_010678631.1、BvTST2.2：XP_010690557.1、BvTST3：XP_010680636.1)等序列。從薔薇科果樹基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.rosaceae.org/)下載蘋果TST家族序列(MdTMT1-3：MDP0000381084、MDP0000212510和MDP000086

8028)，使用Clustal W程序進行氨基酸序列比對，比對結(jié)果利用MEGA7.0，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值進行1 000次重復檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 TST基因家族分離

根據(jù)此前對火龍果果實和莖組織3次轉(zhuǎn)錄組測序獲得的Unigene注釋結(jié)果，結(jié)合序列比較、拼接和注釋，共獲得4條火龍果TST相關(guān)序列(表1)。根據(jù)NCBI網(wǎng)站中序列同源性比對結(jié)果，命名為HpTST1、HpTST2.1、HpTST2.2和HpTST3，分別含有長度為2 127 bp、2 235 bp、2 220 bp和2 193 bp的ORF，編碼長度分別為708 aa、744 aa、739 aa和730 aa的氨基酸序列。其預測等電點為4.84～5.36，相對分子量為75.7～80.4 kDa。

表1 紅肉火龍果 TST基因家族成員信息

2.2 序列同源性

紅肉火龍果TST基因家族序列進行兩兩比較結(jié)果表明，HpTST2.1和HpTST2.2間的核苷酸和氨基酸序列相似性較高，分別為80.6%和80.5%；其余兩兩間核苷酸和氨基酸序列相似性分別為67.3%～68.8%和64.7～67.8%。從表2可知，HpTST1與甜菜TST1、菠菜TST2氨基酸序列相似性分別為78.0%和74.9%；HpTST2.1與甜菜TST2.2、TST2.1氨基酸序列相似性分別為79.5%和76.9%；HpTST2.2與甜菜TST2.2、TST2.1氨基酸序列相似性分別為80.0%和76.0%；HpTST3與甜菜TST3、藜麥TST2氨基酸序列相似性分別為83.4%和82.0%。

表2 紅肉火龍果 TST基因氨基酸與其他相關(guān)基因的序列相似性

TST氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)預測表明，紅肉火龍果TST基因的氨基酸序列N端均含有MFS超家族(Major Facilitator Superfamily，主要易化子超家族)結(jié)構(gòu)域(編號：cl28910)，在C端含有MFS家族GLUT(Glucose transporters，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白)結(jié)構(gòu)域(編號：cd17315)。因此，紅肉火龍果TST家族屬于MFS超家族，具有潛在的葡萄糖轉(zhuǎn)運活性。

2.3 跨膜結(jié)構(gòu)及亞細胞定位預測

從表3看出，HpTST1、HpTST2.1和HpTST3均含有11個跨膜域，N端位于細胞外。HpTST2.2含有12個跨膜域，N端位于細胞內(nèi)。亞細胞定位預測表明，HpTST1定位于質(zhì)體、葉綠體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，HpTST2.1和HpTST2.2定位于質(zhì)體或液泡，HpTST3定位于葉綠體、質(zhì)體或液泡。

表3 紅肉火龍果 TST基因的跨膜結(jié)構(gòu)域和預測定位

2.4 TST基因分類

根據(jù)紅肉火龍果TST基因的氨基酸序列以及擬南芥、西瓜、甜瓜、甜菜、葡萄和蘋果等TST基因家族共同構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，TST基因明顯分為3類，其中，HpTST1與擬南芥AtTMT1、葡萄VvTMT1、蘋果MdTMT1、甜菜BvTST1、西瓜ClTST1和甜瓜CmTST1均屬于TST1類；HpTST2.1和HpTST2.2與擬南芥AtTMT2、葡萄VvTMT2、蘋果MdTMT2-3、甜菜BvTST2.1和BvTST2.2、西瓜ClTST2和甜瓜CmTST2屬于TST2類；HpTST3與擬南芥AtTMT3、葡萄VvTMT3甜菜BvTST3、西瓜ClTST3和甜瓜CmTST3均屬于TST3類。

3 結(jié)論與討論

近年來大量植物基因組序列的發(fā)布，為全基因組范圍基因家族的分離奠定了有利基礎。通過對基因組序列的檢索，植物TST家族普遍含有2～5個成員。如甜橙含2個成員[10]，擬南芥、葡萄、西瓜和甜瓜均含3個成員[5,9,14-15]，甜菜含有4個成員[7]，蘋果含5個成員[8]。目前尚無火龍果基因組序列的發(fā)布，僅能通過其莖和果實等組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分離其TST基因家族。本研究分離的火龍果TST基因家族含有4個成員，與上述物種中TST成員數(shù)量基本一致?；瘕埞c甜菜同屬于石竹目(Caryophyllales)，親緣關(guān)系較近，其TST基因家族數(shù)量相同[7]。這些不同物種的TST基因家族成員可分為三類，TST1類均含有1個成員，TST2和TST3類發(fā)生不同程度的基因數(shù)量增加。如蘋果TST2和TST3類均有2個成員[8]，火龍果與甜菜TST2類均含有2個成員[7]，梨TST2和TST3類分別有3個和2個成員[11]。因蘋果、梨、火龍果和甜菜均積累豐富的可溶性糖，由此推測基因數(shù)量的增加可能與其可溶性糖大量積累的性狀保持一致。

TST最初被命名為液泡單糖轉(zhuǎn)運蛋白(Tonoplast monosaccharide transporter，TMT)，因其具有跨液泡膜輸入單糖的特性，參與液泡可溶性糖積累[5]。隨后的研究證明擬南芥AtTMT1同時具有蔗糖轉(zhuǎn)運活性，甜菜BvTST2.1具有特異轉(zhuǎn)運蔗糖的活性，因而被統(tǒng)一命名為TST[6-7]。擬南芥AtTMT1基因突變后降低其葉肉細胞液泡葡萄糖吸收活性，進而導致葉片積累的可溶性糖含量降低[5]。過表達AtTMT1基因提高葉片可溶性糖含量，種子產(chǎn)量、蛋白質(zhì)和脂類含量均明顯增加[17]。在園藝作物果實中，蘋果MdTST1基因隨果實成熟顯著上調(diào)表達，與果實可溶性糖積累模式的相關(guān)系數(shù)高達0.837[8]。桃PpTST1基因的表達與果實可溶性糖積累模式保持一致，在果實中瞬時沉默其表達，降低果實可溶性糖含量[18]。由此可見，TST1類參與葉片和果實可溶性糖的跨液泡膜輸入，促進組織的可溶性糖積累?；瘕埞鸋pTST1與擬南芥AtTMT1同屬于TST1類，推測其參與果實的可溶性糖積累。

目前在積累大量可溶性的貯藏根和果實中均已證明TST2類與可溶性糖積累密切相關(guān)，是控制可溶性糖含量的重要正調(diào)控因子。甜菜BvTST2.1蛋白在根部液泡膜上大量表達，具有特異性跨膜轉(zhuǎn)運蔗糖的活性，高蔗糖品種中的基因表達顯著高于低蔗糖品種[7]。西瓜ClTST2和梨PbTMT4均具有蔗糖、葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)運活性、基因表達量與可溶性糖含量正相關(guān)[14]；甜瓜CmTST2基因在高蔗糖品種中的表達明顯高于低蔗糖品種，該基因過表達增加草莓和黃瓜果實可溶性糖含量[15]。研究獲得的火龍果TST2類含有2個成員，與甜菜TST家族的序列同源性較高，推測具有蔗糖、葡萄糖和果糖等轉(zhuǎn)運活性，參與果實可溶性糖積累。

研究獲得火龍果TST基因家族4個成員，均具有典型的TST家族特征，含有1個TST1類成員和2個TST2類成員。結(jié)合目前在其他物種中相關(guān)研究結(jié)果，推測HpTST1、HpTST2.1和HpTST2.2是參與果實可溶性糖積累的重要候選基因。下一步需要分析上述基因的表達模式、亞細胞定位和糖轉(zhuǎn)運活性，從而闡明其在火龍果果實可溶性糖積累中的生理功能，為探討果實可溶性糖積累的分子機制和調(diào)控果實品質(zhì)奠定基礎。