青海亞麻籽總酚含量測(cè)定及其抗氧化活性研究

王興瑞，陳昀昀，韓玉澤，李應(yīng)霞，王進(jìn)英,2

(1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016； 2.青海大學(xué) 三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810016)

亞麻(LinumusitatissimumL.)是亞麻科、亞麻屬的一年生草本植物，可分為纖維用亞麻、油用亞麻和油纖兼用亞麻3種類型。亞麻是世界十大油料作物之一，居世界油料總產(chǎn)量第7位[1]。亞麻是我國的重要經(jīng)濟(jì)作物，主要分布在西北和華北北部的干旱、半干旱高寒冷涼地區(qū)[2-3]。其中，青海亞麻種植歷史悠久，青海特有的高原地理和氣候特征使得青海亞麻成為了一種具有栽培價(jià)值的油料作物，在青海亞麻俗稱胡麻[4]。

亞麻籽含脂肪30%～41%、纖維素20%～35%、蛋白質(zhì)20%～30%、水分4%～8%、灰分3%～4%和單糖1%[5]。除此之外，亞麻籽中還含有一定的微量組分，包括生氰糖苷、植酸、酚類物質(zhì)、胰蛋白酶抑制劑、谷酰胺脯氨酸、木脂素、礦物質(zhì)、維生素等[6]。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，酚類化合物具有抗氧化、抗癌、抗炎等功效，能有效預(yù)防高血脂、高血糖、心腦血管疾病、腫瘤等慢性疾病。

亞麻籽中酚類物質(zhì)的含量水平與基因或品種、收獲時(shí)間、產(chǎn)地與環(huán)境有關(guān)[9]。目前國內(nèi)對(duì)亞麻籽酚類物質(zhì)組成及抗氧化活性研究主要集中在新疆、內(nèi)蒙、山西及甘肅等主產(chǎn)區(qū)，而對(duì)青海亞麻籽的相關(guān)研究較少。因此，本文以山西、內(nèi)蒙、甘肅產(chǎn)地的亞麻籽為對(duì)照，選擇了青海貴德、互助、三合、民和4個(gè)不同地區(qū)的亞麻籽，利用超聲輔助提取法提取總酚，福林酚法測(cè)定總酚含量，DPPH法測(cè)定其清除自由基的能力，以期為青海亞麻籽多酚的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

4個(gè)青海貴德、互助、民和、三合產(chǎn)地的亞麻籽樣品， 3個(gè)甘肅、山西、內(nèi)蒙古產(chǎn)地的亞麻籽樣品。

無水碳酸鈉、沒食子酸、福林酚試劑、95%乙醇、正丁烷、正己烷、氫氧化鈉，鹽酸、正丁醇、1, 1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)等，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

HHS-4S粉碎機(jī)；電子恒溫不銹鋼水浴鍋；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；UV-1780紫外可見分光光度計(jì)，島津儀器(蘇州)有限公司；FA1004電子天平；DHG 9070A熱風(fēng)鼓風(fēng)干燥箱；KQ-300E型臺(tái)式機(jī)械超聲波清洗器；PHSJ-4A pH計(jì)；DRG9070A熱鼓風(fēng)干燥箱；TGL20MW冷凍離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總酚提取

將亞麻籽清洗，烘干12 h，粉碎，與正己烷按 1∶6 混合脫脂12 h，倒入離心管中，在3 000 r/min離心20 min，倒出上清液，沉淀在40℃下熱風(fēng)干燥，得到脫脂亞麻籽粉樣品。準(zhǔn)確稱取脫脂亞麻籽粉樣品3 g放入燒杯中，加入60%乙醇溶液，封口，在一定超聲溫度下超聲一段時(shí)間，抽濾，收集提取液。取30 mL提取液放入燒杯中，加入10 mL 1 mol/L的NaOH溶液，將提取液中NaOH濃度調(diào)至0.25 mol/L，反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后加入1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.0。用0.45 μm醋酸纖維素膜過濾，濾液減壓濃縮，加入30 mL 60%乙醇復(fù)溶，移至容量瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總酚含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.020 0 g，用蒸餾水溶解并定容至100 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確移取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL于玻璃管中，各加1 mL 1 mol/L福林酚試劑，渦旋混合1 min使其反應(yīng)，再加入3 mL 10%Na2CO3溶液振搖，加蒸餾水至10 mL，于45℃水浴中反應(yīng)1.5 h，以不加標(biāo)準(zhǔn)液的溶液為空白對(duì)照，在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，建立沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=6.575x+0.018 3，R2=0.998。

樣品中總酚含量測(cè)定：取0.3 mL 1.2.1提取的總酚復(fù)溶溶液于10 mL玻璃管中，然后加入1 mL 1 mol/L福林酚試劑，渦旋混合1 min使其反應(yīng)，再加入3 mL 10%Na2CO3溶液振搖，加蒸餾水至10 mL，于45℃水浴中反應(yīng)1.5 h，以不加標(biāo)準(zhǔn)液的溶液為空白對(duì)照，在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的總酚含量。

1.2.3 亞麻籽總酚DPPH·清除能力測(cè)定

取1 mg DPPH溶于24 mL 95%乙醇中，充分振搖均勻，避光保存?zhèn)溆?。?0 mL玻璃管中加入3.0 mL DPPH溶液和1.0 mL 95%乙醇溶液，混勻，反應(yīng)穩(wěn)定后，以95%乙醇為參比，在517 nm處測(cè)吸光值(A0)；同法依次加入3.0 mL 95%乙醇溶液和1.0 mL樣品溶液，測(cè)定吸光值(A2)；依次加入3.0 mL DPPH溶液和1.0 mL樣品溶液，測(cè)定吸光值(A1)。DPPH·清除率按下式計(jì)算。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值，采用Microsoft Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 亞麻籽總酚提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1.1 固液比對(duì)提取效果的影響

在超聲時(shí)間20 min、超聲溫度40℃條件下，研究不同固液比對(duì)亞麻籽總酚提取的影響，結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，隨固液比增大，總酚含量增大，在固液比1∶15時(shí)總酚含量最高，此后隨固液比繼續(xù)增大總酚含量下降。此趨勢(shì)與孫偉潔[10]的研究結(jié)果一致。主要原因可能是乙醇用量較小時(shí)，不能將亞麻籽粉中的總酚提取出來。當(dāng)乙醇用量過多時(shí)，導(dǎo)致超聲對(duì)亞麻籽粉的作用減弱，使提取過程受到影響[10]。因此，固液比1∶15最佳。

圖1 固液比對(duì)總酚提取效果的影響

2.1.1.2 超聲溫度對(duì)提取效果的影響

在固液比1∶15、超聲時(shí)間20 min條件下，研究不同超聲溫度對(duì)亞麻籽總酚提取的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲溫度對(duì)總酚提取效果的影響

從圖2可以看出，隨超聲溫度升高，總酚含量增大，在超聲溫度40℃時(shí)總酚含量最高，之后隨超聲溫度繼續(xù)上升總酚含量下降。這可能是隨著溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加速使酚類物質(zhì)容易穿透植物組織，但溫度太高會(huì)使酚類與其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[11]。此外，當(dāng)溫度過高時(shí)溶出的亞麻膠會(huì)粘在細(xì)胞壁上，從而影響多酚提取效果。因此，超聲溫度40℃最佳。

2.1.1.3 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響

在固液比1∶15、超聲溫度40℃條件下，研究不同超聲時(shí)間對(duì)亞麻籽總酚含量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)總酚提取效果的影響

從圖3可以看出，隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)，總酚含量增大，在超聲時(shí)間15 min時(shí)總酚含量最高，之后隨著超聲時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)總酚含量降低，這與劉濱等[12]對(duì)巴山冷杉針葉多酚提取的結(jié)果相同。可能原因是超聲時(shí)間較短時(shí)對(duì)亞麻籽的作用較小，不能使亞麻籽中的總酚全部提取出來，超聲時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使活性物質(zhì)流出，溶液黏度增加，從而影響亞麻籽總酚的提取。因此，超聲時(shí)間15 min最佳。

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.1.2.1 模型建立和方差分析

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以固液比、超聲溫度、超聲時(shí)間為因素，以總酚含量為指標(biāo)，采用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。方差分析見表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表1數(shù)據(jù)得到模型回歸方程：總酚含量=30.07+2.64A+0.6B+0.12C-1.39AB+0.46AC+0.68BC-2.83A2-2.96B2-2.48C2。

表2 方差分析

2.1.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過Design-Expert 7.0軟件得到亞麻籽總酚最佳提取工藝條件為固液比1∶17.3、超聲溫度40.1℃、超聲時(shí)間15.3 min，此條件下總酚含量為30.69 mg/g。根據(jù)實(shí)際情況將實(shí)驗(yàn)條件修正為超聲溫度 40℃、超聲時(shí)間 15 min、固液比1∶17，實(shí)際總酚含量為30.21 mg/g。

2.2 不同產(chǎn)地亞麻籽中總酚含量及抗氧化活性(見圖4、圖5)

圖4 不同產(chǎn)地亞麻籽中總酚含量

圖5 不同產(chǎn)地亞麻籽總酚抗氧化活性

從圖4可以看出，青海貴德、互助、民和、三合亞麻籽總酚含量依次為28.70、24.51、23.16、25.11 mg/g，平均含量為25.37 mg/g，青海貴德的亞麻籽總酚含量明顯高于青海其他3個(gè)地區(qū)亞麻籽的，而民和的亞麻籽總酚含量最低。甘肅、內(nèi)蒙古、山西產(chǎn)地亞麻籽總酚含量依次為19.97、21.43、22.38 mg/g。

從圖5可以看出，青海、甘肅、內(nèi)蒙、山西4個(gè)產(chǎn)地亞麻籽樣品都具有較強(qiáng)的抗氧化能力，但不同產(chǎn)地樣品間存在差異性。其中產(chǎn)自青海的亞麻籽總酚抗氧化能力較強(qiáng)，DPPH·清除率平均為47.44%；其次為山西、內(nèi)蒙古，DPPH·清除率分別為 42.43%、42.18%。產(chǎn)自甘肅的亞麻籽總酚抗氧化能力最弱，DPPH·清除率為41.48%。結(jié)果表明，青海亞麻籽總酚在含量水平和抗氧化能力方面占一定優(yōu)勢(shì)。

青海本地不同地區(qū)亞麻籽總酚DPPH·清除率大小依次為貴德 (51.06%)>三合 (49.13%)>互助 (46.94%)>民和(42.62%)。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地及同一產(chǎn)地不同地區(qū)間亞麻籽中總酚含量及抗氧化能力存在差異，這與臧茜茜等[13]的研究結(jié)果一致。研究表明，油料的總酚含量及抗氧化活性會(huì)受品種、生長(zhǎng)環(huán)境、氣候條件、貯藏時(shí)間等因素的影響，導(dǎo)致總酚含量及抗氧化活性存在不同程度的差異。且不同品種的同一物種間，營(yíng)養(yǎng)成分含量也不同[14-16]。

3 結(jié) 論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到亞麻籽總酚提取的最佳工藝條件為固液比1∶17、超聲溫度40℃、超聲時(shí)間15 min，在此條件下總酚含量達(dá)到30.21 mg/g。

總酚含量及DPPH·清除能力實(shí)驗(yàn)表明，青海亞麻籽中總酚含量和抗氧化能力高于其他產(chǎn)地，且青海本地不同地區(qū)亞麻籽間總酚含量及抗氧化能力存在差異。青海貴德、三合、互助、民和的亞麻籽總酚含量依次為28.70、25.11、24.51、23.16 mg/g，DPPH·清除率依次為51.06%、49.13%、46.94%、42.62%。山西、內(nèi)蒙古、甘肅產(chǎn)亞麻籽中總酚含量依次為22.38、21.43、19.97 mg/g，DPPH·清除率依次為42.43%、42.18%、41.48%?？傮w來說，青海亞麻籽的總酚含量及抗氧化能力高于其他產(chǎn)地，具有較好的應(yīng)用前景。