酶法合成1-油酸-2-棕櫚酸-3-亞油酸甘油三酯結(jié)構(gòu)脂的研究

高 亮，余旭偉，鄒 鳳，程昕祎，楊壯壯，王小三，金青哲，王興國

(1.江南大學 食品學院，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122;2.江南大學 數(shù)字媒體學院，江蘇 無錫 214122; 3.無錫市食品安全檢驗檢測中心，江蘇 無錫 214122)

母乳被認為是嬰兒最理想的食品，含有3%～5%的脂肪，這部分脂肪也常稱為人乳脂，主要由甘油三酯(98%)、磷脂(0.8%)和膽固醇(0.5%)等成分構(gòu)成，能為嬰幼兒提供約50%的能量、必需脂肪酸和生理活性物質(zhì)供其生長[1]。人乳脂的組成和結(jié)構(gòu)比較特殊，從人乳脂脂肪酸組成來看，主要包括油酸、棕櫚酸和亞油酸，分別占人乳脂的25%～35%、20%～30%、10%～20%[2]。對于人乳脂脂肪酸的空間結(jié)構(gòu)，其中70%以上的棕櫚酸在sn-2位上，而不飽和脂肪酸，如油酸和亞油酸位于sn-1，3位[3]。因此，甘油三酯在人乳脂中的存在形式主要是USU型，如1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(OPO)和1-油酸-2-棕櫚酸-3-亞油酸甘油三酯(OPL)[4]。這種獨特的結(jié)構(gòu)可促進嬰兒對脂肪和鈣吸收，并對脂代謝有著顯著的影響。研究表明，甘油三酯在人體中，在胰脂酶的特異性催化作用下，被水解為游離的不飽和脂肪酸和2-飽和脂肪酸單甘酯，被小腸吸收。當水解下來的1、3位脂肪酸主要為棕櫚酸等飽和脂肪酸時，由于其熔點較高，會在腸道內(nèi)形成不溶性的鈣皂等，不利于嬰幼兒生長發(fā)育[5]。孫聰[6]調(diào)查分析了中國無錫地區(qū)309例人乳樣品發(fā)現(xiàn)，人乳脂中OPL的含量(17.85%～33.02%)高于OPO的含量(6.81%～24.86%)，這與歐洲的一些報道相反[7-8]，但與中國其他地區(qū)報道類似[9-10]，這可能與中國乳母多食用較高亞油酸植物油如大豆油等飲食有關。因此，OPL是中國人乳中含量最高的甘油三酯。

目前國內(nèi)外大多關注富含OPO結(jié)構(gòu)脂的報道，多采用棕櫚硬脂和豬油等與油酸或者富含油酸的植物油脂在特異性酶的催化作用下合成OPO[11-12]。而孫聰[6]調(diào)查分析了13種添加OPO的嬰兒配方奶粉，發(fā)現(xiàn)雖然OPO的含量與人乳脂接近，但棕櫚酸在sn-2位的含量卻仍低于人乳脂。因此，在中國市場的嬰兒配方奶粉中，除了要添加OPO結(jié)構(gòu)脂，還需添加sn-2位富含棕櫚酸的甘油三酯如OPL。

目前，有關于富含OPL結(jié)構(gòu)脂的研究報道很少，嬰兒配方奶粉中也沒有關注到OPL的添加。在動物油脂中，牛乳和羊乳中含有少量的OPL(0.35%)，而豬油雖然含有一定量的OPL，但受到宗教信仰的限制未得到廣泛應用。在植物油中，棕櫚酸主要位于sn-1，3位，因此OPL主要以sn-POL或sn-PLO等同分異構(gòu)體形式存在。因此，通過酶法合成中國人乳脂中含量最高的OPL結(jié)構(gòu)脂對于生產(chǎn)和調(diào)配與人乳脂高度相似的人乳替代脂具有重要意義。

本研究的目的是通過酶法合成富含OPL的結(jié)構(gòu)脂，為此，本文以分提后的棕櫚硬脂為原料，在Lipozyme RM IM的催化作用下，與油酸和亞油酸發(fā)生酸解反應合成富含OPL的結(jié)構(gòu)脂。探究了底物摩爾比、酶添加量、反應溫度、反應時間對酸解反應的影響，在最優(yōu)條件下對該反應進行50倍放大實驗，并通過高效液相色譜和氣相色譜對產(chǎn)物進行檢測分析，得到高含量的OPL結(jié)構(gòu)脂。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

棕櫚硬脂(58℃)，益海嘉里有限公司；油酸(85%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；豬胰脂酶、脂肪酸甲酯標品，Sigma-Aldrich(中國上海)公司；乙腈(>99%)、異丙醇(>99%)、正己烷(>95%)，百靈威科技有限公司；薄層色譜硅膠板(20 cm×20 cm，乳山市太陽干燥劑有限公司；Lipozyme RM IM脂肪酶，諾維信生物技術有限公司。

亞油酸(60%～74%)、乙醚、正己烷，冰醋酸、無水硫酸鈉、氫氧化鉀、乙醇、氯化鈣、脫氧膽酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、2，7-二氯熒光素、丙酮等，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

反應釜、反應器；HH-601超級恒溫水浴；漩渦振蕩器；磁力攪拌器，IKA集團；電子天平；三用紫外分析儀；低溫恒溫槽；Agilent 1260高效液相色譜、Agilent 7820A氣相色譜，美國安捷倫科技有限公司；蒸發(fā)光散射檢測器，美國Grace公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 棕櫚硬脂的分提

將25 g棕櫚硬脂置于盛有125 mL丙酮的反應器中，調(diào)節(jié)溫度至60℃，將反應器中反應物溶解，然后以10℃/h的降溫速度程序降溫至38℃，并保持3 h，快速真空抽濾除去丙酮，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到高含量的三棕櫚酸甘油酯(PPP)。

1.2.2 酶法合成OPL結(jié)構(gòu)脂

將PPP與?；w(油酸和亞油酸)混合于25 mL反應釜中，當反應底物溶解并穩(wěn)定時，加入一定量Lipozyme RM IM脂肪酶，在一定溫度下反應，每隔2 h取樣。反應結(jié)束后，在4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心3 min，回收Lipozyme RM IM脂肪酶，并去除游離脂肪酸，得到富含OPL的結(jié)構(gòu)脂。

對于游離脂肪酸的去除，工業(yè)上常采用堿煉脫酸的方法，我們做了一些改進[13]：向回收脂肪酶后的反應產(chǎn)物中按10 mL/g加入正己烷將產(chǎn)物溶解，再用0.5 mol/L的KOH-乙醇溶液(30%)中和產(chǎn)物中的游離脂肪酸，堿的用量為理論游離脂肪酸摩爾數(shù)的1.5倍，將混合物搖勻并靜置5 min，體系分為兩相，吸取含有甘油三酯的正己烷相，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去正己烷，得到純化的結(jié)構(gòu)脂。

1.2.3 甘油三酯組成分析

采用配有蒸發(fā)光散射檢測器的高效液相色譜檢測分析分提后的棕櫚硬脂和OPL結(jié)構(gòu)脂中甘油三酯的組成。分析條件：C18非極性色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，蒸發(fā)光散射檢測器溫度55℃，空氣流速1.8 mL/min，增益值1，流動相洗脫程序見表1，流速0.8 mL/min，進樣質(zhì)量濃度20 mg/mL，進樣量10 μL。

表1 分析甘油三酯的洗脫程序

1.2.4 總脂肪酸組成分析

樣品甲酯化：甘油三酯(20 mg)溶于1.2 mL的溶劑(95%正己烷)中，加入0.5 mL KOH-甲醇溶液(2 mol/L)充分反應，吸取上層，并用無水硫酸鈉吸收水分，膜過濾后，用氣相色譜儀進行檢測分析。

分析條件：采用配有氫火焰離子化檢測器的氣相色譜；Trace TR-FAME毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；檢測器溫度250℃；氮氣流速1.0 mL/min；分流比20∶1；程序升溫為初始溫度60℃保持3 min，然后以5℃/min的速率升溫至180℃，并保持15 min，最后以2℃/min的速率升溫至220℃，

保持10 min。

1.2.5 脂肪酸區(qū)域特異性分析

甘油三酯(50 mg)溶于1.2 mL的溶劑(95%正己烷)中，依次加入7 mL Tris-HCl緩沖液(pH 7.6)、1.75 mL膽酸鹽溶液(0.05%)、0.7 mL氯化鈣溶液(2.2%)，充分振蕩，加入50 mg豬胰脂酶，在37.5℃下反應5 min，冷卻后加入2 mL無水乙醚，離心后吸取有機層，濃縮后在薄層色譜上點樣，展開劑為正己烷-無水乙醚-冰醋酸(體積比50∶50∶1)，用2，7-二氯熒光素顯色，刮下單甘酯(2-MAG)，用無水乙醚萃取后，氮吹干無水乙醚，將樣品按1.2.4方法進行甲酯化和氣相色譜分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)重復兩次取平均值，并以“平均值±標準差”表示，采用Origin 2018制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 分提棕櫚硬脂的脂肪酸及甘油三酯組成

棕櫚硬脂的分提采用溶劑結(jié)晶法，即根據(jù)不同的甘油三酯在丙酮中溶解度的不同，利用低溫結(jié)晶法將其達到分離的目的。棕櫚硬脂分提前后總脂肪酸和sn-2位脂肪酸組成及含量見表2，甘油三酯組成見表3。

表2 棕櫚硬脂分提前后總脂肪酸和sn-2位脂肪酸組成及含量 %

表3 棕櫚硬脂分提前后甘油三酯組成 %

由表2可見，棕櫚硬脂通過溶劑分提后，脂肪酸含量明顯發(fā)生了變化，其中棕櫚酸含量從79.95%提高到92.03%，sn-2位棕櫚酸含量從69.25%提高到90.67%，油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸含量均大幅度降低。由表3可見，棕櫚硬脂分提后，OOP、POP、POS等熔點較低的甘油三酯含量大幅降低，然而熔點高的甘油三酯，尤其是PPP從83.70%增加到93.44%。分提后的棕櫚硬脂含有高含量的PPP和sn-2位棕櫚酸，是合成OPL結(jié)構(gòu)脂的良好底物。

2.2 酶法合成OPL單因素實驗

2.2.1 底物摩爾比對反應的影響

由于OPL甘油骨架上含有3個不同的脂肪酸，在考慮底物摩爾比對反應的影響時，主要分為PPP與總脂肪酸(油酸和亞油酸)的摩爾比以及油酸與亞油酸的摩爾比。首先，探究了PPP與總脂肪酸摩爾比為1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16時對反應的影響，其他反應條件為反應溫度60℃、Lipozyme RM IM脂肪酶添加量10%、油酸與亞油酸摩爾比1∶1.2，結(jié)果見圖1。

由圖1可見，隨著反應時間的延長，OPL的含量逐漸升高，至6 h時反應趨于平衡。同時，隨著脂肪酸供體(油酸和亞油酸)比例的提高，OPL的含量也逐漸提高，當PPP與總脂肪酸摩爾比為1∶14時，OPL含量明顯高于其他4組。這是因為在脂肪酸比例較低時，隨著脂肪酸供體比例的增加，OPL含量也隨之提高，但該反應是可逆反應，反應趨近平衡后再增加反應物中的脂肪酸供體，會導致OPL含量下降。因此，選擇PPP與總脂肪酸摩爾比為1∶14進行后續(xù)反應條件研究。

圖1 PPP與總脂肪酸摩爾比對反應的影響

在確定了PPP與總脂肪酸的摩爾比為1∶14后，在其他條件不變的情況下，繼續(xù)探究油酸與亞油酸摩爾比為1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6時對反應的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 油酸與亞油酸摩爾比對反應的影響

由圖2可見，隨著反應時間的延長，OPL的含量先迅速增加再緩慢增加，在反應時間為6 h、油酸與亞油酸摩爾比為1∶1時，OPL的含量最高(47.74%)。這是因為隨著亞油酸比例的不斷增加，LPL等甘油三酯副產(chǎn)物影響OPL的含量，而油酸比例的不斷增加，OPO等甘油三酯也是導致OPL含量降低的因素，因此選擇油酸與亞油酸摩爾比為1∶1作為反應底物。

綜上所述，確定PPP、油酸、亞油酸最佳摩爾比為1∶7∶7。

2.2.2 脂肪酶添加量對反應的影響

在PPP、油酸、亞油酸摩爾比1∶7∶7，反應溫度60℃下，探究了脂肪酶添加量為6%、8%、10%、12%、14%時對反應的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可見，反應時間為6 h時，Lipozyme RM IM脂肪酶添加量為8%～12%，OPL的含量相差不大，均高于脂肪酶添加量為6%和14%時的，且在脂肪酶添加量為6%時，整個反應過程中OPL含量均低于其他組。為了提高產(chǎn)物中OPL的含量，同時考慮脂肪酶價格昂貴的問題，選擇Lipozyme RM IM脂肪酶添加量為8%。

圖3 脂肪酶添加量對反應的影響

2.2.3 反應溫度對反應的影響

在PPP、油酸、亞油酸摩爾比1∶7∶7，脂肪酶添加量8%條件下，探究反應溫度為50、55、60、65、70℃時對反應的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 反應溫度對反應的影響

由圖4可見，在反應時間超過6 h后，反應溫度為60℃時，OPL的含量均高于其他溫度，這也說明Lipozyme RM IM脂肪酶的最適反應溫度約為60℃。因此，選擇60℃作為合成OPL的反應溫度。

通過探究不同反應條件對酶法合成OPL的影響，最終確定最適反應條件：PPP、油酸、亞油酸的摩爾比1∶7∶7，Lipozyme RM IM脂肪酶添加量8%，反應溫度60℃，反應時間6 h。

2.3 小試放大實驗

在酶法合成OPL最適反應條件下，進行50倍放大的小試實驗，分析產(chǎn)物的總脂肪酸組成、sn-2位脂肪酸組成和甘油三酯組成，結(jié)果分別見表4、表5。

表5 酸解產(chǎn)物和小試實驗產(chǎn)物的甘油三酯組成及含量 %

由表4可知，酸解產(chǎn)物與小試實驗產(chǎn)物脂肪酸組成無明顯差異，小試實驗產(chǎn)物中主要是棕櫚酸、油酸和亞油酸，含量分別為38.59%、32.45%和25.68%，同時sn-2位棕櫚酸的含量為84.70%，明顯高于人乳脂中棕櫚酸的含量，因此添加OPL結(jié)構(gòu)脂，可有效提高嬰幼兒配方奶粉中sn-2位棕櫚酸的含量。

表4 酸解產(chǎn)物和小試實驗產(chǎn)物的總脂肪酸和sn-2脂肪酸組成 %

由表5可知，酸解產(chǎn)物和小試實驗產(chǎn)物在甘油三酯組成方面也無顯著性差異，小試實驗產(chǎn)物中，OPL的含量為48.37%，明顯高于人乳脂中OPL的含量，產(chǎn)物中OPO、PPO、PPL等甘油三酯也是人乳脂中主要的甘油三酯，這對于調(diào)配模擬人乳脂甘油三酯組成的人乳替代脂具有重要意義。

3 結(jié) 論

以分提后的棕櫚硬脂與油酸、亞油酸為反應底物，在Lipozyme RM IM脂肪酶的催化作用下，發(fā)生酸解反應合成OPL結(jié)構(gòu)脂。通過單因素實驗確定合成OPL最優(yōu)條件為：PPP、油酸、亞油酸摩爾比1∶7∶7，Lipozyme RM IM脂肪酶添加量8%，反應溫度60℃，反應時間6 h。在最優(yōu)條件下，所得的OPL結(jié)構(gòu)脂中棕櫚酸、油酸和亞油酸的含量分別為38.59%、32.45%、25.68%，sn-2位棕櫚酸的含量為84.70%，同時OPL含量為48.37%，這為制備與人乳脂高度相似的人乳替代脂奠定了基礎。