“培土生金法”對早期支氣管哮喘幼鼠氣道炎癥影響分析

劉克偉 陳英妹 甄如義

廣州市花都區(qū)婦幼保健院 （胡忠醫(yī)院）兒科，廣東廣州 510800

支氣管哮喘是一種常見的兒童疾病，近年來可能由于城市化水平的推動，空氣污染水平上升，導(dǎo)致該疾病發(fā)病率有一定上升趨勢[1]。該疾病的鑒別診斷有一定難度，且嬰幼兒哮喘反復(fù)發(fā)作患兒使用糖皮質(zhì)激素、白三稀受體拮抗劑治療方法存在爭議，尋找一種切實可行的方法治療嬰幼兒哮喘一直是兒科中的熱點問題[2]。本研究通過幼鼠模型，探討“培土生金法”對其氣道炎癥改善情況，旨在探討兒童哮喘的藥理機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

表1 Underwood組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

1 資料與方法

1.1 研究對象及所需藥物

1.1.1 研究對象 由廣州中醫(yī)藥大學(xué)生物學(xué)研究所動物中心提供30只無特定病原體10d雌性幼鼠納入研究。

1.1.2 所需藥物 （1）Amresco品牌雞卵清蛋白，CAS編號：9006-59-1；（2）Elabscience品牌小鼠IL-10、IL-17及TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附測定試驗盒；（3）異功散：人參、白術(shù)、茯苓、廣陳皮、甘草各取一份配成水煎劑，制成生藥質(zhì)量濃度1g/mL的溶劑；（4）常樂康膠囊：山東科興生物制藥有限公司，S20020015，420mg×12 粒。

1.2 方法

幼鼠首先進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，后分為正常對照組、模型組、常樂康組、異功散低量組、異功散中量組及異功散大量組六組，每組5只幼鼠。所有幼鼠于1、13d進(jìn)行腹腔注射，正常對照組幼鼠注射生理鹽水0.2mL，其余五組幼鼠均注射10%卵清蛋白（OVA）溶液0.1mL、等體積佐劑液態(tài)鋁混合進(jìn)行致敏。隨后于20～22d將進(jìn)行致敏的幼鼠放置于密閉容器霧化吸入20min質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的OVA溶液，正常對照組幼鼠吸入生理鹽水，1次/d，幼鼠出現(xiàn)煩躁、噴嚏、抓鼻、前肢縮抬、呼吸短促、腹部凹陷等情況視為哮喘造模完成。

同時于造模開始時間起，1次/d從口腔灌注藥物直至造模結(jié)束，參照《實驗藥理方法學(xué)》換算藥物劑量，大量組給予20g/kg劑量的異功散、中量組給予10g/kg的異功散、低量組給予5g/kg的異功散。常樂康組使用420mg/次常樂康菌粉稀釋為25mL/kg溶液從口腔灌服。模型組、正常對照組幼鼠灌服同等劑量生理鹽水。

所有幼鼠在末次激發(fā)后24h麻醉致死，剖開胸腔分離肺組織用注射器沿氣管插管，生理鹽水清潔左肺、支氣管肺泡灌洗液（BALF）3000r/min離心5min取上清液，-80℃保存。肺組織病理觀察：取右肺組織脫水包埋，切片進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。IL-10、IL-17及TGF-β1：采用Elisa方法進(jìn)行測定。

1.3 評分標(biāo)準(zhǔn)

用Underwood的標(biāo)準(zhǔn)對肺組織病理學(xué)改變進(jìn)行評分[3]，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用F檢驗，多組間兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)變化

正常對照組肺組織僅見少量炎癥細(xì)胞浸潤、無明顯組織損傷、無水腫、上皮細(xì)胞完整；模型組可見重度炎癥細(xì)胞浸潤、膿腫形成、組織壞死、上皮細(xì)胞黏液增多；常樂康組存在中度炎癥細(xì)胞浸潤、組織有一定損傷、輕微水腫；大量異功散組炎癥細(xì)胞浸潤程度低、少量上皮細(xì)胞脫落；中量異功散組炎癥細(xì)胞浸潤程度中等、上皮細(xì)胞有一定脫落、存在水腫；低量異功散組炎癥組織浸潤程度較重、存在水腫、上皮細(xì)胞脫落較多。見圖1。

Underwood肺組織病理學(xué)評分顯示模型組評分顯著高于正常對照組、常樂康組、異功散大量組、異功散中量組、異功散低量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.2 IL-10、IL-17及TGF-β1指標(biāo)比較

模型組支氣管肺泡灌洗液中IL-10含量較低，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TGF-β1、IL-17含量與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；常樂康組、異功散組IL-10含量均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；異功散低劑量組IL-10與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；異功散低劑量IL-17與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

圖1 各組肺組織病理變化情況

表2 肺組織HE染色underwood評分比較（x ± s，分）

3 討論

在中醫(yī)中，認(rèn)為哮喘主要是由于伏痰留飲導(dǎo)致的，同機(jī)體脾臟間具有顯著關(guān)系，機(jī)體肺、脾具有相互依賴、調(diào)節(jié)氣血津液、水液代謝的作用[4]。肺主氣，脾益氣；肺主行水，脾主運化水濕。故肺與脾的病理關(guān)系主要表現(xiàn)在氣和水液代謝功能異常方面，脾肺相關(guān)的哮喘理論在中醫(yī)肺系系統(tǒng)疾病中具有重要的理論支撐作用[5]。

表3 支氣管肺泡灌洗液IL-10、IL-17及TGF-β1指標(biāo)比較（x ± s，pg/mL）

兒童在中醫(yī)理論中認(rèn)為臟器較為嬌嫩，行氣未充，通常來講，兒童的支氣管哮喘都不是由單純的腎虛引發(fā)，多和脾虛、肺常不足具有聯(lián)系[6]。“培土生金法”即補(bǔ)脾（土）益氣而達(dá)到補(bǔ)益肺（金）氣的方法，適用于脾胃虛弱，不能滋養(yǎng)肺而致肺虛脾弱之證[7]。異功散方劑出自《小兒藥證直訣》，又稱為五味異功散、錢氏異功散，其記載“主治脾虛氣滯、飲食減少、胸脘痞悶、食入作脹、大便溏薄、神疲氣短、身體羸瘦、或面部浮腫者?！痹摲絼┟撎ビ谒木訙?，在其基礎(chǔ)上加用了陳皮，旨在取得行氣化滯，醒脾助運之功用，在小兒“脾常不足”上正好對癥，該方劑在我國已被廣泛加以應(yīng)用[8]。對于支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制，Th1及Th2平衡失調(diào)理論已經(jīng)難以站住腳跟，在相關(guān)研究[9]中表明CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg）同Th17之間存在密切聯(lián)系。Treg細(xì)胞作為機(jī)體免疫反應(yīng)程序中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因素，其能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫性耐受，IL-10及TGF-β因子都可以起到T細(xì)胞增殖的抑制作用，同時也能對Th1/Th2細(xì)胞因子反應(yīng)進(jìn)行抑制[10]。Th17細(xì)胞可以分泌IL-17，進(jìn)而對人體上皮細(xì)胞產(chǎn)生刺激，隨后分泌出趨化因子更加重中性粒細(xì)胞的浸潤作用，最終導(dǎo)致氣道炎癥[11]?？梢奣h17及Treg是過敏性疾病（包括哮喘）的重要誘導(dǎo)因素，同時，在機(jī)體早期，Treg/Th17能夠直接受到微生物的影響，極易對機(jī)體（幼鼠或人體）腸道菌群/黏膜免疫的正常構(gòu)建產(chǎn)生影響[12]。在彭吉祥等[13]的研究中指出，雙歧桿菌可以平衡Treg/Th17細(xì)胞亞群數(shù)量，促進(jìn)Treg型細(xì)胞因子表達(dá)，從而抑制Th17型細(xì)胞因子分泌[14-15]。在本研究中，異功散對早期支氣管哮喘幼鼠進(jìn)行干預(yù)能夠改善其炎癥反應(yīng)，幼鼠的炎癥反應(yīng)改善程度與異功散劑量有直接關(guān)聯(lián)，揭示異功散在支氣管哮喘的治療和預(yù)防中具有正面作用，能夠提高IL-10含量，但I(xiàn)L-17含量并未發(fā)現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)性。

綜上所述，異功散對于支氣管哮喘具有一定的防治作用，但其對Treg/Th17的平衡作用仍待進(jìn)一步的考證。