Rac1蛋白在人卵巢漿液性腺癌組織中的表達(dá)及其對卵巢癌細(xì)胞SKOV3遷移能力的影響△

蘇夢亞，黃平，齊冰麗，姚海榮，張紀(jì)妍

滄州市中心醫(yī)院婦一科，河北 滄州 061000

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，病死率高，早期癥狀不明顯，且無可靠的篩查方法，多數(shù)患者出現(xiàn)癥狀時往往已進(jìn)展至晚期，且已發(fā)生腹腔種植與轉(zhuǎn)移，病死率較高[1]。研究發(fā)現(xiàn)，世界范圍內(nèi)卵巢癌的發(fā)病率呈上升趨勢，而且長期化療使卵巢癌患者的精神處于焦慮、抑郁的狀態(tài)，因此，有效的治療方法成為高發(fā)病率、高轉(zhuǎn)移率卵巢癌患者的迫切需要[2]。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)觀察Rac1蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，探索其對卵巢癌惡性生物學(xué)行為的影響，從而為探索新的卵巢癌治療方法提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年2月至2017年12月滄州市中心醫(yī)院收治的90例卵巢腫瘤患者。納入標(biāo)準(zhǔn)[3]：初診為卵巢漿液性腺癌和卵巢良性漿液性囊腺瘤；對治療方案知情且簽署治療知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并代謝功能障礙；合并心血管、腦血管、肝、腎等其他系統(tǒng)疾??；合并精神類疾??；妊娠期或哺乳期婦女；身體條件不允許接受化療[4]。90例卵巢腫瘤患者的年齡為28～60歲，平均年齡為（43.39±7.54）歲；病程為2～9年，平均病程為（5.1±1.2）年。收集90例卵巢腫瘤患者的卵巢腫瘤組織標(biāo)本，包括卵巢漿液性腺癌組織標(biāo)本59例和卵巢良性漿液性囊腺瘤組織標(biāo)本31例；同時，收集同期健康體檢者的正常卵巢組織標(biāo)本35例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測Rac1蛋白表達(dá) 采用酶標(biāo)儀檢測蛋白樣品濃度，取適量蛋白，加入溴酚藍(lán)與RIPA裂解液，煮沸7 min，將蛋白樣品徹底變性，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳后，5%脫脂奶粉封閉90 min后，采用Western blot檢測目標(biāo)蛋白條帶，根據(jù)條帶灰度顯示情況判斷Rac1蛋白的相對表達(dá)量[5]。

1.2.2 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 設(shè)計siRNA靶序列，接入pSR-GFP/neo質(zhì)粒，通過G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，驗(yàn)證Rac1表達(dá)缺失的細(xì)胞（構(gòu)建的目的細(xì)胞株SKOⅤ3-Rac1i）[6]。采用iRNA干擾技術(shù)沉默內(nèi)源性Rac1的表達(dá)，將設(shè)計合成的3條Rac1干擾片段分別與空質(zhì)粒載體連接合成重組質(zhì)粒，檢測重組載體質(zhì)粒pSR-GFP/neo-Rac1i是否構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的3條Rac1干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入SKOⅤ3細(xì)胞，72 h后提取總蛋白，Western blot檢測各載體對Rac1蛋白的抑制率，檢測3個干擾片段的干擾效果，選取載體抑制效果較好的片段質(zhì)粒作為SKOⅤ3-Rac1i用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 將收集的全部細(xì)胞分為SKOⅤ3-Rac1i細(xì)胞組和野生型SKOⅤ3組，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞種植于6孔板內(nèi)，用含絲裂霉素C的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，然后于孔板底部進(jìn)行劃痕，并置入孵箱進(jìn)行下一步培養(yǎng)。在固定范圍內(nèi)取樣拍照，并用直尺測量同一部位的劃痕寬度，觀察不同時間點(diǎn)（0、24、48、72 h）的細(xì)胞遷移能力[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析和重復(fù)測量方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中Rac1蛋白的表達(dá)情況

卵巢漿液性腺癌組織中Rac1蛋白的相對表達(dá)量為（0.89±0.16），卵巢良性漿液性囊腺瘤組織中Rac1蛋白的相對表達(dá)量為（0.69±0.14），卵巢正常組織中Rac1蛋白的相對表達(dá)量為（0.72±0.13），組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=24.666，P＜0.01）。卵巢漿液性腺癌組織中Rac1蛋白的相對表達(dá)量明顯高于卵巢良性漿液性囊腺瘤組織和卵巢正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.875、5.326，P＜0.01）；卵巢良性漿液性囊腺瘤組織和卵巢正常組織中Rac1蛋白的相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 構(gòu)建Rac1缺失性表達(dá)細(xì)胞株

與陰性質(zhì)粒比較，1號干擾片段質(zhì)粒對Rac1蛋白的抑制率為（12.59±2.65）%，2號干擾片段質(zhì)粒對Rac1蛋白的抑制率為（56.48±6.25）%，3號干擾片段質(zhì)粒對Rac1蛋白的抑制率為（73.68±5.29）%。其中，3號干擾片段質(zhì)粒的抑制效果較好，作為SKOⅤ3-Rac1i用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 SKOV3-Rac1i細(xì)胞遷移能力的比較

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同時間點(diǎn)SKOⅤ3-Rac1i細(xì)胞組和野生型SKOⅤ3組SKOⅤ3-Rac1i細(xì)胞的遷移能力比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F時間=5.291，P時間＜0.05）；SKOⅤ3-Rac1i細(xì)胞組和野生型SKOⅤ3組SKOⅤ3-Rac1i細(xì)胞的遷移能力比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F組間=4.089，P組間＜0.05）；SKOⅤ3-Rac1i細(xì)胞組和野生型SKOⅤ3組SKOⅤ3-Rac1i細(xì)胞的遷移能力在組間和時間上存在交互作用（F交互=6.131，P交互＜0.05）。SKOⅤ3-Rac1i細(xì)胞組SKOⅤ3-Rac1i細(xì)胞24、28、72 h的遷移能力均低于野生型SKOⅤ3組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.258、11.665、11.843，P＜0.05）。（表1）

表1 兩組SKOⅤ3-Rac1i細(xì)胞不同時間點(diǎn)的遷移能力（±s）

表1 兩組SKOⅤ3-Rac1i細(xì)胞不同時間點(diǎn)的遷移能力（±s）

組別野生型S K OⅤ3組S K OⅤ3-R a c 1 i細(xì)胞組0.3 8±0.0 2 0.1 8±0.0 2 0.5 8±0.1 0 0.3 5±0.0 3 0.8 1±0.2 0 0.5 2±0.1 2 2 4 h 4 8 h 7 2 h

3 討論

卵巢癌是婦科腫瘤中致死率最高的一類疾病，缺乏有效的早期診斷手段是其發(fā)病率和病死率較高的重要原因。隨著RNA干擾技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，對卵巢癌抑癌基因和細(xì)胞免疫因素的研究對卵巢癌的臨床診斷和治療起著重要的指導(dǎo)作用[8-10]。卵巢癌的發(fā)展與某些蛋白的表達(dá)和基因的異常等密切相關(guān)，結(jié)合臨床實(shí)踐探究這些因子在卵巢惡性腫瘤中的表達(dá)情況及其與卵巢癌惡性生物學(xué)行為的關(guān)系逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，以期為卵巢癌的臨床診治提供理論依據(jù)[11-12]。

卵巢癌起病隱匿，易發(fā)生擴(kuò)散。轉(zhuǎn)移、侵襲是卵巢癌重要的生物學(xué)特征，而腫瘤細(xì)胞遷移的啟動與細(xì)胞伸出偽足并與周圍基質(zhì)黏附有關(guān)，而Rac1參與調(diào)控細(xì)胞板狀偽足的形成，進(jìn)而調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在各種致癌因素的作用下，卵巢局部組織的細(xì)胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致其異常增生。卵巢癌細(xì)胞的遷移是由偽足的形成并與基質(zhì)的黏附而啟動的。Rac1蛋白在信號傳導(dǎo)過程中具有重要功能。Rac1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在惡性組織中的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄過程中通過選擇性剪接Rac1b基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可增加一個外顯子，這是一種持續(xù)的活性突變體，對于卵巢癌細(xì)胞的增殖有很大影響[13]。本研究探究了Rac1蛋白表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞SKOⅤ3遷移能力的影響，結(jié)果顯示，卵巢漿液性腺癌組織中Rac1蛋白的表達(dá)最活躍；下調(diào)SKOⅤ3-Rac1i的表達(dá)時，SKOⅤ3-Rac1i細(xì)胞的遷移能力下降（P＜0.05）。由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多基因參與的生物學(xué)過程，單純的某一腫瘤基因被阻斷并不可能達(dá)到抑制腫瘤生長的目的，而利用RNAi可以針對同一基因家族保守序列的dsRNA同時抑制多個相關(guān)基因的表達(dá)。RNAi可使特定基因沉默，具有較強(qiáng)的干擾活力，是靶向基因治療的有效手段，對推動腫瘤基因治療的發(fā)展具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，3號干擾片段質(zhì)粒對Rac1蛋白的抑制率較高，載體抑制效果較好，被作為SKOⅤ3-Rac1i；與野生型SKOⅤ3組相比，SKOⅤ3-Rac1i細(xì)胞組的遷移速度明顯下降（P＜0.05）。提示下調(diào)Rac1表達(dá)后，SKOⅤ3細(xì)胞的遷移能力受到抑制。腫瘤細(xì)胞的侵襲方式包括間充質(zhì)移動、變形蟲樣移動、集團(tuán)移動[14]，這3種運(yùn)動方式均需要腫瘤細(xì)胞內(nèi)在的改變和外在因素的觸發(fā)從而獲得運(yùn)動能力。Rac1是一類重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其過表達(dá)與卵巢癌的進(jìn)展有關(guān)，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。激活的Rac1亦可通過調(diào)節(jié)MMP及其組織特異性抑制因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)Rac1蛋白在卵巢癌組織中呈高表達(dá)，說明Rac1蛋白過表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)，肌動蛋白的表達(dá)可負(fù)調(diào)控Rac的激活，Rac1可作為肌動蛋白的靶點(diǎn)從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移和增殖[15]。Tiaml蛋白可介導(dǎo)Rac1從無活性的鳥苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）轉(zhuǎn)換為有活性的鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）。因此，Tiam1/Rac1信號在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。惡性腫瘤組織中Rac1的表達(dá)水平較高，且隨著腫瘤惡化程度的增加，Rac1的表達(dá)呈增高趨勢。Rac1的表達(dá)可作為反映卵巢癌進(jìn)展和惡性程度的參考指標(biāo)，具有預(yù)后意義。

綜上所述，Rac1蛋白與卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)，其在卵巢癌中呈高表達(dá)，且其表達(dá)的缺失對于預(yù)測卵巢癌細(xì)胞的遷移能力有顯著的臨床價值。但本研究存在不足之處，如納入的樣本量不足，因此，在后續(xù)的研究中將進(jìn)一步補(bǔ)充臨床資料、擴(kuò)大樣本量，深入研究Rac1蛋白在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用，以進(jìn)一步闡明卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的潛在分子機(jī)制。