circRNA 的生物學(xué)功能及其在卵巢癌中的研究進(jìn)展

劉致新，孫文洲，李佳欣，于麗波#

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1婦科，2內(nèi)科，哈爾濱 150000

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）在人類基因組占相當(dāng)大比例，在基因表達(dá)和調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。除了核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn) RNA（transfer RNA，tRNA）、核小RNA（small nuclear RNA，snRNA）、小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）等ncRNA外，環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）也是ncRNA家族的成員。目前，circRNA已被發(fā)現(xiàn)存在于類病毒、酵母菌和人類基因轉(zhuǎn)錄本中，但對其認(rèn)識尚不足，僅被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄本中異常剪接的低豐度RNA。隨著高通量測序技術(shù)證實(shí)了circRNA在真核細(xì)胞中的普遍性及其與人類疾病發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系，circRNA已成為了RNA研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

1 circRNA 的起源和特點(diǎn)

1.1 circRNA的起源

circRNA的末端不含有5'末端帽子和3'末端poly（A）尾巴，通過“反向剪接”以共價(jià)鍵的方式形成封閉的共價(jià)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由編碼蛋白質(zhì)基因、tRNA和長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）之間的基因間隔物而產(chǎn)生[1-2]。circRNA根據(jù)序列來源的不同可分為3類：①外顯子circRNA，僅由外顯子組成，主要位于細(xì)胞質(zhì)中；②內(nèi)含子circRNA，僅由內(nèi)含子組成，主要位于細(xì)胞核內(nèi)；③外顯子-內(nèi)含子circRNA（exon-intron circRNA，EIciRNA），由外顯子和內(nèi)含子共同環(huán)化行成，主要位于細(xì)胞核內(nèi)。

目前，circRNA主要由外顯子環(huán)化而成，外顯子的環(huán)化包括套索驅(qū)動環(huán)化和內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化兩種形式[3]。在套索驅(qū)動的循環(huán)過程中，軸突跳躍產(chǎn)生一個套索，套索從內(nèi)部被拼接后進(jìn)而形成一個circRNA。套索驅(qū)動的另一種循環(huán)方式不是從軸突跳動開始的，而是由RNA的二級結(jié)構(gòu)和含有軸突的Alus元件反向互補(bǔ)配對形成，環(huán)化軸突兩側(cè)的內(nèi)含子連接供體剪接位點(diǎn)和受體剪接位點(diǎn)，形成最終的循環(huán)。近年來，研究顯示，堿基互補(bǔ)配對在內(nèi)含子重復(fù)序列之間也同樣存在，軸突兩側(cè)內(nèi)含子重復(fù)序列之間的互補(bǔ)配對在circRNA的形成過程中起重要作用，一個基因內(nèi)的Alu反向重復(fù)序列（重組核酸內(nèi)切酶的識別序列）之間的選擇性配對和競爭，可以產(chǎn)生多個circRNA。內(nèi)含子的自環(huán)化也可產(chǎn)生內(nèi)含子circRNA。

1.2 circRNA的特點(diǎn)

與線性RNA相比，circRNA具有以下特征：①主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，偶爾存在于細(xì)胞核中[4]；②通過順式作用元件介導(dǎo)的miRNA相互作用來調(diào)控靶基因的表達(dá)[5]；③主要由外顯子發(fā)展而來，偶爾由內(nèi)含子或內(nèi)含子片段發(fā)展而來；④主要調(diào)控內(nèi)源性ncRNA的表達(dá)；⑤主要在轉(zhuǎn)錄前后起作用，偶爾在轉(zhuǎn)錄過程中起作用[6]；⑥具有組織特異性和發(fā)育階段特異性[7]；⑦常存在于唾液、血液、尿液等細(xì)胞外液中，其表達(dá)水平是線性mRNA的10倍[8]；⑧在各物種的進(jìn)化過程中起保護(hù)作用；⑨具有共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不含5'端帽子和3'端多聚（A）尾巴，對RNA外切酶或核酸外切酶RNaseR具有高度抗性[9]。這些特點(diǎn)使circRNA的生物學(xué)功能具有較高的穩(wěn)定性。至今，在無細(xì)胞唾液（cell free saliva，CFS）中發(fā)現(xiàn)了400多株circRNA[10]。

1.3 circRNA 的生物學(xué)功能

1.3.1 作為微小RNA 的海綿 circRNA（主要是Sry-circRNA和CiRS-7）與微小RNA（microRNA，miRNA）之間的相互作用引起了研究者的廣泛關(guān)注。Capel等[11]發(fā)現(xiàn)，Sry是小鼠Y染色體上可以轉(zhuǎn)錄為circRNA的性別決定基因。有研究進(jìn)一步驗(yàn)證了Sry-cricRNA可以發(fā)揮miRNA的海綿作用，包含16個能夠結(jié)合miRNA-138的位點(diǎn)[12]。此外，CDR1as/CiRS-7是在人或小鼠腦中大量存在的circRNA，主要由小腦退化相關(guān)蛋白1（cerebellar degeneration-related protein 1，CDR1）反義鏈轉(zhuǎn)錄而成。CiRS-7中包括73個miRNA-7結(jié)合位點(diǎn)，并且具有吸附miRNA-7、上調(diào)miRNA-7表達(dá)和抑制miRNA-7生物學(xué)功能的作用。Thomas和S?trom[13]證明大量的circRNA可發(fā)揮海綿效應(yīng)吸附miRNA。但是，目前，僅有小部分circRNA的海綿功能得到了驗(yàn)證。

1.3.2 作為RNA 的結(jié)合蛋白 在細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)位、凋亡、衰老、氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中，RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding protein，RBP）主要參與RNA轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，包括選擇性剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)circRNA吸附Argonaute（AGO）蛋白、RNA聚合酶Ⅱ（polymeraseⅡ，PolⅡ）、真核生物起始因子4A-3（eukaryotic initiation factor 4A-3，EIF4A3）時，會產(chǎn)生穩(wěn)定的RNA-蛋白復(fù)合物（RNA-protein complex，RPC）。RPC可以調(diào)節(jié)RBP的表達(dá)，并與線性RNA相互作用[14]。研究證明，部分circRNA與RNA具有協(xié)同作用，如與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合的circ-foxo3和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase2，CDK2）相互作用從而使細(xì)胞周期阻滯在G1/S期[15]。

1.3.3 作為編碼蛋白質(zhì)的翻譯 circRNA屬于ncRNA，幾乎不編碼蛋白質(zhì)。但是，一旦一個內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）被插入至circRNA起始密碼子的上游，編碼就會被啟動，并產(chǎn)生在功能上不同于線性RNA轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄本。真核核糖體的40S亞基可以與含有IRES的circRNA結(jié)合從而啟動翻譯。同樣，在大腸桿菌中，攜帶轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白開放編碼框的circRNA可以啟動綠色熒光蛋白的表達(dá)。但是，截止到目前，只有病毒中的circRNA被發(fā)現(xiàn)可以編碼真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，例如，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBⅤ）的衛(wèi)星病毒丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDⅤ）可以通過與HBⅤ共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞進(jìn)行翻譯[16]。病毒中circRNA的翻譯可能與特定病毒介質(zhì)有關(guān)。Legnini等[17]發(fā)現(xiàn)，攜帶IRES的circ-ZNF609可以翻譯肌蛋白。circRNA首次在RNA病毒中被發(fā)現(xiàn)[18]。Abe等[19]發(fā)現(xiàn)，在無任何特定因素允許進(jìn)入內(nèi)部核糖體的情況下，含有多個標(biāo)記編碼序列的人工circRNA可以通過滾動圓擴(kuò)增翻譯蛋白。

2 circRNA 在卵巢癌中的相關(guān)研究

卵巢癌是女性的常見惡性腫瘤，是婦科腫瘤相關(guān)死亡的重要病因，晚期卵巢癌患者的5年生存率僅為30%[20]。卵巢癌患者通常采用腫瘤細(xì)胞減滅手術(shù)和鉑類標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行治療。然而，常規(guī)治療往往會導(dǎo)致化療耐藥，從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)甚至死亡。因此，為了更好地控制卵巢癌的嚴(yán)重程度，有必要尋找新的分子機(jī)制和潛在的治療靶點(diǎn)。circRNA雖廣泛存在，但其表達(dá)豐度低，使其曾被誤解為剪接錯誤，而后高通量測序數(shù)據(jù)證實(shí)了circRNA在真核細(xì)胞中大量存在。值得注意的是，circRNA與人類多種疾病的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)，尤其是惡性腫瘤。然而，人們對circRNA在卵巢癌中的特性仍認(rèn)識不足。

2.1 circRNA在卵巢癌中的表達(dá)

Ahmed等[21]對3例ⅢC期卵巢癌患者的原發(fā)灶、腹膜和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行RNA配對測序檢測，發(fā)現(xiàn)circRNA存在差異性表達(dá)，且mRNA的高表達(dá)與circRNA表達(dá)的下調(diào)是同步的。miRNA let-7負(fù)調(diào)控原癌基因RAS和MYC，在原發(fā)灶中的表達(dá)水平明顯低于腹膜轉(zhuǎn)移。但是，能夠編碼包含多個miRNA let-7結(jié)合位點(diǎn)的circRNA基因在原發(fā)灶中高表達(dá)，這可能是circRNA具有miRNA海綿作用的原因。Bachmayr-Heyda等[22]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA豐度（circRNA指數(shù)）與卵巢癌細(xì)胞和正常卵巢上皮細(xì)胞的增殖具有相關(guān)性。

2.2 circRNA對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

Xie等[23]等研究發(fā)現(xiàn)，circEPSTI1在卵巢癌組織中過表達(dá)，且抑制circEPSTI1的表達(dá)能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲，加速腫瘤細(xì)胞凋亡；circEPSTI1序列中存在miRNA-942的互補(bǔ)位點(diǎn)，且miRNA-942在卵巢癌組織中呈低表達(dá)；熒光素酶檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)circEPSTI1能與miRNA-942直接結(jié)合；MS2bp-MS2bs的RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-942主要富集于MS2bs-circEPSTI1結(jié)合物中，表明circEPSTI1與miRNA-942存在一定的相互作用；通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EPSTI1在卵巢癌組織中呈過表達(dá)，同時miRNA-942可抑制EPSTI1的表達(dá)，表明EPSTI1是miRNA-942的直接靶點(diǎn)。因此，敲除circEPSTI1后EPSTI1的表達(dá)下降，但miRNA-942可以逆轉(zhuǎn)此種抑制作用。這些結(jié)果表明，circEPSTI1可以通過海綿miRNA-942調(diào)控EPSTI1的表達(dá)和卵巢癌的進(jìn)展。

Luo等[24]研究發(fā)現(xiàn)Circ-ITCH在EOC組織中的表達(dá)水平低于鄰近組織，且與EOC的腫瘤大小和FIGO分期呈負(fù)相關(guān)；Circ-ITCH高表達(dá)對EOC細(xì)胞的增殖起抑制作用，對腫瘤細(xì)胞的凋亡起促進(jìn)作用。Circ-ITCH位于染色體20q11.22上，主要通過加強(qiáng)E3泛素連接酶的作用，促進(jìn)磷酸化Dvl2的泛素化和降解，進(jìn)一步對Wnt信號發(fā)揮抑制作用，從而在乳腺癌、食管癌、肝癌等多種腫瘤的發(fā)生中起抑制作用，已被證明可以介導(dǎo)多個基因或信號通路，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和侵襲中發(fā)揮重要作用[25-28]。由此可推測，circRNA的表達(dá)水平與OC細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等多種惡性生物學(xué)行為有關(guān)。

2.3 circRNA作為卵巢癌生物標(biāo)志物

circRNA表達(dá)的差異性是其作為生物標(biāo)記物的基礎(chǔ)，在多種腫瘤的進(jìn)展、治療與預(yù)后預(yù)測中發(fā)揮不同的作用。Li等[29]研究表明，circ-CSPP1在卵巢癌組織中的表達(dá)水平高于正常卵巢組織和良性卵巢病變組織，且circ-CSPP1的表達(dá)與卵巢癌的腫瘤分期、分化程度呈正相關(guān)；研究還發(fā)現(xiàn)，沉默circ-CSPP1可上調(diào)miRNA-1236-3p的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-1236-3p通過與E盒結(jié)合鋅指蛋白1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）靶向結(jié)合從而在卵巢癌中發(fā)揮抑癌作用，沉默circ-CSPP1可下調(diào)ZEB1蛋白及其mRNA的表達(dá)[30-31]。ZEB1主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，在卵巢癌細(xì)胞系中沉默circ-CSPP1可以上調(diào)miRNA-1236-3p的表達(dá)，降低ZEB1mRNA和蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲，結(jié)果提示，circ-CSPP1的表達(dá)越活躍，腫瘤的惡性程度越高，預(yù)示卵巢癌患者的預(yù)后較差。

2.4 circRNA 作為卵巢癌治療新靶點(diǎn)及預(yù)后判斷新指標(biāo)

Hu等[32]研究發(fā)現(xiàn)，circ-ITCH、miRNA-145在卵巢癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)呈負(fù)性相關(guān)。circ-ITCH在體內(nèi)外通過circ-ITCH-miRNA-145-RASA1軸發(fā)揮外顯子circRNA海綿作用，進(jìn)而提高RASA1的表達(dá)水平、抑制惡性腫瘤的進(jìn)展，為卵巢癌提供了新的治療靶點(diǎn)。關(guān)于circ-ITCH對預(yù)測腫瘤預(yù)后的價(jià)值，也進(jìn)行了多項(xiàng)研究。因此，circ-ITCH高表達(dá)可能是EOC患者OS的獨(dú)立預(yù)測因子。

Bao等[33]采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)檢測了 ⅤPS13C-has-circ-001567、RAD50-has-circ-00718、SPECC1-has-circ-000013在卵巢癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，為circRNA參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展提供了新的證據(jù)，研究結(jié)果顯示，三者在卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，其中，ⅤPS13C-has-circ-001567在卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯升高，推測ⅤPS13C-hascirc-001567在EOC發(fā)揮重要作用；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與高表達(dá)的ⅤPS13C-hascirc-001567呈正相關(guān)。該研究還發(fā)現(xiàn)，ⅤPS13C-has-circ-001567參與了卵巢癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，且通過敲低VPS13C-has-circ-001567的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期阻滯和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的增殖和侵襲。因此，在臨床治療中可通過抑制腫瘤細(xì)胞中VPS13C-has-circ-001567基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展?；诖?，推測靶向circRNA（VPS13C-has-circ-001567）可能是卵巢癌患者預(yù)后預(yù)測和克服治療相關(guān)耐藥性的新靶點(diǎn)。

Ning等[34]研究發(fā)現(xiàn)，與正常卵巢組織相比，部分circRNA在EOC中存在差異性表達(dá)，在EOC的發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用；circEXOC6B和circN4BP2L2的表達(dá)水平分別與EOC患者的OS、無進(jìn)展生存期呈正相關(guān)，與國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。circEXOC6B和circN4BP2L2可能具有作為EOC預(yù)后標(biāo)志物的潛力，從而輔助EOC患者選擇個性化的治療方案。

作為ncRNA家族的新成員，circRNA似乎更具有成為新的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)的潛力。由于高成本的高通量測序和較少現(xiàn)有研究測序的樣本量，雖然后續(xù)驗(yàn)證總樣本量滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，但具體到卵巢癌各組織分型樣本數(shù)據(jù)明顯欠缺，從而使circRNA在各組織分型中橫向?qū)Ρ鹊臄?shù)據(jù)缺失或不可靠。但circRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、較長半衰期且不易被降解的特征為針對circRNA藥物的進(jìn)一步研發(fā)賦予可行性。目前，基于circRNA的藥物研發(fā)尚處于起步階段，其相關(guān)功能和機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

3 小結(jié)與展望

目前，對circRNA的研究尚處于起步階段，尤其在卵巢癌研究領(lǐng)域甚少。由于人們對circRNA認(rèn)知的缺乏，導(dǎo)致circRNA曾一度被認(rèn)為是RNA剪接過程中的“噪音”。隨著高通量測序和生物信息技術(shù)的發(fā)展，circRNA的生物學(xué)特點(diǎn)、生理功能及其在相關(guān)疾病中的作用被發(fā)掘，進(jìn)而成為了RNA領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。circRNA有望成為一種新的卵巢癌的生物標(biāo)志物，為其臨床診斷、治療及預(yù)測預(yù)后提供新的思路。