白細(xì)胞介素-8沉默對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制研究

張潛英，唐正琪，郝成羅，岳顯，馬麗梅，陳鴻雁

自貢市第三人民醫(yī)院1耳鼻咽喉頭頸外科，2腫瘤科，3病理科，四川 自貢 643020

4重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，重慶 400016

白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）是最早發(fā)現(xiàn)的趨化因子，可在促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化和脫粒中發(fā)揮重要作用[1-3]。研究顯示，IL-8可以激活G蛋白偶聯(lián)受體[包括CXC趨化因子受體1（C-X-C chemokine receptor 1，CXCR1）和CXC趨化因子受體2（C-X-C chemokine receptor 2，CXCR2）]下游的多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路[4-5]。研究顯示，IL-8及其受體在多種腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、浸潤(rùn)性中性粒細(xì)胞和腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞中表達(dá)均上調(diào)[6-9]，表明IL-8可能在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控因子的作用。既往研究表明，IL-8表達(dá)上調(diào)與腫瘤形成、進(jìn)展及血管形成密切相關(guān)[4]。研究表明，IL-8在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)肺癌及胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程[2,4,8-9]；IL-8也可以通過(guò)調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[3,5,7]。目前，研究者已對(duì)IL-8在多種惡性腫瘤中的作用進(jìn)行了研究，但其在喉鱗狀細(xì)胞癌中的研究仍然較少。

喉鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部腫瘤中惡性程度最高的腫瘤之一[10-12]，雖然發(fā)病率和病死率逐年降低，但其現(xiàn)狀仍不樂(lè)觀[13]。數(shù)據(jù)顯示，2013年美國(guó)喉鱗狀細(xì)胞癌新發(fā)12 260例，病死3630例[14]。雖然喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率和病死率較低，但咳嗽、呼吸困難和吞咽困難等由其引起的并發(fā)癥可導(dǎo)致患者預(yù)后較差，此外，臨床對(duì)分化程度較高的喉鱗狀細(xì)胞癌患者的診斷和治療仍較困難[15-17]。本研究旨在探討沉默IL-8的表達(dá)對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以及對(duì)凋亡相關(guān)因子cleaved caspase 3、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，BAX）表達(dá)的影響。另外，龐雪莉等[18]研究發(fā)現(xiàn)，IL-8可通過(guò)激活磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號(hào)通路進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡。因此，本研究進(jìn)一步對(duì)IL-8的分子機(jī)制進(jìn)行了研究，旨在為喉鱗狀細(xì)胞癌的有效治療奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自江蘇四季青生物公司，IL-8小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）購(gòu)自上海杰李生物技術(shù)有限公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、蛋白裂解液均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，IL-8抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，AKT、磷酸化AKT（phosphorylated-AKT，p-AKT）、cleaved caspase 3、Bcl-2、BAX、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司，噻唑藍(lán)（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞系在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將IL-8siRNA和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組將僅加入Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑的喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞作為NC組，未做處理的細(xì)胞作為空白組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取3組喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后向3組細(xì)胞中加入0.5 mg/ml的MTT溶液，培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去MTT溶液后，每孔加入150 μl的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），搖床振蕩10 min，采用酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（optical density，OD）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 取3組喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞，采用預(yù)冷的PBS沖洗2次，采用的0.25%的胰蛋白酶消化50 s，立即采用細(xì)胞培養(yǎng)基中和胰蛋白酶。收集細(xì)胞至1.5 ml的離心管中，1000 r/min，4℃離心4 min，除去上清液，收集細(xì)胞后采用500 μl的1×結(jié)合緩沖液（binding buffer）重懸，每管取100 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl FITCAnnexin Ⅴ孵育15 min，加入5 μl PI孵育15 min。室溫孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)8、AKT、p-AKT、cleaved caspase3、Bcl-2、BAX蛋白相對(duì)表達(dá)量 取3組喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞，采用預(yù)冷的PBS沖洗2次，接種于6孔板，每孔加入100 μl的蛋白裂解液（含蛋白酶及磷酸酶抑制劑），收集細(xì)胞至1.5ml離心管中，采用細(xì)胞超聲破碎儀10%的功率破碎細(xì)胞。冰上放置5 min充分裂解后，12000 r/min，4℃離心20 min，提取上清液至新的離心管中，提取細(xì)胞中的總蛋白。采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定各蛋白的濃度，將蛋白樣品配制成1×負(fù)載緩沖液（loading buffer），使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）分離蛋白樣品，電泳結(jié)束后，利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PⅤDF）膜上，100Ⅴ恒壓轉(zhuǎn)移1.5 h，5%脫脂牛奶封閉2 h，磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered solution toween，PBST）溶液沖洗3次。加入一抗4℃過(guò)夜孵育，PBST溶液洗膜，加入二抗，室溫孵育1 h，PBST洗膜3次后，以電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）法顯影，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、拍照，采用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖能力的比較

實(shí)驗(yàn)組喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞中IL-8蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.38±0.10），明顯低于NC組細(xì)胞的（0.77±0.14）和空白組細(xì)胞的（0.72±0.12），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.412、6.156，P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞的OD值為（0.64±0.09），明顯低于NC組細(xì)胞的（0.98±0.10）和空白組細(xì)胞的（1.00±0.13），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.148、6.440，P＜0.01）。

2.2 細(xì)胞凋亡情況的比較

實(shí)驗(yàn)組喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞的凋亡率為（41.63±3.76）%，明顯高于空白組細(xì)胞的（3.22±0.86）%和NC組細(xì)胞的（7.25±1.46）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=28.171、24.109，P＜0.01）。（圖1）

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞的凋亡情況

2.3 AKT、p-AKT、cleaved caspase3、Bcl-2、BAX蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

實(shí)驗(yàn)組Hep-2細(xì)胞中p-AKT和抑制凋亡蛋白Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量均低于空白組和NC組細(xì)胞，而促凋亡蛋白BAX和cleaved caspase 3的相對(duì)表達(dá)量均高于空白組和NC組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但3組Hep-2細(xì)胞AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）。

表1 3組細(xì)胞IL-8、AKT、p-AKT、cleaved caspase 3、Bcl-2、BAX蛋白的相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表1 3組細(xì)胞IL-8、AKT、p-AKT、cleaved caspase 3、Bcl-2、BAX蛋白的相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

注：a與NC組比較，P＜0.05；b與空白組比較，P＜0.05

蛋白A K T p-A K T c l e a v e d c a s p a s e 3 B c l-2 B A X實(shí)驗(yàn)組0.9 2±0.1 8 0.4 4±0.1 1 a b 0.5 1±0.1 3 a b 0.4 5±0.1 2 a b 0.3 7±0.0 8 a b N C組0.9 5±0.2 0 0.7 1±0.1 5 0.3 6±0.0 9 0.6 7±0.1 5 0.2 2±0.0 6空白組0.9 6±0.1 8 0.7 6±0.1 7 0.3 4±0.0 8 0.6 4±0.1 4 0.2 4±0.0 6

3 討論

腫瘤細(xì)胞與癌旁細(xì)胞的相互作用，包括多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用，在腫瘤進(jìn)展中均發(fā)揮重要作用[2,5,7]。IL-8也被稱為趨化因子配體8（C-X-C chemokine ligand 8，CXCL8），對(duì)中性粒細(xì)胞具有趨化作用，并可通過(guò)與相應(yīng)的受體結(jié)合調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程[3,7]。IL-8的受體包括CXCR1和CXCR2，這是一類跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，其下游的多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路在細(xì)胞存活、增殖和凋亡等生物進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1,6,8]。多項(xiàng)研究表明，IL-8及其受體在多種腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、浸潤(rùn)性中性粒細(xì)胞及腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[3,7,9]。腫瘤相關(guān)研究結(jié)果顯示，IL-8對(duì)腫瘤新生血管生成、中性粒細(xì)胞向腫瘤位點(diǎn)募集和腫瘤細(xì)胞存活、增殖和轉(zhuǎn)移均具有重要作用[2,8]。但目前對(duì)IL-8在喉鱗狀細(xì)胞癌中作用的研究較少，其在喉鱗狀細(xì)胞癌中的具體作用機(jī)制尚不明確。

喉鱗狀細(xì)胞癌作為頭頸部腫瘤中惡性程度最高的腫瘤之一[12,17]，盡管目前已有多種診斷和治療手段應(yīng)用于臨床，但喉鱗狀細(xì)胞癌患者的生存率一直較低[19-20]。這可能是因?yàn)榕R床針對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展及惡性進(jìn)展機(jī)制尚未完全明確，導(dǎo)致臨床對(duì)組織學(xué)分級(jí)較高的喉鱗狀細(xì)胞癌患者的診斷和治療較困難[21]。因此，本研究旨在探討喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為臨床診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和策略。

本研究結(jié)果顯示，IL-8siRNA可抑制喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞的增殖能力，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，IL-8siRNA可促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2的凋亡，表明IL-8可能在喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究通過(guò)檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路的激活情況及凋亡相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，IL-8可通過(guò)對(duì)PI3K/AKT相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控，抑制喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞的增殖能力，并促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，IL-8可通過(guò)對(duì)PI3K/AKT相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控，抑制喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞的增殖能力，并促進(jìn)其凋亡，為喉鱗狀細(xì)胞癌的診斷和治療提供了新的靶點(diǎn)及可能的治療策略。