椿根皮體外抑菌和活性部位的研究?

王婉卿 王 偉 王 雷

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南250001）

椿根皮，又名椿皮、樗白皮，即苦木科植物臭椿Ailanthus altissima（Mill.）Swingle的干燥根皮或干皮。其性味苦、澀、寒，入大腸、胃、肝經(jīng)，具有清熱解毒、燥濕止帶、收斂止血、澀腸止瀉的功效，臨床上常用于治療赤白帶下、崩漏等婦科病癥以及濕熱泄瀉、瀉痢不止、便血等消化道病癥［1］?，F(xiàn)代研究證實(shí)其作用主要有抗病毒、殺菌、解熱、消炎、抗瘧疾、抗癌等［2］，在治療陰道炎、子宮頸及內(nèi)膜炎、滴蟲性陰道炎、女陰炎等婦科疾病以及因細(xì)菌感染引起的痔瘡、結(jié)腸炎等消化系統(tǒng)疾病方面療效顯著。

目前關(guān)于椿根皮藥用價(jià)值的研究主要局限于其抗病毒、抗腫瘤、殺蟲的作用，至于椿根皮對(duì)細(xì)菌、真菌的抑制作用，研究方向也集中于對(duì)其特征性生物堿的分離提純［3］，而對(duì)椿根皮的整體抑菌性研究目前尚未見詳細(xì)報(bào)道；關(guān)于椿根皮抑菌成分的提取方法亦無系統(tǒng)的研究結(jié)論；藥典對(duì)椿根皮治療相關(guān)疾病的用量規(guī)定也與古籍效方差異較大。綜合中醫(yī)對(duì)椿根皮能清熱解毒、收澀止帶、燥濕止瀉的藥效認(rèn)識(shí)，以及現(xiàn)當(dāng)代研究確定其藥用成分具有解熱、驅(qū)蟲［4］、消炎、殺菌、抗病毒的作用，筆者將通過紙片擴(kuò)散法對(duì)椿根皮的水提物、50%醇提物、70%醇提物、80%醇提物及95%醇提物的抗菌效果進(jìn)行比較，確定其抑制菌種，進(jìn)一步開拓和證實(shí)椿根皮抑菌性最顯著的活性成分，探索椿根皮水提物和不同濃度的醇提物的最佳提取工藝，為開發(fā)抑菌類新藥以及椿根皮治療細(xì)菌感染的相關(guān)臨床應(yīng)用提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 游標(biāo)卡尺；計(jì)時(shí)器；水煎鍋；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵；凍干機(jī)；恒溫水浴箱；離心機(jī)；數(shù)控超聲波清洗器；十萬分之一電子天平；恒溫培養(yǎng)箱；超凈工作臺(tái)。

1.2 藥物與試劑 椿根皮飲片；乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；牛肉膏（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；氯化鈉（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；瓊脂粉（北京奧科斯生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；NaOH（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；HC（l國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；麥芽膏粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；氯霉素；大腸桿菌（Eco）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Sau）、綠膿桿菌（Pae）、白色念珠菌（Cal）（均由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供）

1.3 椿根皮提取物制備 1）不同濃度醇提物的制備。清洗藥材，晾干，粉碎，過篩；定量稱取椿根皮生藥4份，分別加入95%、80%、70%、50%乙醇，按照料液比為1∶10進(jìn)行提取，過濾，3 000 r/min離心，取上清液，并進(jìn)行濃縮至浸膏［5］備用。2）水提物的制備。粉碎藥材，定量稱取并水煎提3次，每次2 h，過濾；濾液以3 000 r/min離心10 min，取上清液并濃縮至適量（0.5 g生藥/mL），高壓滅菌后密閉封裝，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 紙片擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn) 1）無菌紙片及陽性對(duì)照、陰性對(duì)照紙片的制備。打孔器將新華1號(hào)濾紙制備為直徑6 mm的圓形紙片，取50片放入一清潔干燥的錐形瓶內(nèi)，瓶口以棉塞密閉后，用雙層報(bào)紙進(jìn)行包扎。121℃高壓滅菌30 min，再置于100℃干燥箱內(nèi)烘干放涼備用［6-8］。陽性對(duì)照藥為青霉素，將其稀釋成100 μg/mL置于滅菌青霉素瓶中，將用于陽性對(duì)照的紙片干燥后置于其中浸泡4 h，37℃干燥1 h后備用。陰性對(duì)照紙片滴加相應(yīng)組別的溶劑（超凈臺(tái)紫外滅菌）備用。2）菌種活化。將試驗(yàn)菌菌種用接種環(huán)從保存菌種的培養(yǎng)基上挑取并劃線接種于多根斜面培養(yǎng)基上［9］，本次實(shí)驗(yàn)采用二代菌種，菌種的保存是于4℃下保存。3）菌懸液制備。用接種環(huán)刮取新鮮菌落懸浮于10 mL 0.9%氯化鈉注射液（121℃高壓滅菌15～20 min）中混勻，稀釋至菌液濃度為2×105、2×106cfu/mL。4）培養(yǎng)基制備。（1）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配制比例為牛肉膏0.5 g/100 mL，氯化鈉0.5 g/100 mL，蛋白胨1 g/100 mL，瓊脂粉2 g/100 mL。按上述比例配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基并加入相應(yīng)比例的蒸餾水溶解，將以上材料煮至微沸，趁熱用NaOH（2 mol/L）將pH調(diào)至7.0并用pH試紙鑒定其酸堿度［10］。培養(yǎng)基冷卻至50℃后，在無菌操作臺(tái)中向培養(yǎng)皿傾倒培養(yǎng)基。倒入培養(yǎng)皿中的液態(tài)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)完全自然覆蓋皿底，厚度為4 mm（允許±1 mm誤差）。每次制成培養(yǎng)基平板均需檢定后再使用，新制平板培養(yǎng)基其含水量多而不利于藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，應(yīng)待培養(yǎng)基冷卻凝固后倒扣于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。若24 h后培養(yǎng)基平板沒有長菌則可以用于藥敏試驗(yàn)。（2）麥芽汁培養(yǎng)基的制備。麥芽汁培養(yǎng)基的配制比例為麥芽膏粉130 g，瓊脂15 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 000 mL，攪拌加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH值約為（6.0±0.2），分裝三角瓶，115℃高壓滅菌15 min，待冷卻至55～60℃時(shí)，按照上述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的操作方法進(jìn)行分裝。然后放置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。24 h后培養(yǎng)基平板沒有長菌則可以使用。

1.5 抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn) 在超凈工作臺(tái)中，將吸取校正的菌懸液200 μL滴于培養(yǎng)基（細(xì)菌選取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，真菌選取改良馬丁培養(yǎng)基）表面，用攤涂棒涂抹均勻，每次旋轉(zhuǎn)平皿60°，在平皿周邊涂2圈，保證均勻涂布。用滅菌的加樣槍分別加入10 μL的稀釋成1、0.5、0.25、0.125 mg/mL質(zhì)量濃度梯度的椿根皮50%醇提物，分別滴于4張無菌紙片上，每種溶液重復(fù)3次，待紙片干后將同濃度的紙片分別貼于同一培養(yǎng)基的四周，一張陰性對(duì)照紙片（其滴加的藥品為無菌生理鹽水）貼于中央，各紙片距離＞24 mm，與平皿邊緣＞15 mm。按上述方法共制備成4個(gè)椿根皮50%醇提物紙片培養(yǎng)基，且4個(gè)培養(yǎng)基的紙片藥物質(zhì)量濃度呈加倍梯度變化。按照上述方法對(duì)稀釋為同樣濃度梯度的椿根皮70%醇提物、80%醇提物、95%醇提物和水提物也用加樣槍分別加至相應(yīng)的紙片，并待晾干后貼至相應(yīng)的培養(yǎng)皿。將陽性對(duì)照紙片貼于各菌種單獨(dú)制備的相應(yīng)培養(yǎng)皿中作為陽性對(duì)照，其紙片貼敷方法為四周貼陽性對(duì)照紙片，中間貼陰性對(duì)照紙片（其滴加的藥品為無菌生理鹽水）。37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h（真菌放置于27℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h）后測量抑菌圈的大小，所有結(jié)果取平均值計(jì)算。紙片一旦接觸瓊脂不應(yīng)再移動(dòng)位置。紙片平板應(yīng)在15 min內(nèi)翻轉(zhuǎn)，在恒溫培養(yǎng)箱中平板最多2個(gè)疊起，確保受熱均勻。觀察一系列濃度的樣品濾紙片周圍抑菌環(huán)的有無，用游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)直徑，確定MIC。用游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)直徑，結(jié)果取平均值，抑菌環(huán)直徑＞7 mm者計(jì)為有抑菌作用，≤7 mm者計(jì)為無抑菌作用，3次重復(fù)試驗(yàn)均達(dá)到有抑菌作用結(jié)果者，判為合格。陰性對(duì)照組應(yīng)無抑菌環(huán)產(chǎn)生，否則試驗(yàn)無效。

2 結(jié) 果

椿根皮不同提取方法得到的提取物對(duì)Sau、Eco、沙門氏菌、Pae和Cal有不同的抑菌效果（見圖1），其中對(duì)Sau抑菌效果最好，椿根皮醇提物最小抑菌質(zhì)量濃度為0.125 mg/mL，而椿根皮水提物的最小抑菌質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL。椿根皮各質(zhì)量濃度醇提物和水提物對(duì)沙門氏菌無抑菌作用。所有陰性對(duì)照組菌株均正常生長，沒有抑菌環(huán)。椿根皮水提物及各濃度醇提物對(duì)Sau、Eco、沙門氏菌、Pae和Cal的MIC結(jié)果詳見表1，椿根皮水提物及各濃度醇提物對(duì)Sau、Eco、沙門氏菌、Pae和Cal的抑菌結(jié)果詳見表2。

圖1 椿根皮提物及各濃度醇提物對(duì)Sau、Eco、沙門氏菌、Pae和Cal的抑菌效果

3 討 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明椿根皮水提物對(duì)Sau及Cal有一定抑殺作用，對(duì)Eco、沙門氏菌和Pae均無抑殺作用。椿根皮醇提物因濃度不同，對(duì)Sau、Eco、Pae和Cal有不同程度的抑殺效果，但在抑殺沙門氏菌方面，只有95%椿根皮醇提物有較明顯的抑菌作用。朱玉鳳等的研究結(jié)果表明，椿皮水提取物能微弱抑殺Sau而不能抑殺Pae、Eco［11］；陳元坤等研究稱臭椿皮水煎液對(duì) Eco、沙門氏菌無抑菌作用，對(duì)葡萄球菌有一定抑制作用［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述兩點(diǎn)研究結(jié)果較為一致，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了椿根皮醇提物在針對(duì)Sau、Eco等常見菌種的抑殺方面其效果要優(yōu)于椿根皮水提物的抑菌效果。尤其是針對(duì)椿根皮水提物無法抑殺的Eco和Pae，70%和95%椿根皮醇提物的抑菌效果均比較顯著。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研制椿根皮抑菌方面的新藥無疑提供了新的研究方向和開發(fā)領(lǐng)域。至于95%椿根皮醇提物在1 mg/mL質(zhì)量濃度下對(duì)沙門氏菌有一定的抑菌作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由于與以往研究文獻(xiàn)略有出入，還需要進(jìn)一步開展對(duì)照實(shí)驗(yàn)分析其重復(fù)性和穩(wěn)定性。

表1 椿根皮水提物及各質(zhì)量濃度醇提物對(duì)Sau、Eco、沙門氏菌、Pae和Cal的MIC結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，在不同質(zhì)量濃度的椿根皮醇提物抑菌效果的比較中，椿根皮95%醇提物和80%醇提物的抑菌效果更佳；研究表2可以發(fā)現(xiàn)，濃度較高的醇提物其抑菌效果略優(yōu)于濃度較低的椿根皮提取物。因此，可以推斷椿根皮的抑菌部位多為醇溶性成分，而95%醇提物中有效成分純度較高，效果較好；80%醇提物抑菌譜較廣泛，在椿根皮多種質(zhì)量濃度的醇提物中抑菌效果略優(yōu)。但醇提物的乙醇濃度與抑菌效果并非正相關(guān)，這一點(diǎn)在椿根皮醇提物對(duì)Eco和Pae的抑菌效果的表現(xiàn)上尤為突出。本項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，70%椿根皮醇提物對(duì)上述兩個(gè)菌種的抑制效果比80%椿根皮醇提物更為顯著，這可能與70%椿根皮醇提物對(duì)菌種的特殊選擇性有關(guān)，也可能與抑殺Eco的有效成分（如苦木生物堿［13］）在70%乙醇中溶解度較高有關(guān)。

表2 椿根皮水提物及各質(zhì)量濃度醇提物對(duì)Sau、Eco、沙門氏菌、Pae和Cal的抑菌結(jié)果

另外通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)質(zhì)量濃度從1 mg/mL減為0.5 mg/mL時(shí)，椿根皮提取物的抑菌效果下降比其他相鄰濃度差對(duì)抑菌效果的影響更為明顯。因此，在實(shí)驗(yàn)研究影響臨床用藥時(shí)，這一數(shù)據(jù)可以給予藥品開發(fā)者更有意義的研究思路。

椿根皮對(duì)Sau、Eco、Pae和Cal均有抑殺作用，用椿根皮治療陰道炎、子宮頸及內(nèi)膜炎、滴蟲性陰道炎、女陰炎等婦科病及因細(xì)菌感染引起的痔瘡、結(jié)腸炎、久痢久泄、腸風(fēng)便血［14-16］等消化系統(tǒng)疾病有一定科學(xué)依據(jù)。椿根皮醇提物的抑菌效果優(yōu)于水提物，因此在開發(fā)與椿根皮提取物相關(guān)的抑菌產(chǎn)品時(shí)，在椿根皮醇提方法與成分分離方面進(jìn)一步開展研究，可以想見其較廣泛的應(yīng)用前景。但是關(guān)于椿根皮確切的抑菌活性，還有待進(jìn)一步開展體內(nèi)抑菌試驗(yàn)研究加以證實(shí)。