參蒲盆炎顆粒對(duì)苯酚膠漿誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜炎大鼠核因子-κB信號(hào)通路的影響

孫蘭 李家春 宗紹波 王振中

摘要?目的：觀察參蒲盆炎顆粒對(duì)苯酚膠漿致子宮內(nèi)膜炎大鼠模型的影響，探討其抗炎作用機(jī)制。方法：選取SD大鼠60只并隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、參蒲盆炎顆粒高、中、低劑量組（15.0，7.5，3.75 g生藥/kg）和婦科千金膠囊組（5.0 g生藥/kg）。采用苯酚膠漿復(fù)制子宮內(nèi)膜炎大鼠模型，連續(xù)灌胃給藥21 d，比色法測(cè)定大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平，HE染色評(píng)價(jià)大鼠子宮內(nèi)膜的病理變化，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）檢測(cè)子宮組織腫瘤壞死因子（TNF-α）及白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的水平，蛋白免疫印跡法（WB）檢測(cè)子宮組織中核因子-κB（NF-κB）的表達(dá)。結(jié)果：參蒲盆炎顆粒能明顯改善子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增生、變性、壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變;參蒲盆炎顆粒高、中劑量組顯著升高大鼠血清SOD水平及降低MDA水平;參蒲盆炎顆粒顯著降低大鼠子宮組織IL-1β、TNF-α水平及核因子-κB蛋白的磷酸化水平。結(jié)論：參蒲盆炎顆粒對(duì)苯酚膠漿致子宮內(nèi)膜炎大鼠有較好的治療作用，其作用機(jī)制可能與其抑制核因子-κB通路激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞?參蒲盆炎顆粒;子宮內(nèi)膜炎;苯酚膠漿;核因子-κB信號(hào)通路

Abstract?Objective：To observe the effects of Shenpu Penyan Granules on endometritis induced by phenol mucilage and the explore anti-inflammatory mechanism.Methods：A total of 60 female SD rats were randomly divided into a sham operation group，a model group，a Shenpu Penyan Granules high dose group，a medium dose group and a low dose group （15.0，7.5，3.75 crude drugs g/kg） and Fuke Qianjing Capsule （5.0 g/kg）.Rat model of endometritis was copied with phenol glue.After the rats were treated 21 days by intragastric administration，the content of superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） in serum of rats were determined by colorimetry.Pathological changes of endometrium of rates were evaluated by rats.Expressions of NF-kB in uterine tissue were detected by western blotting （WB）.Results：Shenpu Penyan Granules could improve obviously the pathological damage of endometrial epithelial cell proliferation，degeneration，necrosis and inflammatory cell infiltration.Shenpu Penyan Granules high and medium dose group significantly increased the serum SOD content and decreased MDA content.And Shenpu Penyan Granules significantly reduced the content of IL-1β，TNF-a and NF-kB protein phosphorus level in rat uterine tissue.Conclusion：Shenpu Penyan Granules have a good therapeutic effects on phenol-induced endometritis in rats and its mechanism may be related to the inhibition of NF-kB pathway activation.

Keywords?Shenpu Penyan Granules; Endometritis; Phenol mucilage; NF-kB

中圖分類(lèi)號(hào)：R289.5;R711.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.014

子宮內(nèi)膜炎是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)疾病，發(fā)病的原因與子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)發(fā)生的炎性改變相關(guān)，是慢性盆腔炎的一種病理改變[1]。子宮內(nèi)膜炎的臨床表現(xiàn)主要包括腹部疼痛、痛經(jīng)、經(jīng)期血量過(guò)多、不孕等[2]。子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著患者的身心健康[3]。臨床上西醫(yī)常用抗生素和激素治療子宮內(nèi)膜炎，但是抗生素長(zhǎng)期應(yīng)用不良反應(yīng)較多，并且易產(chǎn)生耐藥性[4]。研究表明，中藥治療子宮內(nèi)膜炎有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[5]。參蒲盆炎顆粒是臨床經(jīng)驗(yàn)方，由黨參、虎杖、赤芍、蒲公英等藥物組成，具有活血化瘀，清利濕熱功效，主治腹痛、腹墜脹、腰酸痛、白帶增多、月經(jīng)不調(diào)、盆腔腫塊，慢性盆腔炎見(jiàn)上述證候者。我們觀察參蒲盆炎顆粒對(duì)苯酚膠漿所致大鼠子宮內(nèi)膜炎的治療作用，并探討其抗炎作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動(dòng)物?SD大鼠，SPF級(jí)，180～200 g，雌性，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由飲水和攝食，飼養(yǎng)室溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～65%，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2?藥物?參蒲盆炎顆粒（SPPYG）（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：160901）;婦科千金膠囊（FKQJC）（株洲千金藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：201604015）。

1.1.3?試劑與儀器?水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20161219）;羧甲基纖維素鈉[中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)：20150617];苯酚（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：T20120919）;甘油（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：T20151226）;黃蓍樹(shù)膠粉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：Lot.No.WG20150527）;超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號(hào)：20170525）和丙二醛（MDA）試劑盒（批號(hào)：20170312），購(gòu)于南京建成生物科技有限公司;白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）（批號(hào)：20170629）和腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)：20170612），購(gòu)于南京建成生物科技有限公司;抗NF-κB p65（貨號(hào)：8242）;Phospho-NF-κB p65（Ser536）（貨號(hào)：3033）及GAPDH抗體（貨號(hào)：5174），購(gòu)于美國(guó)CST公司;羊抗兔IgG-HRP（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab6721）。電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，型號(hào)：BSA224S];冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)，型號(hào)：CENTRFUGE5840型）;光學(xué)顯微鏡（德國(guó)萊卡，型號(hào)：DM 1000）;Flexstation3鈣流工作站（Molecular Devices公司，美國(guó)，型號(hào)：FlexStation3）;ChemiDoc+XRS+顯影儀（BIO-RAD公司，美國(guó)，型號(hào)：ChemiDoc+XRS）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?參照文獻(xiàn)[6]，SD大鼠60只，其中50只用于子宮內(nèi)膜炎動(dòng)物模型制作，大鼠用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，腹部備皮消毒后沿腹部正中切口約2 cm，暴露子宮，每只大鼠在左側(cè)子宮注入15%苯酚膠漿0.1 mL，右側(cè)子宮不注射作為自身對(duì)照。另外10只SD大鼠為假手術(shù)組，僅進(jìn)行開(kāi)關(guān)腹手術(shù)操作，不注射苯酚膠漿造模，分層關(guān)腹，消毒術(shù)區(qū)。造模后所有大鼠正常喂養(yǎng)7 d后將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，參蒲盆炎顆粒高、中、低劑量組（15.0，7.5，3.75 g生藥/kg），婦科千金膠囊組（5.0 g生藥/kg）。

1.2.2?給藥方法?各給藥組灌胃給予相應(yīng)劑量藥液或溶媒，灌胃體積均為10 mL/kg，1次/d，連續(xù)21 d。各組大鼠末次灌胃24 h后，10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血5 mL，3 000 r/min，離心半徑15 cm，離心10 min分離血清，脫頸椎處死，取大鼠子宮，一部分10%甲醛溶液固定，供病理檢測(cè)，一部分-80 ℃保存，供炎性反應(yīng)遞質(zhì)及蛋白檢測(cè)。

1.2.3?檢測(cè)指標(biāo)與方法

血清SOD、MDA檢測(cè)：按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清中SOD、MDA水平。

子宮組織炎性反應(yīng)遞質(zhì)檢測(cè)：取凍存的大鼠子宮組織，清除多余脂肪組織，稱(chēng)取適量子宮組織于2 mL EP管中，加入生理鹽水（W/V：1∶9）后于冰上研磨均勻，4 ℃，3 000 r/min，離心半徑15 cm，離心15 min后，分離上清根據(jù)IL-1β、TNF-α檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

子宮組織病理檢測(cè)：左側(cè)子宮用10%甲醛溶液固定，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下進(jìn)行子宮病理組織學(xué)檢查。病理觀察指標(biāo)為：1）子宮腔有無(wú)粘連、閉塞或擴(kuò)張;2）子腔壁結(jié)構(gòu)有無(wú)改變;3）子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞有無(wú)變性壞死;4）子宮壁有無(wú)慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn);5）子宮內(nèi)膜有無(wú)充血水腫。根據(jù)病變由輕到重的程度分別記為0～4分，積分標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)病變記為0分;極輕度記為1分，輕度但病變范圍<1/3記2分;中度病變、范圍在1/3～2/3間記3分;重度病變、范圍在2/3以上者記4分。炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度積分標(biāo)準(zhǔn)為無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)記為0分;極少量記為1分;黏膜固有層有少量記為2分，肌層查見(jiàn)記為3分，全層皆有記為4分。類(lèi)加所有分?jǐn)?shù)，計(jì)算出每組動(dòng)物的均分，分值越高提示盆腔炎病變程度越嚴(yán)重。

子宮組織核因子-κB蛋白檢測(cè)在冰上剪取子宮組織100 mg左右，按照子宮組織：裂解液（裂解液與蛋白酶抑制劑以100∶1的比例混合）=1∶10比例，放入2 mL EP管中，用電動(dòng)勻漿器充分勻漿，勻至無(wú)肉眼可看見(jiàn)的物質(zhì)，14 000 r/min，離心半徑 15?cm，離心10 min，分離上清。用BCA方法進(jìn)行蛋白水平測(cè)定，12% SDS-PAGE分離，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5% BSA封閉2 h，核因子-κB p65、Phospho-核因子-κB p65一抗（1∶1 000）4 ℃封閉過(guò)夜，羊抗兔IgG-HRP二抗（1∶2 000）37 ℃孵育2 h，利用ECL進(jìn)行顯色，拍照保存，用凝膠圖像處理系統(tǒng)自動(dòng)分析目的條帶分子量和灰度值進(jìn)行定量分析。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法?采用Graphpad Prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?參蒲盆炎顆粒對(duì)苯酚膠漿誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜炎大鼠血清SOD、MDA水平影響?與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清SOD水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與模型組比較，婦科千金膠囊、參蒲盆炎顆粒高、中劑量組血清SOD水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清MDA水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與模型組比較，婦科千金膠囊、參蒲盆炎顆粒高、中劑量組血清MDA水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2?參蒲盆炎顆粒對(duì)苯酚膠漿誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜炎大鼠子宮組織炎性反應(yīng)遞質(zhì)的影響?與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮組織IL-1β水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，婦科千金膠囊、參蒲盆炎顆粒高、中劑量組大鼠子宮組織IL-1β水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮組織TNF-α水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，婦科千金膠囊、參蒲盆炎顆粒高、中劑量組、低劑量組大鼠子宮組織TNF-α水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3?參蒲盆炎顆粒對(duì)苯酚膠漿誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜炎大鼠子宮內(nèi)膜病理改變的影響?假手術(shù)組子宮組織結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜上皮細(xì)胞未見(jiàn)變性、壞死，肌層未見(jiàn)增生。模型組大鼠子宮內(nèi)膜上可見(jiàn)上皮細(xì)胞變性壞死，有散在或?qū)訝钚匝准?xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)膜充血水腫。參蒲盆炎顆粒各劑量組子宮內(nèi)膜表面上皮輕度增生、增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。與假手術(shù)組比較，模型組病理綜合評(píng)分顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，婦科千金膠囊、參蒲盆炎顆粒高、中、低劑量組大鼠病理綜合評(píng)分顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）見(jiàn)表3及圖1。

2.4?參蒲盆炎顆粒對(duì)苯酚膠漿誘導(dǎo)大鼠子宮內(nèi)膜炎子宮組織NF-kB蛋白的影響?與正常組假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮組織p-核因子-κB p65蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，婦科千金膠囊、參蒲盆炎顆粒高、中劑量組、低劑量組大鼠子宮組織p-核因子-κB p65蛋白表達(dá)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

3?討論

苯酚膠漿所致大鼠子宮內(nèi)膜炎是慢性盆腔炎的一種病理改變，常用于評(píng)價(jià)中藥防治慢性盆腔炎的療效及機(jī)制[7]。本研究顯示，苯酚膠漿誘導(dǎo)的大鼠慢性子宮內(nèi)膜炎病理主要表現(xiàn)為宮壁宮腔擴(kuò)張或粘連變小，黏膜固有層腺體減少或肌層與黏膜層分界不清，宮壁充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞深達(dá)子宮肌層。參蒲盆炎顆粒應(yīng)用后均有減輕子宮炎性反應(yīng)及宮壁結(jié)構(gòu)紊亂的作用，與模型組比較有顯著性差異。結(jié)果提示，參蒲盆炎顆粒對(duì)苯酚膠漿致大鼠子宮內(nèi)膜炎具有治療作用。

炎性反應(yīng)的損傷與氧自由基密切相關(guān)，SOD具有對(duì)抗機(jī)體氧化損傷作用[8]。在炎性反應(yīng)形成發(fā)展的過(guò)程中，體內(nèi)生成過(guò)多氧自由基，致使SOD活性下降，同時(shí)使線粒體膜受到損傷，此時(shí)，溶酶體釋放出大量的炎性反應(yīng)遞質(zhì)，從而出現(xiàn)了組織的炎性病變及疼痛[9]。本研究結(jié)果顯示，參蒲盆炎顆粒通過(guò)調(diào)節(jié)SOD、MDA水平從而減輕炎性反應(yīng)。并且顯著降低了苯酚膠漿誘發(fā)的大鼠子宮內(nèi)膜炎模型子宮組織IL-1β、TNF-α水平[10]。提示參蒲盆炎顆粒抑制炎性反應(yīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生，從而減輕子宮組織炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)。

核因子-κB信號(hào)通路在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)中起重要作用，能夠誘導(dǎo)一系列細(xì)胞因子和趨化因子的基因的轉(zhuǎn)錄[11]。本研究結(jié)果提示，參蒲盆炎顆?？赡芡ㄟ^(guò)抑制核因子-κB信號(hào)通路的激活而發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，參蒲盆炎顆粒通過(guò)減輕炎細(xì)胞的過(guò)度浸潤(rùn)，調(diào)節(jié)SOD、MDA水平及抑制炎性反應(yīng)遞質(zhì)TNF-α、IL-1β水平，從而抑制炎性反應(yīng)。此外，參蒲盆炎顆粒抑制核因子-κB信號(hào)通路蛋白的磷酸化從而抑制炎性反應(yīng)遞質(zhì)產(chǎn)生和釋放而起抗炎作用。

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（2018-08-30收稿?責(zé)任編輯：張雄杰）