基于多成分藥物代謝的秦艽質(zhì)控成分遴選研究

楊文寧 韓星 楊海洋 李雪巖 劉洋 林瑞超

摘要?目的：基于中藥多成分作用特點(diǎn)，探討秦艽多成分在體內(nèi)的代謝情況，遴選秦艽質(zhì)控成分。方法：制備秦艽水提物，采用相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作手術(shù)，收集秦艽的腸代謝、肝代謝以及綜合代謝樣品，結(jié)合超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-Exactive MS），對(duì)秦艽水提物、腸代謝樣品、肝代謝樣品及綜合代謝樣品中的成分進(jìn)行鑒別，遴選秦艽的質(zhì)控成分。結(jié)果：秦艽水提物中共鑒定出33個(gè)化學(xué)成分，其中有12個(gè)成分在經(jīng)腸代謝樣品中可檢測(cè)到，有9個(gè)成分在先經(jīng)腸代謝后經(jīng)肝代謝樣品中可檢測(cè)到，有11個(gè)成分在經(jīng)灌胃給藥后的綜合代謝樣品中檢測(cè)到。結(jié)論：根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果，遴選出秦艽中9個(gè)可以以原型的形式進(jìn)入血液循環(huán)的成分作為該藥材的質(zhì)控成分，包括馬錢苷酸、secologanoside、6′-O-β-葡萄糖龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、異牡荊素、淫羊藿苷、齊墩果酸，作為秦艽的質(zhì)控成分。

關(guān)鍵詞?秦艽;多成分藥物代謝;質(zhì)控成分;質(zhì)量控制;超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS/MS）

Abstract?Objective：To investigate the metabolism of Radix Gentianae Macrophyllae and to select the quality control components of Radix Gentianae Macrophyllae based on the action features of multicomponent of Chinese medicines.Methods：The water extract of Radix Gentiana Macrophylla was prepared.Corresponding experimental operations was used.Gentiana macrophylla samples were collected for intestinal metabolism，hepatic metabolism and comprehensive metabolism of Radix Gentianae Macrophyllae，combined with ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field high-resolution mass spectrometry（UPLC-Q-Exactive MS）.The components in the water extract，intestinal metabolism sample，liver metabolism sample and comprehensive metabolism sample were identified，and the quality control components of Gentiana macrophylla were selected.Results：A total of 33 chemical constituents were identified in the water extract，of which 12 components could be detected after intestinal metabolism samples，9 components could be detected after intestinal metabolism followed by liver metabolism，and 11 components could be detected in comprehensive metabolic samples after intragastric administration.Conclusion：According to the results of MS data analysis，9 prototypes that can enter the blood circulation in the form of a prototype can be used as the quality control component of the medicinal material，and they were selected as quality control components of Radix Gentiana Macrophylla，including loganic acid，secologanoside，6′-O-β-D-glucosyl-gentiopicroside，swertiamarine，gentiopicroside，sweroside，isovitexin，icariin and oleanolic acid.

Keywords?Radix Gentianae Macrophyllae; Multicomponent drug metabolism; Quality control ingredients; Quality control; UPLC-MS/MS（R）

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.009

秦艽藥材主產(chǎn)于中國西北地區(qū)，為龍膽科植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.、麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.、粗莖秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.和小秦艽Gentiana dahurica Fisch.的干燥根。在2015年版的《中華人民共和國藥典》中，以龍膽苦苷和馬錢苷酸作為秦艽藥材含量測(cè)定的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)[1]。然而，秦艽中含有環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類及三萜類等多類化學(xué)成分[2]，僅僅以這2個(gè)指標(biāo)性成分作為質(zhì)控?zé)o法全面評(píng)定藥材的質(zhì)量。另外，如何篩選藥材中的藥效活性成分，并將其運(yùn)用于中藥材生產(chǎn)和加工等各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)控過程，一直以來是中藥多學(xué)科交叉研究的難題?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為，藥物發(fā)揮藥效的前提在于，藥物能夠透過層層的生物屏障到達(dá)作用靶點(diǎn)[3]。因此，本研究運(yùn)用動(dòng)物在體腸道灌流等精細(xì)的手術(shù)方法結(jié)合精密的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)，全面表征藥材本身和藥材在不同部位血液的成分并將其從時(shí)間和空間維度關(guān)聯(lián)，以系統(tǒng)描繪藥材中化學(xué)成分進(jìn)入人體血液循環(huán)的動(dòng)態(tài)變化，從而獲得藥材的血中移行成分作為中藥質(zhì)控的潛在指標(biāo)性成分。該研究可以為進(jìn)一步提升秦艽藥材的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供可靠的依據(jù)，也可以為藥材后期的藥理研究和臨床運(yùn)用提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動(dòng)物?SD雄性大鼠，SPF級(jí)，質(zhì)量約200～250 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0002，并已通過北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理部的倫理審批。實(shí)驗(yàn)前將大鼠置于晝夜節(jié)律光照條件下，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.1.2?藥物?秦艽藥材采集于青海省互助縣和湟中縣，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王晶娟副教授鑒定為麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.的干燥根。馬錢苷酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111865-201704），異牡荊素對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y07J8H39516），齊墩果酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110709-201808），龍膽苦苷對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y30J9Q66926），淫羊藿苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110737-201516），異葒草苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111974-201401），獐牙菜苦苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110785-201404），獐牙菜苷對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：P29N8F49264）。

1.1.3?試劑與儀器?固相萃取柱（美國Waters公司，型號(hào)：OASIS PRIME HLB Cartridge），娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20190519），甲醇（賽默飛世爾科技有限公司，批號(hào)：193728），乙腈（賽默飛世爾科技有限公司，批號(hào)：186350）為色譜級(jí)，其余試劑均為分析純。超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（賽默飛世爾科技公司，美國，型號(hào)：UltiMate 3000-Q-Orbitrap），包括UltiMate 3000超高效液相色譜儀、Q-Exactive四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、DAD檢測(cè)器、Xcalibur質(zhì)譜工作站;電子分析天平（Sartorius公司，德國，型號(hào)：BSA2202S）;電子分析天平（Sartorius公司，德國，型號(hào)：BSA124S）;超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ5200E）;電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司，型號(hào)：HH-2A）;高速離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：BY-400C）;水浴氮吹儀（北京成萌偉業(yè)科技有限公司，型號(hào)：CM-12）;蠕動(dòng)泵（保定蘭格恒流泵有限公司，型號(hào)：BT-100-1F）。

1.2?方法

1.2.1?分組?將大鼠分為腸代謝手術(shù)組、肝代謝手術(shù)組與綜合代謝手術(shù)組。

1.2.2?給藥方法?1）秦艽水提液制備：稱取秦艽藥材1.02 g，加入100 mL蒸餾水回流1 h，過0.22 μm濾膜過濾，棄去初濾液，即得。2）腸代謝手術(shù)組：取4只禁食12 h大鼠（不禁水），腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈采血置于預(yù)先涂抹肝素鈉的離心管中。收集的血液置于37 ℃水浴中，用于補(bǔ)充手術(shù)鼠實(shí)驗(yàn)過程中損失的血液。另取一只同樣禁食大鼠腹腔麻醉，小心剖離頸靜脈，插管。管的另一端通過蠕動(dòng)泵連接到剛剛?cè)〕龅难褐小Ｑ馗怪芯€剪開腹腔，選取空腸段約10 cm作為供試腸段，結(jié)扎實(shí)驗(yàn)用腸段以外的血管。37 ℃生理鹽水緩慢沖出腸內(nèi)容物，至流出液澄清，繼續(xù)充入空氣將生理鹽水排凈。注射泵與腸段進(jìn)口端相連，灌流（0.2 mL/min）一定量秦艽水提液（1 g/mL）。用37 ℃生理鹽水潤濕的紗布覆蓋在裸露腸段上，保溫?zé)艏訜?。結(jié)扎肝門靜脈及旁支有干擾的細(xì)血管，同時(shí)開啟蠕動(dòng)泵，進(jìn)行頸靜脈輸血（流速0.3 mL/min），腸系膜靜脈采血。連續(xù)采血2 h，平行操作3組?？瞻捉M給藥生理鹽水，其余操作相同。3）肝代謝手術(shù)組：不結(jié)扎肝門靜脈，在股靜脈處采血，其余操作同“腸代謝手術(shù)組”。4）綜合代謝手術(shù)組：選取12只SD大鼠，將大鼠隨機(jī)分為4組，每3只為1組，灌胃給與秦艽水提液（1 g/mL），各組分別于0.5 h、1 h、1.5 h、2 h用10%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉處理，于腹主動(dòng)脈處采集血液樣品?？瞻捉M灌胃給與等量生理鹽水，其余操作相同。

1.2.3?檢測(cè)指標(biāo)與方法?1）對(duì)照品溶液制備：分別精密稱取上述8個(gè)對(duì)照品適量，加適量甲醇完全溶解后稀釋至濃度約為10 ng/mL，0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液即得各化合物的對(duì)照品溶液。2）血漿樣品前處理：1.5 mL血漿樣品+1.5 mL 4 %磷酸，渦旋1 min，放置5 min后3 mL全部上樣固相萃取柱，接收的流出液標(biāo)為1;再用5%甲醇1 mL進(jìn)行清洗，接收流出液標(biāo)為2;最后用90：10的乙腈：甲醇1 mL進(jìn)行洗脫，用另一個(gè)離心管接收流出液并標(biāo)為3;在洗脫過程中盡量降低流速使其成滴流下，將洗脫液3過0.22 μm濾膜，進(jìn)行LC-MS分析?？瞻籽獫{處理方法除將1.5 mL血漿樣品換成1.5 mL空白血漿外，其余操作步驟一致。3）測(cè)定條件：液相條件：色譜柱：CORTECS UPLC T3（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）;流速：0.3 mL/min;流動(dòng)相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min，95%→95% A;1～20 min，95%→5% A;20～21 min，5%→5% A;21～21.1 min，5%→95% A;21.1～22 min，95%→95% A）;進(jìn)樣體積：2 μL;檢測(cè)波長：190～400 nm（DAD檢測(cè)器）;柱溫：40 ℃;質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（HESI源）;正、負(fù)離子檢測(cè)模式;掃描范圍：100～1 500 Da;噴霧電壓：+3.5 kV（正離子模式），+3.0 kV（負(fù)離子模式）;鞘氣體積流量：35 arb;輔助氣體積流量：10 arb;輔助氣溫度：250 ℃;離子傳輸管溫度：300 ℃;掃描模式：Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS分辨率為70 000，dd-MS2分辨率為17 500;碰撞能為：20、30、40 eV。4）數(shù)據(jù)處理及代謝物鑒定：通過精確相對(duì)分子質(zhì)量及二級(jí)碎片離子信息，與對(duì)照品的保留時(shí)間、mzVault 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫、HMDB數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)比對(duì)，對(duì)秦艽水提液及代謝樣品中的成分進(jìn)行鑒定。

2?結(jié)果

2.1?秦艽水提液中化學(xué)成分鑒定

秦艽水提液的總離子流圖（TIC圖）見圖1，共鑒定出33個(gè)化學(xué)成分，其中3個(gè)有機(jī)酸類成分、3個(gè)黃酮類化合物、1個(gè)香豆素類化合物、1個(gè)木脂素類化合物、1個(gè)三萜類化合物、17個(gè)環(huán)烯醚萜類化合物和7個(gè)其他類化合物，結(jié)果見表1，具體分析如下：

化合物1?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 299.077 3[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C13H16O8（Error in ppm為3.866），其二級(jí)碎片離子有m/z 137和m/z 93，通過與HMDB數(shù)據(jù)庫中圖進(jìn)行比較，推測(cè)化合物1為4-{hydroxy[（3，4，5，6-tetrahydroxyoxan-2-yl）methoxy]methylidene}cyclohexa-2，5-dien-1-one。

化合物2?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 199.060 6[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C9H12O5（Error in ppm為2.512），有二級(jí)碎片離子m/z 181[M-H-H2O]-，m/z 155[M-H-CO2]-，通過與HMDB數(shù)據(jù)庫中圖譜進(jìn)行比較，推測(cè)該化合物為（Z）-3-（1-formyl-1-propenyl）pentanedioic acid。

化合物3?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 315.072 3[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C13H16O9（Error in ppm為3.941），二級(jí)碎片離子有m/z 153[M-H-162]-，m/z 109[M-H-162-CO2]-，通過與文獻(xiàn)[4]對(duì)比推測(cè)該化合物為5-（β-D-glucopyranosyl）-2-hydroxybenzoic acid。

化合物4?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 503.141 1[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C21H28O14（Error in ppm為3.117），m/z 179[M-H-C15H17O8]-，m/z 161[M-H-C15H17O8-H2O]-，通過與HMDB數(shù)據(jù)庫中圖譜進(jìn)行比較，推測(cè)該化合物為6-caffeoylsucrose。

化合物5?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 519.172 2[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C22H32O14（Error in ppm為2.597），其二級(jí)碎片離子有m/z 179、m/z 89、m/z 59，與文獻(xiàn)[4]給出的碎片離子相同，推測(cè)該化合物5為紫藥苦苷。

化合物6?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 405.016 5[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C17H26O11（Error in ppm為-0.094），其二級(jí)碎片離子有m/z 119、m/z 113、m/z 89、m/z 71、m/z 59，與文獻(xiàn)報(bào)道[5]的碎片離子相同，故推測(cè)化合物6為山梔苷甲酯。

化合物7?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 215.093 1[M+H]+，軟件給出的精確分子式為C15H14O5（Error in ppm為-0.791），其二級(jí)碎片離子有m/z 179[M+H-2H2O]+，m/z 151[M+H-2H2O-CO]+，m/z 133，根據(jù)與文獻(xiàn)[6]對(duì)比推測(cè)該化合物為1-（4-羥基-3-甲氧基）-苯基-1，2，3-丙三醇或其異構(gòu)體。

化合物8?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 211.060 1[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C10H12O5（Error in ppm為0），其二級(jí)碎片離子有m/z 193[M-H-H2O]-，m/z 149[M-H-H2O-CO2]-，m/z 93[M-H-H2O-C4H7O2]-，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[7]，推測(cè)該化合物為龍膽內(nèi)酯。

化合物9?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 373.112 9[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C12H22O10（Error in ppm為-0.062），其二級(jí)特征碎片有丟失葡萄糖殘基形成的 m/z 210.93[M-H-C6H11O5]-和繼續(xù)丟失羧基上的一分子羥基形成的m/z 193[M-H-C6H11O5-H2O]-，推測(cè)該化合物為斷馬錢子酸[8]。

化合物10和12為同分異構(gòu)體，一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰均為m/z 537.183 2[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C22H34O15（Error in ppm為3.301）?；衔?0的二級(jí)碎片離子有m/z 213、m/z 169、m/z 113、m/z 101，與文獻(xiàn)報(bào)道[24]的碎片離子相同，故推測(cè)化合物10為loganic acid 11-O-β-glucopyranosyl ester?；衔?2的碎片離子有m/z 375和m/z 213，通過與文獻(xiàn)[5]比較推測(cè)化合物12為6′-O-β-D-glucopyranosyl loganic acid。

化合物11?保留時(shí)間為4.44 min，一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 357.1297[M-H]-，其二級(jí)特征碎片有丟失葡萄糖基的m/z 213[M-H-C6H11O5]-和m/z 169[M-H-C6H11O5-CO2]-。通過與馬錢苷酸對(duì)照品保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)比，確定該化合物為馬錢苷酸。

化合物13?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 405.106 5[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C17H26O11（Error in ppm為3.066），其二級(jí)碎片離子有m/z 155、m/z 141、m/z 119、m/z 113、m/z 101，與文獻(xiàn)[4]報(bào)道的碎片離子相同，故推測(cè)化合物13為莫諾苷。

化合物14?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 301.091 4[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C13H18O8（Error in ppm為-1.308），其二級(jí)碎片離子有m/z 139[M-H-162]-，為丟失一分子葡萄糖基形成的碎片離子，m/z 139[M-H-162-CH3]-為丟失一分子葡萄糖基和甲基后的碎片離子，根據(jù)文獻(xiàn)[9]推測(cè)該化合物為isotachioside。

化合物15?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 293.124 5[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C12H22O8（Error in ppm為4.796），有丟失一分子葡萄糖基后產(chǎn)生的碎片離子m/z 131[M-H-162]-和丟失一分子葡萄糖基又丟失一分子H2O的碎片離子m/z 131[M-H-162-H2O]-，根據(jù)文獻(xiàn)[9]推測(cè)該化合物為2-O-glucosyl-hexanoic acid。

化合物16?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 389.103 9[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C16H21O11（Error in ppm為3.758），二級(jí)特征碎片離子有m/z 165和m/z 121，根據(jù)文獻(xiàn)[5]推測(cè)該化合物為secologanoside。

化合物17?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 211.060 0[M+H]+，軟件給出的精確分子式為C11H16O4（Error in ppm為0.069），二級(jí)特征碎片離子有m/z 151和m/z 109，根據(jù)文獻(xiàn)[10]推測(cè)該化合物為swerimilegenin I。

化合物18?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 193.049 5[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C10H8O4（Error in ppm為-0.183），其二級(jí)碎片離子有m/z 175、m/z 165、m/z 161、m/z 151、m/z 133，與文獻(xiàn)報(bào)道[5]的碎片離子相同，故推測(cè)化合物18為東莨菪素。

化合物19?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 563.161 8[M+HCOO]-，通過與對(duì)照品的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)比較確定該化合物為6′-O-β-葡萄糖龍膽苦苷。

化合物20?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 341.123 4[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C16H22O8（Error in ppm為-0.183），二級(jí)碎片離子有丟失一分子葡萄糖基的碎片離子m/z 179[M-H-162]-和丟失一分子葡萄糖基與一分子H2O的碎片離子m/z 161[M-H-162-H2O]-，根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]推測(cè)該化合物為松柏苷。

化合物21?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 419.119 7[M+HCOO]-，通過與對(duì)照品的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)比較確定該化合物為獐牙菜苦苷。

化合物22?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 169.013 5[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C9H14O3（Error in ppm為1.829），二級(jí)特征碎片離子有m/z 123[M-H-C3H11]-、m/z 95[M-H-C4H11O]-和m/z 57，根據(jù)文獻(xiàn)[4]推測(cè)該化合物為isoboonein。

化合物23?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 355.082 7[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C16H20O9（Error in ppm為-0.165），二級(jí)特征碎片離子為丟失一分子葡萄糖基后的苷元m/z 193[M-H-162]-和丟失一分子羧基與葡萄糖殘基的碎片離子m/z 193[M-H-162-CO2]-，由于gentiananosides B與葡萄糖基團(tuán)有2個(gè)鍵連接，其苷元只有一個(gè)雙鍵，根據(jù)二級(jí)碎片裂解規(guī)律和文獻(xiàn)[5]推測(cè)該化合物為gentiananosides B。

化合物24?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 211.060 0[M+H]+，軟件給出的精確分子式為C16H20O9（Error in ppm為-0.864），特征二級(jí)碎片離子有m/z 195[M+H-162]+、m/z 177[M+H-162-H2O]+、m/z 149[M+H-162-H2O-CO]+，經(jīng)過與mzVault 2.0質(zhì)譜庫進(jìn)行對(duì)比確定該化合物為龍膽苦苷。

化合物25?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 403.124 6[M+HCOO]-，通過與對(duì)照品的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)比較確定該化合物為獐牙菜苷。

化合物26?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 417.083 1[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C18H25O11（Error in ppm為-3.975），二級(jí)碎片離子有m/z 357、m/z 255、m/z 211，根據(jù)文獻(xiàn)[5]分析推測(cè)該化合物為gentiananosides D。

化合物27?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 477.093 6[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C21H20O11（Error in ppm為3.159），特征二級(jí)碎片離子m/z 477.093 6[M-H-162]-，通過與對(duì)照品的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，確定該化合物為異葒草苷。

化合物28?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 431.098 3[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C21H20O10（Error in ppm為4.493），二級(jí)特征碎片離子有m/z 341[M-H-C3H6O3]-，m/z 283[M-H-C3H6O3-C2H4O2]-，m/z 341[M-H-C6H5O-CO2]-，通過與對(duì)照品比較確定化合物28為異牡荊素。

化合物29?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 519.171 6[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C26H31O11（Error in ppm為0.023），二級(jí)特征碎片離子有m/z 357[M-H-162]-，根據(jù)文獻(xiàn)[4]推測(cè)該化合物為6′-O-β-D-葡萄糖基獐牙苷。

化合物30?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 417.083 1[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C22H25O8（Error in ppm為4.736），二級(jí)特征碎片離子有m/z 402[M-H-CH3]-、m/z 181[M-H-C13H16O4]-，根據(jù)二級(jí)碎片裂解規(guī)律和文獻(xiàn)分析[5]推測(cè)該化合物為syringaresinol。

化合物31?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 875.299 5[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C40H43O22（Error in ppm為-0.056），二級(jí)特征碎片離子有m/z 315，通過與文獻(xiàn)[5]比較推測(cè)該化合物為大葉苷A。

化合物32?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 721.235 4[M+HCOO]-，軟件給出的精確分子式為C40H43O22（Error in ppm為-0.056），通過與對(duì)照品的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)比確定化合物32為淫羊藿苷。

化合物33?一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰為m/z 455.355 3[M-H]-，軟件給出的精確分子式為C33H40O15（Error in ppm為2.192），通過與對(duì)照品的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)比確定化合物32為齊墩果酸。

2.2?秦艽代謝成分鑒定

通過對(duì)各血漿樣品進(jìn)行LC-MS分析，并與水提物中化學(xué)成分對(duì)比，可獲得各血液樣本中的原型成分，結(jié)果見表2。1-（4-羥基-3-甲氧基）-苯基-1，2，3-丙三醇或其異構(gòu)體、莫諾苷、isotachioside和2-O-glucosyl-hexanoic acid經(jīng)過腸道后可以檢測(cè)到，但在經(jīng)肝臟代謝后的血漿中沒有發(fā)現(xiàn)這些成分，推測(cè)其可能被腸壁吸收后在肝臟中被代謝;齊墩果酸經(jīng)過到后未檢測(cè)到，后經(jīng)過肝臟又重新出現(xiàn)，其在綜合代謝的血液樣本中也可以檢測(cè)到，說明其經(jīng)過腸道被代謝，后經(jīng)過肝代謝重新生成。isoboonein在灌流方法的血液樣本中未檢測(cè)到，但在綜合代謝的樣本中可以檢測(cè)到，說明其存在通過胃黏膜吸收的可能，這也是灌流方法存在的一個(gè)重大缺陷。藥典中的秦艽指標(biāo)成分馬錢苷酸和龍膽苦苷在所有的血液樣本中均能檢測(cè)到，說明這2個(gè)化合物吸收較好，性質(zhì)較穩(wěn)定。如表2所示，由于肝代謝后的9個(gè)成分均可以在綜合代謝的樣品中檢測(cè)到，說明這9個(gè)成分出現(xiàn)在人體血中血液循環(huán)的可能性較高，是潛在的藥效成分，因此可以將這9個(gè)成分作為秦艽質(zhì)量控制的候選指標(biāo)性成分。

3?討論

本研究基于中藥傳統(tǒng)湯劑口服用藥的特點(diǎn)，運(yùn)用腸道灌流并行血液灌流的方法模擬并獲得了中藥在不同時(shí)間點(diǎn)和不同的代謝位點(diǎn)（空間）的多成分組成，并系統(tǒng)展示了藥材提取物的多成分動(dòng)態(tài)變化輪廓。通過表2分析可知，共有9個(gè)原型成分可以在肝代謝后的血液中檢測(cè)到，說明這些成分可以進(jìn)入人體的血液循環(huán)，是潛在的發(fā)揮藥效作用的成分，可以初步作為秦艽藥材質(zhì)控的指標(biāo)性成分。當(dāng)然，藥物在血中的移行成分除了原型成分外，還有其代謝物，由于其鑒定工作量大，含量較低，該研究暫不考慮。另外，就藥材質(zhì)控成分遴選而言，藥材成分的代謝物不便于在藥材中直接追溯，無法將其作為質(zhì)控成分。同時(shí)，為了克服傳統(tǒng)血漿樣品溶劑萃取法的缺陷并盡可能富集血漿中各種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)類型的成分，我們借助SPE柱對(duì)中藥血漿樣品中的多成分進(jìn)行檢測(cè)。該技術(shù)的最大特點(diǎn)如下：1）該方法對(duì)于血中基質(zhì)成分去除效果極其明顯，可以最大限度減少基質(zhì)效應(yīng)的影響;2）該方法可以針對(duì)不同化學(xué)成分的極性，分別收集不同洗脫部位的流份;3）該方法可以針對(duì)擬處理的化學(xué)成分酸堿性不同而采用不同類型的SPE柱，從而達(dá)到更優(yōu)的血漿成分富集的效果;4）該方法不僅可以去除血中蛋白、基質(zhì)等影響，而且可以達(dá)到濃縮目標(biāo)分析物的作用，從而提高檢測(cè)的靈敏度。綜上所述，該研究可以為中藥或中藥復(fù)方質(zhì)控成分的遴選提供一套切實(shí)可行的研究方法。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：270-271.

[2]趙偉剛.小秦艽花化學(xué)成分及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，2019.

[3]李川.中藥多成分藥代動(dòng)力學(xué)研究：思路與方法[J].中國中藥雜志，2017，42（4）：607-617.

[4]陳俊可，曾銳.基于UPLC-ESI-HRMS～n的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)粗莖秦艽不同部位化學(xué)成分研究[J].中草藥，2018，49（10）：2328-2335.

[5]王長生，董紅嬌，包雅婷，等.UPLC-Q-Exactive四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用快速分析粗莖秦艽化學(xué)成分[J].中草藥，2016，47（18）：3175-3180.

[6]朱廣偉，李西文，李琦，等.基于傳統(tǒng)煎藥工藝的龍膽飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)方法研究[J].中草藥，2017，48（20）：4253-4260.

[7]Tan RX，Wolfender JL，Zhang LX，et al.Acylsecoiridoids and antifungal constituents from Gentiana macrophylla[J].Phytochemistry，1996，42（5）：1305-1313.

[8]Xu M，Zhang M，Zhang YJ，et al.New acylated secoiridoid glucosides from Gentiana straminea（Gentianaceae）[J].Helv Chim Acta，2009，92（2）：321-327.

[9]Li S，Wan C，He L，et al.Rapid identification and quantitative analysis of chemical constituents of，Gentiana veitchiorum，by UHPLC-PDA-QTOF-MS[J].Rev Bras Farmacogn，2017，27（2）：188-194.

[10]He YM，Zhu S，Ge YW，et al.Secoiridoid glycosides from the root of Gentiana crassicaulis with inhibitory effects against LPS-induced NO and IL-6 production in RAW264 macrophages[J].J Nat Med，2015，69（3）：366-374.

（2020-06-10收稿?責(zé)任編輯：徐穎）