基于蛋白質組學技術測定全蝎中β-肌動蛋白的含量

梁瑞強 孫姍姍 曹進 康帥 林瑞超 鄒迪新

摘要?目的：通過蛋白質組學技術手段找到適用于藥材全蝎含量測定的目標蛋白質及其特征肽段，用該特征肽段形成定量方法。方法：全蝎粉碎后經PBS緩沖溶液超聲提取并過濾后，得到藥材的蛋白質提取溶液。上述溶液經胰蛋白酶酶解后通過高分辨質譜進行分析，確定待測的目標蛋白質（β-肌動蛋白）和與之對應的特征肽段（IIAPPER），并進行特征肽段及其同位素內標物（IIA*（13C3，15N）PPER）的合成。用得到特征肽段做對照品，同位素內標物做內標進行含量測定。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸溶液（V/V）-水和乙腈，梯度洗脫。質譜使用電噴霧離子源（ESI）正離子模式，采用多反應監(jiān)測模式（MRM）進行信號采集。定量方法為內標法。結果：β-肌動蛋白的特征肽段在0.1～40 nmol/L濃度范圍內線性良好，相關系數（r2）在0.999以上。方法檢出限為0.04 mg/kg，定量限為0.13 mg/kg。加標回收率在87%～93%，重復性的RSD為5.2%，中間精密度的RSD為4.8%，供試品溶液在4 h內穩(wěn)定。利用該方法對來自不同產地的37批次全蝎藥材中的β-肌動蛋白進行含量測定，結果在4.66～100.26 mg/kg之間。結論：該方法靈敏度高，準確度較好和重復性較穩(wěn)定，可以為全蝎藥材藥材的質量控制提供一種有效的手段。

關鍵詞?全蝎;超高效液相色譜串聯質譜法;蛋白質組學;β-肌動蛋白;含量測定;質量控制

Abstract?Objective：To find the target protein and its characteristic peptides suitable for the determination of the whole scorpion of medicinal materials by means of proteomics，and to use this characteristic peptide to form a quantitative method.Methods：After the whole scorpion was crushed，it was ultrasonically extracted with PBS buffer solution and filtered to obtain the protein extract solution of the medicinal material.The above solution was analyzed by high-resolution mass spectrometry after trypsin digestion to determine the target protein to be tested（β-actin）and the corresponding characteristic peptide（IIAPPER），and the characteristic peptide and its isotope internal standard synthesis（IIA*（13C3，15N）PPER）.The obtained characteristic peptide was used as a reference substance，and the isotopic internal standard was used as an internal standard for content determination.The column was Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），the mobile phase was 0.1% formic acid solution（V/V）-water and acetonitrile，and the gradient eluted.Mass spectrometry used the electrospray source ion（ESI）positive ion mode and the multi-reaction monitoring mode（MRM）for signal acquisition.The quantitative method was the internal standard method.Results：The characteristic peptide of β-actin was well linear in the concentration range of 0.1-40 nmol/L，and the correlation coefficient（r2）was above 0.999.The detection limit of the method was 0.04 mg/kg，and the limit of quantification was 0.13 mg/kg.The recovery rate of spiked standard was 87%-93%，and the repeatable RSD is 5.2%.The intermediate precision RSD was 4.8%，and the test solution was stable within 4 h.Using this method，the content of β-actin in 37 batches of whole scorpion medicinal materials from different origins was determined，and the result was between 4.66-100.26 mg/kg.Conclusion：The method has high sensitivity，good accuracy and stable repeatability，and can provide an effective method for the quality control of the whole scorpion medicinal materials.

Keywords?Whole scorpion; UPLC-MS; Proteomics; β-actin; Content determination; Quality Control

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.002

全蝎為東亞鉗蝎Buthus martensii Karsch的干燥體，生物學分類屬于節(jié)肢動物門蛛形綱蝎目鉗蝎科，作為平肝熄風的常用藥材之一，多被用于中醫(yī)臨床治療痙攣抽搐、瘡瘍中毒、瘰疬結核、風濕頑痹和頑固性偏正頭痛等疾病，同時具有抗凝血、抗腫瘤、抗癲癇和抗菌等藥理作用[1-5]。全蝎作為藥用始于五代的《蜀本草》，稱之為“主簿蟲”“蛜蟲祁”[6]。在《中華人民共和國藥典》2015年版一部中以“全蝎”為正名，目前該藥材的定質量標準主要由性狀、顯微鑒別、黃曲霉毒素檢查項、浸出物組成[7]。這些檢測項目雖然在一定程度上能反映全蝎藥材的質量，但整體內容相對簡單。為更好地控制全蝎的質量，保障臨床用藥的安全性和有效性，有必要針對該藥材的特點對其質量標準進行完善和提升。

全蝎作為由動物干燥體入藥的藥材，本身含有較多的蛋白質。其功效成分之一的蝎毒也包括蛋白質和非蛋白質2個組成部分[8]。通過測定具有一定代表性的蛋白質的含量，可以在一定程度上反映全蝎的質量。而針對蛋白質的檢測方法中，與依賴于抗體技術的酶聯免疫吸附（ELISA）等方法相比，質譜技術不僅可以通過不同離子間的質荷比（m/z）差異來分離并確定其相對分子質量且可以同時鑒定多種蛋白質，具有高靈敏度、高準確度、易自動化、專屬性強等優(yōu)點，故而成為該研究的熱門方向之一[9]。將蛋白質酶解成不同長度的多肽進行質譜分析可以同時實現蛋白質鑒定與定量的需求[9-10]。

本研究基于蛋白質組學技術，使用經高分辨質譜篩選出的全蝎的生物標志物（特征肽段），使用該特征肽段作為對照品來形成在超高液相色譜串聯三重四級桿質譜上的含量測定檢測方法，并用特征肽段的合成同位素內標肽段為內標物，進行內標法定量。由于篩選后的特征肽段的摩爾濃度在數值上等于β-肌動蛋白質的摩爾濃度，根據公式：樣品蛋白質的含量（m/m）=特征肽段的物質的量×蛋白質的分子量/樣品取樣量，可以計算出全蝎藥材中β-肌動蛋白的含量。該方法可以用于全蝎藥材的含量測定方法，為完善全蝎質量標準提供了一種可行的技術手段。

1?儀器與試藥

1.1?儀器

高分辨質譜儀（美國Thermo Scientific公司，型號：Q-Extractive plus Orbitrap，配有美國Thermo Scientific公司的Dionex Ultimate 3000 RSLC納流系統(tǒng)，并配有美國New Objective公司的DPV550 digital picoVIEW nanospray離子源）;超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜儀（美國Waters公司，型號：UPLC-Xevo TQ-S）;移液槍（德國Eppendorf公司，量程分別為10～100 μL、l00～1 000 μL和1～10 mL）;超純水器（德國Sartorius stedim公司，型號：H2Opro-DI-B）;分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，型號：AL204）;分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，型號：XP205）;超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-700DE）;恒溫水浴搖床（上海智城分析儀器制造有限公司，型號：ZWF-110X30）;渦旋振蕩混合器（美國Scientific Industries公司，型號：VORTEX-GENIE 2）;離心機（日本HITACHI公司，型號：CF16RXⅡ）;離心機（美國Thermo Scientific公司，型號：SORVALL Legend MICRO 21 R）;C18毛細管柱（美國New Objective公司，75 μm×15 cm，3 μm）;AcclaimTM PepMapTM 100 Trap C18柱（美國Thermo Scientific公司，100 μm×2 cm，5 μm，100 ）;ACQUITY UPLC HSS T3親水柱（美國Waters公司，2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。

1.2?試劑

β-肌動蛋白特征肽段IIAPPER（4.3 mg，HPLC純度≥98.37%，M分子量=794.96 g/mol）（上海吉爾生化有限公司，批號：P190422-TL715280）;β-肌動蛋白特征肽段內標IIA*（13C3，15N）PPER（4.5 mg，HPLC純度≥98.63%%，M分子量=799.02 g/mol，A*（13C3，15N）為同位素標記丙氨酸）（上海吉爾生化有限公司，批號：P190828-MJ745241）;甲酸（美國Sigma-Aldrich公司，質譜級，批號：BCBR6503V）;乙腈（美國Fisher Scientific公司，質譜級，批號：194036）;PBS片劑（北京索萊寶科技有限公司，批號：121D035，臨用時取1片加入100 mL水中，超聲溶解后得到PBS緩沖溶液）;胰蛋白酶（美國Thermo Scientific公司，質譜級，批號：UA278568）;實驗用水均由超純水器（Sartorius stedim，型號：H2Opro-DI-B）制備，電阻率為18.2 M·cm。

1.3?分析樣品

本實驗使用的37批全蝎藥材采購于中藥材公司、藥店或由制藥公司提供，經中國食品藥品檢定研究院康帥副研究員鑒定為鉗蝎科動物東亞鉗蝎Buthus martensii Karsch的干燥體，見表8，其中HB、HN、SX、SD、LN分別代表產地為河北、河南、山西、山東、遼寧，BC代表由步長制藥提供。

2?方法與結果

2.1?色譜質譜條件

色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）;柱溫：30 ℃;樣品室溫度：10 ℃;分析時間：11 min;流量：0.3 mL/min;進樣量5 μL。流動相A為0.1%甲酸（V∶V）-水溶液，B為乙腈。梯度洗脫：0～1.0 min，5%B;1.0～7.0 min，5%B～90%B;7.0～7.1 min，90%B～100%B;7.1～9.0 min，100%B;9.0～9.1 min，100%B～5%B;9.1～11.0 min，5%B。

質譜條件：電噴霧離子源;正離子掃描模式;多反應監(jiān)測（MRM）模式;毛細管電壓3.5 kV，錐孔電壓10 V，偏轉電壓50 V;脫溶劑氣溫度500 ℃;離子源溫度150 ℃;錐孔氣流量150 L/h，脫溶劑氣流量800 L/h。

使用UPLC-Xevo TQ-S質譜的IntelliStart技術自動優(yōu)化MRM通道，確定了特征肽段和同位素內標物的最佳質譜條件。見表1。

2.2?對照品溶液的制備

根據標準特征肽段的純度和相對分子質量計算稱樣量，公式為n=mM，其中n為標準肽段的物質的量（mmol），m為稱樣量（mg），M為相對分子質量（g/mol）。精確稱取適量的特征肽段IIAPPER和同位素內標IIA*（13C3，15N）PPER后，分別用PBS緩沖溶液溶解，用水稀釋，得到標準曲線工作溶液濃度分別為0.1 nmol/L、1.0 nmol/L、5.0 nmol/L、10.0 nmol/L、20.0 nmol/L和40 nmol/L，標準曲線工作溶液中同時含有內標濃度為20 nmol/L。

2.3?供試品溶液的制備

全蝎藥材經粉碎混勻，過三號篩，取藥材粉末約0.1 g，精密稱定，置10 mL納氏比色管中，精密加入10 mL PBS緩沖溶液，密塞，稱定重量，水浴提取30 min。放冷后，再稱定重量，用上述PBS緩沖溶液補足減失的重量，溶液于10 000 r/min，離心半徑10.7 cm，離心5 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾。

酶解：精密量取上述濾液200 μL至1.5 mL EP管中，加入10 μg胰蛋白酶，加入0.1 mL 200 nmol/L內標溶液，渦旋混勻，于37 ℃反應6 h，加入10 μL甲酸終止反應，補加水至1.0 mL，10 000 r/min，離心半徑8.6 cm，離心5 min，上清液供分析用。

2.4?專屬性試驗

精密量取用于藥材提取的PBS緩沖液200 μL至1.5 mL EP管中，按2.3中酶解步驟進行處理（不添加內標溶液）得到方法空白溶液，進樣分析。同時采集了對照品溶液（IIAPPER 5 nmol/L，IIA*（13C3，15N）PPER 20 nmol/L）和供試品溶液的圖譜。結果表明，對照品溶液和供試品溶液中特征肽段和同位素內標均在3 min內出現相同保留時間的色譜峰，峰形符合定量要求且分離度良好，同時方法空白溶液在相同保留時間處未見色譜峰，故認為無干擾。對照品、供試品和方法空白的MRM、TIC譜圖見圖1～3。

2.5?線性關系考察

用特征肽段外標的物質的量濃度與同位素內標的物質的量濃度的比值為橫坐標（X軸），特征肽段外標的峰面積與同位素內標峰面積的比值為縱坐標（Y軸），得到特征肽段的標準曲線方程Y=0.546 601X+0.005 914 11，相關系數r2=0.999 974（n=6），標準曲線見圖4。表明特征肽段在0.1～40 nmol/L的3個數量級范圍呈現良好的線性關系（r2>0.999）。

2.6?中間精密度試驗

對同一全蝎藥材粉末按照2.3的步驟在不同日期制備的5份供試品溶液進行檢測，得到5次測定結果的RSD為4.8%，結果表明方法的精密度良好。見表2。

2.7?供試品溶液穩(wěn)定性試驗

稱取3份同一全蝎藥材粉末，按照2.3的步驟制備供試品溶液，于室溫放置，分別在0 h，2 h，4 h，8 h，10 h，12 h進樣測定含量，考察提取溶液的穩(wěn)定性，結果見圖5。在12 h內檢測結果的RSD為3.3%，通過單因素ANOVA分析和兩兩比較（S-N-K），可知供試品溶液在4 h內穩(wěn)定（P=0.075）。

2.8?重復性試驗

平行稱取同一全蝎藥材粉末6份，按照2.3的步驟制備供試品溶液進行分析，得到6次測定結果的RSD為5.2%，說明該方法的重復性較好。見表3。

2.9?回收率試驗

由于來源于全蝎的β-肌動蛋白目前沒有市售的高純度標準品，所以無法通過向樣品中添加標準蛋白的方法考察回收率，因此本次實驗考察了方法的酶解回收率。具體操作方法為，選取經測定對應酶解溶液中特征肽段濃度為5.217 nmol/L的全蝎藥材提取溶液（即按2.3處理到酶解步驟前的溶液）進行回收率實驗。由于酶解液的定容體積為1 mL，且用于酶解反應的提取溶液即為200 μL，故用移液槍分別量取200 μL全蝎藥材提取溶液，該溶液中對應的特征肽段含量應為0.005 217 nmol。特征肽段加入量與全蝎藥材提取溶液中特征肽段的含量比例分別為1.5∶1，1∶1，0.5∶1左右，即分別加入0.007 5 nmol，0.005 nmol，0.002 5 nmol的特征肽段，按照2.3中的酶解步驟進行處理得到供試品溶液。經檢測得到在不同的添加水平下，平均回收率在87%～93%，見表4。以上結果說明該方法的準確度較高，可以用于含量測定。

2.10?檢出限和定量限

通過對已知濃度的酶解溶液進行稀釋，直至待測溶液中特征肽段的定量離子的信噪比（S/N）接近3時計算得到方法檢出限（Limit of Detection，LOD）為0.04 mg/kg，當定量離子的信噪比（S/N）接近10時計算得到方法定量限（Limit of Quantitation，LOQ）為0.13 mg/kg。

2.11?樣品測定結果

按照所建立的檢測方法對市售的37批全蝎藥材進行檢測，經標準曲線分析，得到供試品溶液中特征肽段的摩爾濃度，同時運用了凱氏定氮法測定了全蝎樣品中的蛋白質總量，含量在317～604 g/kg，通過計算后得到樣品中2組β-肌動蛋白的含量數據，一組為β-肌動蛋白占樣品干重之比（以樣品計），另一組為β-肌動蛋白占總蛋白之比（以總蛋白質含量計）。見表8。

3?討論

3.1?目標蛋白質及其特征肽段的選擇

3.1.1?高分辨質譜鑒定特征肽段的方法

供試品溶液制備：稱取藥材粉末約1.5 g至15 mL離心管中，精密稱定。精密加入10 mL PBS緩沖溶液，超聲30 min，10 000 r/min，離心半徑10.7 cm，離心5 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾。

酶解：精密量取上述濾液400 μL至1.5 mL EP管中，加入10 μL胰蛋白酶溶液（1 mg/mL），渦旋混勻，于37 ℃反應過夜，加入10 μL甲酸終止反應，精密加入480 μL水，10 000 r/min，離心半徑8.6 cm，離心10 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾，供分析用。

取酶解后溶液5 μL進樣，0～7 min，上樣泵流速為5 μL/min，經在線Trap C18柱（75 μm×15 cm，3 μm）脫鹽富集。后通過分離柱New Objective C18毛細管柱（75 μm×15 cm，3 μm）分析，流動相A為0.1%甲酸（V∶V）-水溶液，流動相B為0.1%甲酸（20%水+80%乙腈）溶液（V：V），流速為300 nL/min。梯度洗脫：0～7.0 min，5%B;7.0～95.0 min，5%B～70%B;95.0～95.1 min，70%B～90%B;95.1～100.0 min，90%B;100.0～100.1 min，90%B～5%B;100.1～130.0 min，5%B。

高分辨質譜參數：掃描模式為Full MS-ddMS2，掃描質荷比（m/z）范圍300～3 000，一級MS分辨率70 000，二級分辨率35 000，隔離寬度（m/z）為2，毛細管溫度250 ℃，噴霧電壓2.1 kV。

數據分析采用PEAKS Studio的軟件中的PEAKS算法，設定FDR<0.01%。在數據軟件中采用從Uniprot（http：//www.uniprot.org/）下載全蝎（Buthus martensii Karsch）的所有蛋白質全序列譜庫匹配搜索原始數據。確定用于含量測定的高豐度蛋白質以及該蛋白質包含的被檢測到的肽段，針對選定的高豐度蛋白質的氨基酸序列通過MEGA（7.0.21）軟件，使用鄰域連接方法推斷推斷進化歷史，以明確選擇的目標待測蛋白質序列在物種間的特異性。根據特征肽段篩選的要求[11]，確定特征肽段。

3.1.2?目標蛋白質的選擇?基于Bottom up的蛋白質測序方法[12]。樣品經提取和酶解后經Nano-LC液相色譜進行分離進入高分辨質譜分析，采集得到的高分辨質荷比（m/z）數據通過蛋白質組學軟件PEAKS Studio與數據庫中全蝎所有蛋白質的理論氨基酸全序列進行了匹配，得到了高匹配蛋白質的登記號（Accession），見表5。將最高匹配度蛋白質（-10 lgP數值最大）的登記號“tr|E6Y2S5|E6Y2S5_MESMA”在Uniprot檢索得到該蛋白為來源于全蝎的β-肌動蛋白（Beta-actin），圖6。通過Uniprot的“基本的局部比對搜索工具”（BLAST）檢索到與全蝎β-肌動蛋白序列近似的蛋白質，將這些蛋白質的完整氨基酸序列下載后通過MEGA（7.0.21）軟件進行分析，使用鄰域連接方法推斷進化歷史。進化距離使用Poisson校正方法計算，并以每個位點的氨基酸替換數為單位。分析涉及25個氨基酸序列。其中所包含空白和缺失數據的位置都被刪除。最終得到了分枝長度之和為0.063 580 50的最優(yōu)樹，以明確全蝎β-肌動蛋白序列在物種間的特異性。經比對發(fā)現與東亞鉗蝎（全蝎）β-肌動蛋白的氨基酸序列相似的物質在外形上與全蝎有明顯差異，親緣關系由近至遠為紅鰭東方鲀、二斑葉螨和條蟲葉螨，而與全蝎形態(tài)相似的物種的蛋白質序列未出現在相似度釣取的進化樹結果中，見圖7，表明若采用全蝎的β-肌動蛋白作為標志性蛋白對該物種有一定的特異性。

3.1.3?特征肽段的選擇?通過PEAKS Studio軟件分析得到肽段在全蝎β-肌動蛋白的理論氨基酸全序列的匹配結果。見圖8。

根據胰蛋白酶對精氨酸（R）和賴氨酸（K）肽鏈具有選擇性水解作用的特點，排除胰蛋白酶誤切造成的肽段結果，篩選后得到12條肽段，見表6，根據肽段篩選要求，獨特性、酶解時的可重復性、易于液相色譜串聯三重四級桿質譜（LC-TQMS）系統(tǒng)的檢測性、穩(wěn)定性、特定氨基酸上修飾少、長度6～12個氨基酸等條件，篩選得到適宜的特征肽段為IIAPPER（異亮氨酸-異亮氨酸-丙氨酸-脯氨酸-脯氨酸-谷氨酸-精氨酸）。圖9和表7分別顯示了在高分辨質譜的HCD碰撞模式下，特征肽段的MS2譜圖和碎裂呈b+和y+離子的形式，肽段碎裂后在離子化過程中，通常都要帶2個以上的電荷，從而使得其質量數降低適于質譜分析。但在選擇二級特征子離子碎片時，應盡量選取質量數偏大的y+離子，以避免與其他小分子物質在鑒定過程中的混淆，確保方法的準確性。在保障準確性的前提下，選取質譜響應較高的碎片，來提高檢測方法的靈敏度[9]。經過篩選后，特征肽段的優(yōu)選子離子分別為y5+（569.3），作為含量測定方法中的定量離子。

3.2?樣品檢測結果分析

37批全蝎樣品的β-肌動蛋白含量（以樣品干重計）在4.66～100.26 mg/kg，另一組β-肌動蛋白含量（以總蛋白質含量計）的測定范圍在9.42～185.77 mg/kg。由于全蝎的炮制工藝會引入樣品干重上的較大誤差（水分、鹽分含量不可控），且有文獻報道顯示不同炮制方法會在一定程度上引起總氨基酸含量差異[13-14]，故干燥體質量可能不適宜作為絕對含量測定方法的結果表述單位，如果以總蛋白質含量計可避免以上誤差，但經過統(tǒng)計發(fā)現，β-肌動蛋白含量的2組數據之間存在著較高相關性（r=0.976），因此說明此檢測方法以干重計，不但可以省去總蛋白質的測定步驟，且仍然可以準確地作為結果表述單位。另一方面，樣品批間含量差異較大，可能是蛋白質自酶解或自降解的程度和存放時間成正相關性。由于動物的干燥體在存放過程中，其內部含有的少量耐高溫且活性穩(wěn)定的蛋白酶。這部分蛋白酶會將全蝎的組織蛋白質（包括β-肌動蛋白）進行酶解，同時樣本的組織蛋白質本身也會隨儲藏時間的增長逐漸發(fā)生自降解現象。這2種情況都會導致組織蛋白質的原有氨基酸序列發(fā)生斷裂，且斷裂的位點具有隨機性。以至于β-肌動蛋白特征肽段IIAPPER的任意位點都可能發(fā)生斷裂，從而導致該方法中此特征肽段無法檢出的現象。因此若樣品的總蛋白質含量較其他樣品的總蛋白質含量穩(wěn)定一致的前提下，檢出的β-肌動蛋白含量偏低時，則說明該樣品的儲存時間可能較長。通過該方法測得的結果可以在一定程度上反映全蝎藥材的新舊程度。見表8。

4?結論

本研究根據全蝎所含蛋白質的生物信息學特點，篩選出了用于進行含量測定的β-肌動蛋白及其特征肽段。以特征肽段作為生物標志物并合成與其相似的同位素內標，形成了液相色譜-串聯三重四級桿質譜的含量測定方法。該方法具有靈敏度高，準確度較好和重復性較穩(wěn)定的特點。實驗中對不同提取方式、不同提取時間、不同液料比和酶解時間進行了考察，以提取效率高，色譜信號強度大和節(jié)省前處理時間為指標，最終確定在液料比為1∶100，水浴加熱30 min，酶解6 h作為供試品溶液的制備方法。

利用高分辨質譜進行蛋白質的序列鑒定是蛋白質組學的一種常用技術手段。目前已經有對于蛋白質含量較高的藥材采用檢測離子對進行鑒別的方法[15]，而將特征肽段作為對照品進行藥材中特定蛋白的含量測定也不失為一種有意義的嘗試。該方法作為一種能夠反映全蝎藥材內源性成分含量的手段，可以對完善全蝎的質量標準起到一定的參考意義。今后，類似模式的蛋白質檢測技術可以更廣泛的應用于中藥的質量控制領域。

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（2020-06-10收稿?責任編輯：徐穎）