牛至油及其主要成分的體外抑菌實(shí)驗(yàn)

許璐 喻毅 曹宇 李瑤 謝艷華 李捷 王四旺

摘要? 目的：比較牛至油、香芹酚、百里香酚和對(duì)傘花烴對(duì)6株標(biāo)準(zhǔn)菌的抑菌效果。方法：采用濾紙片法以及試管二倍稀釋法，以頭孢曲松鈉和氟康唑作為陽性對(duì)照，分別采用牛至油、香芹酚、百里香素、對(duì)傘花烴對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、葡萄牙念珠菌進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，測(cè)定抑菌圈的大小，最小抑菌濃度（MIC）以及最小殺菌濃度（MBC）。評(píng)價(jià)各試藥的抑菌效果。結(jié)果：牛至油、香芹酚、百里香酚對(duì)不同標(biāo)準(zhǔn)菌株均有明顯抑菌效果;濾紙片法顯示牛至油、香芹酚、百里香酚對(duì)選定的6株菌株皆高度敏感，對(duì)傘花烴對(duì)其菌株耐藥。試管二倍稀釋法結(jié)果表明，牛至油、香芹酚抑菌效果稍強(qiáng)于百里香酚，但這3種植物揮發(fā)油對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果與其他菌株相比較弱。結(jié)論：牛至油、香芹酚和百里香酚對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、葡萄牙念珠菌具有顯著體外抑菌作用。

關(guān)鍵詞? 牛至油;香芹酚;百里香素;植物精油;試管二倍稀釋法;最小抑菌濃度;最小殺菌濃度;抑菌作用

Experimental Study on Antibacterial Activity of Oregano Oil and Its Main Components in Vitro

XU Lu1，YU Yi2，CAO Yu 1，LI Yao3，XIE Yanhua3，LI Jie1，WANG Siwang3

（1 Department of Traditional Chinese Medicine and Natural Pharmacy，School of Pharmacy，Air Force Military Medical University，Xi′an 710032，China; 2 Unit 66295，Songlindian town，Zhuozhou city，Zhuozhou 072761，China; 3 Department of Life Science and Medicine，Northwest University，Xi′an 710069，China）

Abstract Objective： To compare the antibacterial effects of oregano oil，carvacrol，thymol and para-cymene on 6 standard strains. Methods： The filter paper method and the tube double dilution method were used.Ceftriaxone sodium and fluconazole were used as positive controls.Oregano oil，carvacrol，thyme，p-cymene against Staphylococcus aureus，Klebsiella pneumoniae，Enterococcus faecalis，Escherichia coli，Pseudomonas aeruginosa，Candida portuguese in vitro antibacterial experiment were used to determine the size of the inhibition zone，the minimum inhibitory concentration （MIC） and the minimum bactericidal concentration （MBC）.The antibacterial effects of each test drug were evaluated. Results： Oregano oil，carvacrol，thymol had antibacterial effects on different standard strains.The filter paper method showed that oregano oil，carvacrol and thymol were highly sensitive to the 6 selected strains.Para-cymene is resistant to these standard strains.The tube double dilution method showed that the antibacterial effects of oregano oil and carvacrol were slightly stronger than thymol，but the antibacterial effects of this 3 essential oils against Pseudomonas aeruginosa were weaker than other strains. Conclusion： Oregano oil，carvacrol and thymol have strong antibacterial activity against the strains of Staphylococcus aureus，Klebsiella pneumoniae，Enterococcus faecalis，Escherichia coli，Pseudomonas aeruginosa，Candida albicans.

Keywords? Oregano oil; Carvacrol; Thymol; Essential Oil; Tube double dilution method; Minimum inhibitory concentrations; Minimum bactericidal concentration; Antibacterial effects

中圖分類號(hào)：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.010

牛至也被稱為土香薰，土茵陳，原名小葉野薄荷，為唇形科牛至屬的多年生草本植物，載于《植物名實(shí)圖考》，具有解表，理氣，化濕，利水的作用[1]。牛至油是從牛至中提取出的淡黃色具有揮發(fā)性的液體，主要含有酚類和萜烯類物質(zhì)如香芹酚，百里香酚等，在國內(nèi)外研究中對(duì)多種細(xì)菌、真菌都有較好的抑制作用，而且具有很強(qiáng)的抗氧化活性[1-6]。目前，牛至油被廣泛用作作為飼料添加劑，能夠促進(jìn)動(dòng)物腸道菌落平衡和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、從而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，增強(qiáng)免疫能力[2，7]。牛至精油還可作為天然植物保鮮劑，可以取代化學(xué)成分作為食品添加劑，具有非常好的防腐作用，其特有的芳香性也能夠作為調(diào)味品改善食物風(fēng)味[3]。然而，牛至油中的抑菌成分尚不清楚，特別其在醫(yī)藥應(yīng)用方面研究較為鮮見。

我們對(duì)牛至油及其主要成分香芹酚、百里香酚、對(duì)傘花烴進(jìn)行了相關(guān)體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究，選取常見的6種致病菌株，旨在探究牛至油及其主要成分抑菌作用和揭示發(fā)揮抗菌作用的功效成分，為其進(jìn)一步研發(fā)大健康產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高壓蒸汽滅菌鍋（日本三洋電機(jī)株式會(huì)社，型號(hào)：MLS-3750）;CO2培養(yǎng)箱（上海力康，型號(hào)：HF212）;HDL生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，型號(hào)：HPsafe-1200LC）;微量移液器吉爾森（上海麥尚科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：PL）;電子比濁儀（法國生物梅里埃，型號(hào)：400122E-0032）;賽多利斯分析天平（德國賽多利斯公司，型號(hào)：BSA224S-CW）。

1.2 試藥 牛至油（江西省吉水縣俊達(dá)天然香料油廠，批號(hào)：20180404）;香芹酚（吉水縣益康天然香料油提煉廠，批號(hào)：20170603）;百里香酚（上海邁坤化工有限公司，批號(hào)：20170415）;對(duì)傘花烴（廣東翁江化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180315）;頭孢曲松鈉（上海羅氏制藥，批號(hào)：SH6101）;氟康唑（廣東逸舒制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20066085）;二甲基亞砜（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20151109）;普通肉湯（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20180701）。

1.3 菌種及培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)所用菌株見表1所列，所有菌種均由空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 試藥配制 陽性藥物的配制：頭孢曲松鈉的配制，精密稱取頭孢曲松鈉粉末5.12 mg，用無菌生理鹽水溶解至10 mL，得濃度為512 mg/L的藥液。氟康唑的配制：方法同頭孢曲松鈉配制，得濃度為512 mg/L的藥液。

2.2 菌懸液的配制 用無菌接種環(huán)將以上菌種分別接種于血瓊脂培養(yǎng)基上，細(xì)菌菌種于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，真菌菌種孵育48 h，再挑取單個(gè)菌落用無菌水稀釋，麥?zhǔn)媳葷醿x測(cè)得其濃度達(dá)到0.5（細(xì)菌總數(shù)達(dá)到1.5×108 CFU/mL），備用[8-9]。

2.3 營(yíng)養(yǎng)肉湯的配制 稱取6 g普通肉湯粉末，加入帶塞錐形瓶中，量取200 mL蒸餾水，震蕩使其溶解，121 ℃高壓滅菌30 min備用。

2.4 濾紙片法（K-B法）測(cè)定抑菌圈大小 取MH培養(yǎng)基，用一次性棉拭子蘸取經(jīng)過麥?zhǔn)媳葷醿x測(cè)定好的菌懸液于培養(yǎng)基表面均勻涂布，再用鑷子將6 mm無菌濾紙片貼于培養(yǎng)基表面，輕輕按壓貼緊，移液槍吸取25 μL試藥緩慢滴在無菌濾紙片上，再將培養(yǎng)基倒置，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)菌培養(yǎng)24 h，真菌培養(yǎng)48 h后觀察測(cè)量抑菌圈的直徑，記錄。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)見表2[9]。

2.5 試管二倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）

最小抑菌濃度的測(cè)定[10-11]：取無菌試管9只，排成一排并標(biāo)號(hào)，每管加入配置好的滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯1 mL，第1管中加入1 mL試藥，混勻后吸取1 mL加入第2管，第2管混勻后吸取1 mL加入第3管，重復(fù)此步驟直到第7管混勻，吸取1 mL棄去，此時(shí)各管中試藥濃度依次為10、5、2.5、1.25、0.625、0.156 25、0.078 125 mL/L。接下來每管分別加入配置好的菌懸液10 μL，第8管只加入肉湯及菌懸液做無藥陽性對(duì)照，第9管只加入肉湯及試藥做無菌陰性對(duì)照。陽性對(duì)照組的設(shè)置，同樣取無菌試管共12只，標(biāo)號(hào)，每管加入1 mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯，第1管加入1 mL配好的已知濃度的陽性藥物（細(xì)菌采用頭孢曲松鈉，真菌采用氟康唑），混勻后吸取1 mL加入第2管，重復(fù)操作，連續(xù)倍比稀釋直到第10管，吸取1 mL棄去，此時(shí)各試管藥物濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 mg/L。第11管加入肉湯和菌液做無藥陽性對(duì)照，第12管加入肉湯和陽性藥物做無菌陰性對(duì)照。最終以陽性對(duì)照組渾濁，陰性對(duì)照組澄清為標(biāo)準(zhǔn)。觀察各個(gè)試管內(nèi)肉湯的澄清度狀況，記錄肉湯渾濁的前一管的試藥濃度為最小抑菌濃度，實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)3次。

最小殺菌濃度的測(cè)定：測(cè)定最小抑菌濃度后，用10 μL接種環(huán)從各個(gè)組澄清管中取一環(huán)培養(yǎng)物劃線接種于血瓊脂培養(yǎng)皿中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中，細(xì)菌培養(yǎng)24 h，真菌培養(yǎng)48 h后，觀察培養(yǎng)平板上是否有菌株生長(zhǎng)，記錄無菌株生長(zhǎng)的最小試藥的濃度，即為最小殺菌濃度。

2.6 各試藥的抑菌效果 表3結(jié)果顯示，牛至油及其主要成分香芹酚，百里香酚對(duì)6種待測(cè)菌株均有良好抑制作用。濾紙片法觀察牛至油、香芹酚、百里香酚對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、葡萄牙念珠菌均高度敏感，抑菌圈直徑≥16 mm。對(duì)傘花烴則對(duì)此6種菌株均耐藥，抑菌圈直徑<10 mm。陽性對(duì)照組頭孢曲松鈉對(duì)糞腸球菌不敏感，對(duì)其他菌株高度敏感。牛至油中有抑菌活性的成分可能是香芹酚及百里香酚。

2.7 不同濃度試藥抑菌活性

以最小抑菌濃度及最小殺菌濃度說明各試藥的抑菌活性，結(jié)果見表4～5。37 ℃培養(yǎng)24～48 h后，肉眼觀察試管內(nèi)液體澄明度，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3 討論

牛至油、香芹酚、百里香酚對(duì)6種標(biāo)準(zhǔn)菌株均有一定程度的抑制作用，陽性藥物組頭孢曲松鈉以及氟康唑MIC及MBC結(jié)果符合參考值說明此次研究有效[10]。牛至油、香芹酚和百里香酚組對(duì)金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、葡萄牙念珠菌抑菌效果好，MIC為0.312 5 mL/L時(shí)可抑制菌株生長(zhǎng)，牛至油及百里香酚對(duì)肺炎克雷伯菌MIC值為0.625 mL/L，相較之下香芹酚對(duì)肺炎克雷伯菌的抑菌效果更好，MIC值為0.312 5 mL/L，牛至油、香芹酚、百里香酚都對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果最弱，MIC值為1.25 mL/L。

牛至油及香芹酚對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌的殺菌效果相當(dāng)，MBC值為0.625 mL/L，百里香酚對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌效果與牛至油及香芹酚相當(dāng)，對(duì)肺炎克雷伯菌及糞腸球菌的作用較弱，MBC值為1.25 mL/L。香芹酚及百里香酚對(duì)大腸埃希菌的殺滅作用稍遜于牛至油，此3種試藥對(duì)葡萄牙念珠菌的殺菌作用最好，MBC值均為0.312 5 mL/L;對(duì)銅綠假單胞菌殺菌作用最弱，MBC值分別為1.25、1.25、2.5 mL/L;這種差別可能與其抗菌作用的不同機(jī)制有關(guān)，具體還需下一步探討。

牛至油、香芹酚、百里香酚對(duì)實(shí)驗(yàn)所用的6株標(biāo)準(zhǔn)菌“金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、葡萄牙念珠菌”等均具有明顯的抑制作用。濾紙片法結(jié)果顯示牛至油、香芹酚、百里香酚對(duì)選定的菌株均高度敏感，最小抑菌濃度及最小殺菌濃度結(jié)果表明牛至油、香芹酚抑菌效果強(qiáng)于百里香酚，由此說明，牛至油中發(fā)揮抑菌作用的主要功效成分與香芹酚和百里香酚高度相關(guān)，但這3種試藥對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果與其他菌株相比更弱。

牛至油、香芹酚、百里香酚對(duì)霉菌也有較強(qiáng)的抑制作用[12-13]，但由于條件限制，未能對(duì)其抑制霉菌的作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探討。

病原微生物引起的食品變質(zhì)以及人體攝入后導(dǎo)致的食物中毒嚴(yán)重危害著人們的生命健康，是世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題[14-15]。由于化學(xué)防腐添加劑所潛藏的風(fēng)險(xiǎn)，近年越來越多的研究者期待研發(fā)天然產(chǎn)物的應(yīng)用，以消除微生物污染，確保食品安全以及品質(zhì)[15]。牛至油系天然產(chǎn)品，是從植物中提取的一類小分子揮發(fā)性物質(zhì)，難溶于水，主要成分有醛酮類，酚類及萜類，已經(jīng)證實(shí)其具有抗氧化、抗菌、抗病毒活性，在醫(yī)藥、食品、化妝品行業(yè)將具有重要的應(yīng)用潛質(zhì)[4，16]，本研究證實(shí)其中香芹酚和百里香酚是牛至油中最有效的功效成分，為進(jìn)一步深入研究奠定了基礎(chǔ)。

牛至油是最有效的抗菌天然產(chǎn)物，對(duì)人體健康有積極作用，主要成分香芹酚、百里香酚可用來開發(fā)防治疾病的產(chǎn)品。近年來在牛至油抗氧化，抗炎、抗糖尿病，抗增殖等多個(gè)方面研究已受重視，具有廣闊的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

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（2019-03-12收稿 責(zé)任編輯：張雄杰）

基金項(xiàng)目：陜西省創(chuàng)新藥物研究中心（現(xiàn)代中藥新藥研發(fā)）平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目（2015SF2-08-01）;陜西省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科技創(chuàng)新基地項(xiàng)目（S2018-ZC-GCZXXY-SF-0005）

作者簡(jiǎn)介：許璐（1996.02—），女，碩士研究生在讀，研究方向：中藥學(xué)，E-mail：13092997710@163.com

通信作者：王四旺（1958.08—），男，碩士，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥學(xué)，E-mail：wangsiw@fmmu.edu.cn