化痰祛瘀湯對(duì)失眠大鼠模型的治療作用及機(jī)制

王琪 李延 李勇 吳限

摘要? 目的：觀察化瘀祛痰湯對(duì)失眠大鼠模型的治療作用，探討作用機(jī)制。方法：選取40只成年SD大鼠，分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、中藥觀察組和艾司唑侖組。建立對(duì)照組之外3組大鼠失眠模型。中藥觀察組給予化瘀祛痰湯，艾司唑侖組給予艾司唑侖水溶液灌胃，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組均給予同等體積的蒸餾水灌胃。觀察各組建模及治療后行為學(xué)變化;比較各組大鼠干預(yù)前后自主活動(dòng)數(shù);比較干預(yù)后各組大鼠戊巴比妥鈉致眠后睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間;比較各組大鼠下丘腦5-HT和5-HIAA水平，下丘腦GABA蛋白表達(dá)。結(jié)果：中藥觀察組大鼠治療后的行為學(xué)改善、自主活動(dòng)數(shù)穩(wěn)、戊巴比妥鈉致眠后睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間、下丘腦5-HT和5-HIAA水平、下丘腦GABA蛋白表達(dá)改善均優(yōu)于艾司唑侖組大鼠及模型對(duì)照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。結(jié)論：化瘀祛痰湯對(duì)失眠大鼠有良好的治療作用，能夠改善行為學(xué)和自主活動(dòng)，延長(zhǎng)睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間，效果明顯優(yōu)于艾司唑侖。

關(guān)鍵詞? 化瘀祛痰湯;艾司唑侖;失眠;自主活動(dòng)數(shù);下丘腦5-HT;下丘腦5-HIAA;下丘腦GABA蛋白表達(dá);治療作用;機(jī)制

Exlporaiton of Therapeutic Effects and Mechanisms of Huatan Quyu Decoction on Insomnia Rats

WANG Qi1，LI Yan1，LI Yong2，WU Xian1

（1 The First Affiliated Hospital，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2 The Second Affiliated Hospital，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

Abstract Objective： To observe the therapeutic effects of Huayu Qutan Decoction on insomnia rats and explore its mechanisms. Methods： A total of 40 adult SD rats were divided into a normal control group，a model control group，a traditional Chinese medicine treatment group and an estazolam group.The insomnia model was established in 3 groups except for the control group.Traditional Chinese medicine treatment group was given Huayu Qutan Decoction，estazolam group was given estazolam solution gavage，the model control group and the normal control group were given the same volume of distilled water gavage.The behavioral changes of rats in each group after modeling and treatment were observed; the number of autonomous activities of rats in each group before and after intervention were compared; the sleep latency and duration of sleep induced by pentobarbital sodium in each group after intervention were compared; and the content of 5-HT and 5-HIAA in hypothalamus and the expression of GABA protein in hypothalamus in each group were compared. Results： The improvement of behavior，number of autonomous activities，sleep latency and sleep duration induced by pentobarbital sodium，5-HT and 5-HIAA contents in hypothalamus，and GABA protein expression in hypothalamus in the traditonal Chinese medicine treatment group were better than those in the estazolam group and the model control group （? P <0.05 ）. Conclusion： Huayu Qutan Decoction has good therapeutic effects on insomnia rats.It can improve behavior and autonomic activity，prolong sleep latency and sleep duration.The effects are better than that of estazolam.It is speculated that it is related to the significant increase of 5-HT and 5-HIAA contents in hypothalamus and the promotion of GABA protein expression.

Keywords? Huayu Qutan Decoction; Estazolam; Insomnia; Autonomic activity number; 5-HT in hypothalamus; 5-HIAA in hypothalamus; GABA protein expression in hypothalamus; Therapeutic effects; Mechanism

中圖分類(lèi)號(hào)：R289.5;R256.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.008

失眠是臨床常見(jiàn)病，是指入睡/睡眠維持困難、早醒、易醒并伴有日間功能障礙的一種睡眠障礙，對(duì)患者的日常生活和工作均可造成嚴(yán)重的影響[1]。失眠患者若得不到及時(shí)有效的治療，可出現(xiàn)多種軀體或精神障礙疾病，對(duì)其身心造成二次打擊，并且可加重患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。艾司唑侖是失眠患者的常用藥，但是效果不甚理想，往往難以徹底根除失眠，且長(zhǎng)期應(yīng)用容易出現(xiàn)依賴(lài)性，該藥物的安全性也堪憂(yōu)[2-3]。隨著人們對(duì)中醫(yī)理論的認(rèn)識(shí)不斷加深和中醫(yī)治療技術(shù)的推廣應(yīng)用，中醫(yī)藥在失眠患者中也得到了廣泛的應(yīng)用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，失眠的根本病因在于痰蒙上竅、氣滯血瘀，因而應(yīng)以化痰祛瘀為治則[4]。李延教授特針對(duì)失眠患者擬定化痰祛瘀湯，并且在臨床中已獲得良好的效果，得到患者的一致認(rèn)可。但是化痰祛瘀湯對(duì)失眠患者的作用機(jī)制尚有待深入探討。本研究特實(shí)施大鼠實(shí)驗(yàn)，將化痰祛瘀湯與艾司唑侖在失眠大鼠中的治療作用進(jìn)行比較，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，以為其在臨床中的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取40只成年SD大鼠，雌性各半，6～7周齡，體質(zhì)量180～220 g，平均體質(zhì)量（204.13±6.76）g，均購(gòu)自黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物合格證編號(hào)：2017012。SPF級(jí)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，期間提供標(biāo)準(zhǔn)飼料，自有進(jìn)水，25～27 ℃條件，30% ～50%濕度。

1.1.2 藥物 丹參、川芎、紅花、赤芍、桃仁、清半夏、瓜蔞、茯苓、陳皮、炙甘草均為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院采購(gòu)，且均經(jīng)鑒定符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)。艾司唑侖（天津太平洋制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020291）。

1.1.3 試劑與儀器 蒸餾水（佛山市普天宇信水處理設(shè)備有限公司，批號(hào)：3892）;弱堿性生理鹽水[友康恒業(yè)生物科技（北京）有限公司，批號(hào)：A822];磷酸緩沖鹽溶液（PBS）緩沖液（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：3321D）;戊巴比妥鈉（上海信裕生物科技有限公司，貨號(hào)：283256）;5-HT（武漢博士德生物科技有限公司，批號(hào)：455723）;5-HIAA熒光分光光度法試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司，貨號(hào)：AT3721）;兔抗鼠GABA單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，貨號(hào)：4819s）;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔GABA多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，貨號(hào)：3835s）;勻漿機(jī)（蘇州江東精密儀器有限公司，型號(hào)AD145S-P）;高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)：5084）;熒光分光光度計(jì)（杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：F96PRO）;化學(xué)發(fā)光熒光影像分析儀（上海捷鈦儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：Fusion pluse7）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、中藥觀察組和艾司唑侖組。除正常對(duì)照組外，其余大鼠均建立失眠模型，方法：每日上午8：00腹腔注射PCPA混懸液1 mL/100 g，1次/d，連續(xù)注射2 d，正常對(duì)照組腹腔注射同體積的弱堿性生理鹽水。建模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)：于第1次腹腔注射24～28 h后，動(dòng)物晝夜節(jié)律消失，白天也活動(dòng)不停，表示建模成功。

1.2.2 給藥方法 取丹參20 g、川芎15 g、紅花15 g、赤芍15 g、桃仁15 g、清半夏15 g、瓜蔞15 g、茯苓15 g、陳皮15 g、炙甘草10 g，加8倍水，浸泡30 min后煎煮40 min，過(guò)濾藥液;加6倍水再次煎煮40 min，過(guò)濾藥液。將2次過(guò)濾的藥液混合均勻，濃縮成藥膏，采用蒸餾水配置為50%中藥水煎液。中藥觀察組給予化瘀祛痰湯1 mL/kg灌胃（50%中藥水煎液），艾司唑侖組給予同體積的1.3%艾司唑侖水溶液灌胃，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組均給予同等體積的蒸餾水灌胃，1次/d，連續(xù)7 d。觀察建模及治療后行為學(xué)變化，統(tǒng)計(jì)各組大鼠干預(yù)前后自主活動(dòng)數(shù)，注意實(shí)驗(yàn)需要在安靜、通風(fēng)、25～27 ℃條件下進(jìn)行觀察。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 觀察各組大鼠建模及治療后行為學(xué)變化;2）比較各組大鼠干預(yù)前后自主活動(dòng)數(shù);3）比較各組大鼠干預(yù)后戊巴比妥鈉致眠后睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間;4）比較各組大鼠下丘腦5-羥色胺（5-HT）和5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA）水平;5）比較各組大鼠下丘腦GABA蛋白表達(dá)。大鼠干預(yù)后戊巴比妥鈉致眠后睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間檢測(cè)：于末次給藥1 h后給予戊巴比妥鈉腹腔注射，劑量為35 mg/kg（按照預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的引起所有大鼠均睡眠的最小劑量計(jì)算），統(tǒng)計(jì)睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間。大鼠下丘腦5-HT和5-HIAA水平檢測(cè)：將所有大鼠均于末次給藥并完成上述檢測(cè)后采用斷頭法處死，迅速取下丘腦組織。將下丘腦組織剪碎并勻漿處理，按照1 500 r/min轉(zhuǎn)速將勻漿液在臺(tái)式離心機(jī)上離心分離處理，時(shí)間為10 min。吸取上層清液，加入含有1.5 mL磷酸緩沖鹽緩沖液（0.1 mol/L）的離心管中，搖蕩10 min。采用熒光分光光度法檢測(cè)下丘腦5-HT和5-HIAA水平，注意嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。大鼠下丘腦組織GABA蛋白表達(dá)檢測(cè)：取下丘腦組織，勻漿并對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量檢測(cè)。在100 ℃條件下水浴，10 min。采用10%濃度SDS-PAGE分離膠+4%濃度濃縮膠進(jìn)行電泳，觀察溴酚藍(lán)變化，直至到達(dá)分離膠底部，可停止電泳。轉(zhuǎn)膜并用脫脂奶粉封閉PVDF膜，室溫，1.5 h。添加一抗，4 ℃孵育過(guò)夜;添加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h。洗脫10 min，加入ECL，室溫避光孵育。采用化學(xué)發(fā)光熒光影像分析儀顯影，并利用Quantity One軟件檢測(cè)下丘腦GABA蛋白表達(dá)量，其中內(nèi)參為GAPDH。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（? ±s ）描述，多樣本間差異以單因素方差分析，每2樣本間差異以SNK-q檢驗(yàn)。以 P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠建模及治療后行為學(xué)變化觀察 所有大鼠建模及干預(yù)期間均無(wú)死亡。3建模組在PCPA注射12～48 h期間均有一定的興奮性行為，白天明顯躁動(dòng)不安、活動(dòng)增多，對(duì)外界光線和聲音等刺激敏感性和攻擊性均增強(qiáng)，大便灰白，小便正常。3建模組在PCPA注射72～96 h后大鼠經(jīng)常低頭、皮毛松亂、精神不振、進(jìn)食和活動(dòng)均減少，毛色暗淡，對(duì)外界刺激反應(yīng)減弱，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢甚至有部分大鼠體質(zhì)量下降，疲勞狀態(tài)嚴(yán)重。中藥觀察組和艾司唑侖組干預(yù)期間大鼠進(jìn)食、活動(dòng)、睡眠、毛色、體質(zhì)量和對(duì)外界刺激反應(yīng)均有所改善，而模型對(duì)照組部分大鼠狀態(tài)無(wú)變化，另有部分大鼠狀態(tài)更差。正常對(duì)照組大鼠建模及干預(yù)期間狀態(tài)均正常。

2.2 各組大鼠干預(yù)前后自主活動(dòng)數(shù)比較 各組干預(yù)前后自主活動(dòng)數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），干預(yù)前正常對(duì)照組均高于其余3組（ P <0.05），且其余3組間每2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05）;干預(yù)后正常對(duì)照組自主活動(dòng)數(shù)無(wú)變化，模型對(duì)照組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），中藥觀察組和艾司唑侖組均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），且干預(yù)后正常對(duì)照組自主活動(dòng)數(shù)最多，中藥觀察組次之，艾司唑侖組更少，模型對(duì)照組更少，每2組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 各組大鼠干預(yù)后戊巴比妥鈉致眠后睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間比較 各組大鼠干預(yù)后戊巴比妥鈉致眠后睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），正常對(duì)照組最長(zhǎng)，中藥觀察組次之，艾司唑侖組更短，模型對(duì)照組最短，每2組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 各組大鼠下丘腦5-HT和5-HIAA水平比較? ?各組大鼠下丘腦5-HT和5-HIAA水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），其中正常對(duì)照組最高，中藥觀察組次之，艾司唑侖組更低，模型對(duì)照組最低，每2組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。見(jiàn)表3。

2.5 各組大鼠下丘腦GABA蛋白表達(dá)比較 各組大鼠下丘腦GABA蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），正常對(duì)照組最高，中藥觀察組次之，艾司唑侖組更低，模型對(duì)照組最低，每2組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。見(jiàn)表4和圖1。

3 討論

失眠包括原發(fā)性和繼發(fā)性2種，前者常見(jiàn)的病因有生理不適、心理打擊、主觀失眠等，后者主要包括軀體疾病，藥物濫用和精神障礙等[5-6]。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)水平下人們對(duì)失眠的發(fā)生機(jī)制認(rèn)識(shí)尚淺，臨床治療藥物也缺乏特異性，難以獲得良好的效果和預(yù)后[7-9]。隨著中醫(yī)學(xué)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展，中醫(yī)藥在失眠患者的治療中逐漸顯現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

本研究中結(jié)果顯示，3建模組給予PCPA后均出現(xiàn)行為學(xué)改變，證明模型建立成功;中藥觀察組和艾司唑侖組治療后行為學(xué)均出現(xiàn)不同程度的改善，證明化痰祛瘀湯和艾司唑侖對(duì)失眠大鼠模型均有良好的治療效果，且中藥觀察組行為學(xué)改善效果最佳，表明化痰祛瘀湯的效果明顯優(yōu)于艾司唑侖。本研究自主活動(dòng)數(shù)、戊巴比妥鈉致眠后睡眠潛伏期和持續(xù)睡眠時(shí)間比較結(jié)果顯示，化痰祛瘀湯的效果均最佳，艾司唑侖的效果均次之，可知化痰祛瘀湯對(duì)失眠大鼠的治療作用明顯優(yōu)于艾司唑侖。艾司唑侖屬于短效的苯二氮? 艸? 卓? 類(lèi)鎮(zhèn)靜、催眠藥物，對(duì)失眠有一定的療效，但是作用靶點(diǎn)單一，效果不甚理想且存在戒斷反應(yīng)[10-11]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，失眠應(yīng)當(dāng)歸屬于“不寐”“不得眠”等范疇，現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)家認(rèn)為該病的發(fā)生與瘀血內(nèi)阻有關(guān)，主要病因有情志失調(diào)、病恙纏身、飲食不節(jié)、痰瘀氣滯等，且痰瘀內(nèi)阻是該病發(fā)生的根本原因[12-13]?；奠铕鰷抢钛咏淌跀M定的中藥方劑，針對(duì)失眠患者“痰瘀內(nèi)阻”的病機(jī)選用中藥材，能夠達(dá)到化痰理氣、化瘀行氣、活血安眠的作用?；鲮钐禍嗅t(yī)丹參為君藥，既可活血祛瘀，又具安神寧心之效;配以川芎可活血祛瘀，并以桃仁、紅花、赤芍相互為用，共同增強(qiáng)活血化瘀、行氣逐瘀之效;另以清半夏消痞散結(jié)、化痰燥濕、寬中理氣，以瓜蔞寬胸散結(jié)、清熱滌痰，以茯苓李成滲濕利水、安神寧心;配合陳皮化痰祛濕、寬中理氣。炙甘草則司調(diào)和之職，還可補(bǔ)脾和胃。諸藥合用，可達(dá)活血化瘀、健脾益氣、安神寧心、化痰安眠之效?，F(xiàn)代研究證實(shí)，丹參中的丹參總苷有助于降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，改善睡眠質(zhì)量[14];茯苓中藥飲片也能夠改善失眠患者的睡眠質(zhì)量[15]。由此可知，化痰祛瘀湯對(duì)失眠大鼠模型的治療作用明顯優(yōu)于艾司唑侖，顯示出良好的應(yīng)用價(jià)值。

此外，本研究中還顯示，中藥觀察組大鼠干預(yù)后下丘腦5-HT和5-HIAA水平與正常對(duì)照組最為接近，明顯高于艾司唑侖組，且模型對(duì)照組均最低，提示化痰祛瘀湯能夠改善失眠大鼠模型下丘腦中的神經(jīng)遞質(zhì)水平。在干預(yù)后大鼠下丘腦GABA蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較結(jié)果顯示，中藥觀察組僅次于正常對(duì)照組，且明顯高于艾司唑侖組，而模型對(duì)照組最低，可知化痰祛瘀湯能夠上調(diào)失眠大鼠下丘腦GABA蛋白的表達(dá)，推測(cè)與改善大鼠失眠狀況有關(guān)。5-HT在人體胃腸道組織、血小板和神經(jīng)阻滯中廣泛存在，能夠參與心血管活動(dòng)、睡眠-覺(jué)醒等多種生物學(xué)活動(dòng)的調(diào)控，在眾多5-HT受體亞型中能夠參與不同的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。5-HIAA是5-HT的代謝產(chǎn)物，二者在失眠患者下丘腦組織中的水平均顯著降低，與神經(jīng)元的興奮性有關(guān)[16-17]。GABA作為一種常見(jiàn)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，能夠發(fā)揮抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性、抗驚厥、抗焦慮等生物學(xué)作用。該因子主要通過(guò)與相應(yīng)的受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用的，且其配體的表面均含有配體門(mén)控氯離子通道蛋白，借助與GABA的結(jié)合增加膜對(duì)氯離子的通透性，使氯離子內(nèi)流，形成抑制性突觸后電位，從而對(duì)中樞神經(jīng)發(fā)揮抑制作用[18-19]。因此，在失眠大鼠和患者中均應(yīng)用積極改善下丘腦5-HT和5-HIAA水平，上調(diào)GABA蛋白表達(dá)。郭曉等[20]報(bào)道，對(duì)失眠大鼠采用寧心安神方治療既能夠改善大鼠下丘腦5-HT和5-HIAA水平，還可增加下丘腦GABA蛋白的表達(dá)量，并且證實(shí)寧心安神方中的丹參、茯苓均能夠發(fā)揮上述作用。結(jié)合上述分析和相關(guān)報(bào)道，可知化痰祛瘀湯中丹參和茯苓也能夠改善下丘腦5-HT和5-HIAA水平，上調(diào)GABA蛋白表達(dá)，其余中藥材是否能夠調(diào)控上述因子仍需要進(jìn)一步研究。由此可知，化痰祛瘀湯能夠改善失眠大鼠模型下丘腦5-HT和5-HIAA水平，上調(diào)GABA蛋白表達(dá)。

綜上所述，化痰祛瘀湯對(duì)失眠大鼠模型具有良好的治療作用，且明顯優(yōu)于艾司唑侖，推測(cè)與改善下丘腦5-HT和5-HIAA水平，上調(diào)GABA蛋白表達(dá)有關(guān)，顯示出良好的臨床推廣及應(yīng)用價(jià)值。但是該方劑對(duì)失眠的具體作用機(jī)制仍需要深入探討，需作為下一步的研究方向。

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（2019-03-22收稿 責(zé)任編輯：張雄杰）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81774426）;黑龍江省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目（ZHY18-040）

作者簡(jiǎn)介：王琪（1982.11—），女，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：心腦血管疾病，E-mail：liangzhiminglzm001@163.com

通信作者：吳限（1965.01—），女，研究生，主任醫(yī)師，科室主任，研究方向：腦血管病，E-mail：ulicek@163.com