HPLC-MS/MS法同時測定首薈通便膠囊中8種成份分析

彭艷 陶箭飛

摘要? 目的：研究高效液相色譜-串聯(lián)質譜（HPLC-MS/MS）法同時測定首薈通便膠囊中8種成份的作用。方法：采用HPLC-MS/MS法同時對首薈通便膠囊中8種成份進行分析，采用Agilent ZORBAX C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），將乙腈（A）-10 mmol/L乙酸銨溶液（B）作為流動相。梯度洗脫（0～1.2 min，5%A;1.2～2 min，5%A→20%A;2～4 min，20%A→40%A;4～8 min，40%A;8～10 min，40%A→95%A;10～17 min，95%A;17～25 min，5%A），設置流速為0.8 mL/min，進樣量為5 μL。以電噴霧離子源，通過SIM模式，正負離子同時監(jiān)測方式。結果：何首烏中大黃素、蘆薈中蘆薈大黃素、決明子中橙黃決明素、枸杞子中枸杞多糖、阿膠中強脯氨酸、人參中人參皂苷、白術中蒼術酮、枳實中橙皮苷的線性范圍分別為0.04～2.50 μg/mL（r=0.999 8）、0.034～0.998 0 μg/mL（r=0.999 6）、0.14～20 μg/mL（r=0.999 4）、0.04～20 μg/mL（r=0.999 9）、0.004～2 μg/mL（r=0.999 9）、0.05～2 μg/mL（r=0.999 6）、0.034～2.5 μg/mL（r=0.999 3）、0.007～0.2 μg/mL（r=0.999 5）。本方式的精密度、穩(wěn)定性及重復性試驗的RSD<3%，且平均回收率在97.3～102.7%范圍內，RSD均<3%。3種樣品中大黃素、蘆薈大黃素、橙黃決明素、枸杞多糖、強脯氨酸、人參皂苷、蒼術酮、橙皮苷的含量分別為0.491～0.499、1.790～1.802、0.506～0.512、0.681～0.684、0.610～0.614、0.102～0.110、0.056～0.058、0.020～0.022 mg/g。結論：HPLC-MS/MS法可為首薈通便膠囊的質量控制提供指導作用，值得臨床推廣應用。

關鍵詞? 首薈通便膠囊;高效液相色譜-串聯(lián)質譜;多成分含量測定;何首烏;蘆薈

Hplc-Ms/Ms Method Used for Simultaneous Determination of 8 Components in Shouhui Tongbian Capsule

PENG Yan1， TAO Jianfei2

（1 School of Pharmacy， Nanjing Medical University， Nanjing 211166， China; 2 Department of Pharmacy， Shanghai Yangsi Hospital， Shanghai 200126， China）

Abstract Objective： To study the simultaneous determination of 8 components in Shouhui tongbian Capsule by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）.? Methods： A total of 8 components in the Shouhui Tongbian Capsule were analyzed by HPLC-MS/MS method. Agilent ZORBAX C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 microns） was used. Acetonitrile （A）-10 mmol/L ammonium acetate solution （B） was used as the mobile phase. Gradient elution （0～1.2 min， 5%A; 1.2～2 min， 5%A→20%A; 2～4 min， 20%A→40%A; 4～8 min， 40%A; 8 min to 10 min， 40%A→95%A; 10～17 min， 95%A; 17～25 min， 5%A）. The flow rate was set as 0.8 mL/min， and the sample volume was 5 mul. To electrospray ion source， through SIM mode， positive and negative ions were simultaneously monitored.? Results： Emodin in Radix Polygoni Multiflori， aloe-emodin in Aloe vera L. var， aurantio-obtusin in Semen Cassiae （semen cassiae torae，lycium barbarum polysaccharide in Fructus Lycii the fruit of Chinese wolfberry，strong proline in Colla Corii Asini donkey-hide gelatin， ginsenoside in Radix Ginseng，atractylone in Rhizoma Atractylodis Macrocephalae bighead atractylodes rhizome， and hesperidin in Fructus Aurantii Immaturus were 0.04～2.50 μg/mL （r=0.999 8）， 0.034～0.998 μg/mL（r=0.999 6）， 0.014～20 μg/mL （r=0.999 4）， 0.04～20 μg/mL（r=0.999 9）， 0.05～2 μg/mL （r=0.999 6）， 0.034～2.5 μg/mL （r=0.999 3）， respectively ， 0.007～0.2 μg/mL （r=0.999 5）. The RSD of precision， stability and repeatability test of this method was less than 3%， and the average recovery was within the range of 97.3～102.7%， and the RSD was all less than 3%. The contents of emodin， aloe-emodin， aurantio-obtusin，lycium barbarum polysaccharide，strong proline， ginsenoside，atractylone， and hesperidin were 0.491～0.499， 1.790～1.802， 0.506～0.512， 0.681～0.684， 0.610～0.614， 0.102～0.110， 0.056～0.058， 0.020～0.022 mg/g， respectively.? Conclusion： HPLC-MS/MS method can provide guidance for the quality control of Shouhui tongbian Capsule and is worthy of clinical application.

Keywords? Shouhui Tongbian Capsule; High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Multicomponent content determination;Radix Polygoni Multiflori;Aloe vera L. var

中圖分類號：R917 文獻標識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.006

首薈通便膠囊主要成分囊括何首烏、蘆薈、決明子、枸杞子、阿膠、人參、白術、枳實8種，屬于通便排毒以及減肥降脂的國家專利組方之一[1-2]。該藥應用于功能性便秘的治療效果顯著，中醫(yī)辨證為氣陰兩虛兼毒邪內蘊證者，癥見便秘，腹脹，口燥咽干，神疲乏力，五心煩熱，舌質紅嫩或淡，舌苔白或白膩，脈沉細或滑數(shù)。具有瀉濁通便、養(yǎng)陰益氣的功效，有效促進患者胃腸功能的改善[3-4]。方中的何首烏以及蘆薈當屬君藥，具有潤腸通便、清肝瀉熱以及益精養(yǎng)血的功效;決明子與枸杞子以及阿膠均為臣藥，具有滋補肝腎、清肝明目、滋陰潤燥通便、補血止血的功效;人參與白術則為佐藥，具有補氣健脾的功效，且可促使瀉不傷正;并以枳實破氣消積，引經入藥[5-6]。共奏養(yǎng)陰益氣，補瀉兼施，標本兼治之功。此外現(xiàn)代藥理研究證實，蘆薈提取物可通過對鈉離子的主動轉運產生一定程度的影響，進一步影響機體腸道內的水分分泌以及吸收平衡，從而發(fā)揮潤腸通便的效果[7-8]。與此同時，組方中的其他相關中藥對于便秘亦有不同的藥理作用，如方中的人參、阿膠以及何首烏在滋補機體的基礎上，有效提高機體免疫力，從而為病情的恢復創(chuàng)造有利條件[9-10]。眾所周知，中藥的臨床治療效果在一定程度上取決于有效成分含量的高低，因此如何有效對中藥有效成分進行準確的測定顯得尤為重要，亦是保障臨床治療效果的有效途徑之一。鑒于此，本文通過研究高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（HPLC-MS/MS）同時測定首薈通便膠囊中8種成份的含量，旨在為首薈通便膠囊的質量控制提供行之有效的方案，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與藥品

1.1 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀，LC-2020型質譜儀，LC solution色譜工作站（均購自島津公司）。Agilent ZORBAX C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm;填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠;購自安捷倫公司）。Sartorius BP 211D型電子天平（購自Sartorius公司，精確度為0.000 01）。CQ250L-DST型超聲波清洗機（購自上海躍進醫(yī)用光學器械廠）。TGL-21M型高速冷凍離心機（購自湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 藥品及試劑 首薈通便膠囊（順益舒，魯南厚普制藥有限公司，國藥準字Z2015210041），對照品何首烏、蘆薈、決明子、枸杞子、阿膠、人參、白術、枳實均購自中國食品藥品檢定研究院，有效成分含量均>98%。乙腈為色譜純，水采用超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法及結果

2.1 色譜條件 采用Agilent ZORBAX C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），將乙腈（A）-10 mmol/L乙酸銨溶液（B）作為流動相。梯度洗脫（0～1.2 min，5%A;1.2～2 min，5%A→20%A;2～4 min，20%A→40%A;4～8 min，40%A;8～10 min，40%A→95%A;10～17 min，95%A;17～25 min，5%A），設置流速為0.8 mL/min，進樣量為5 μL。

2.2 質譜條件 使用儀器為電噴霧離子化源，電壓設置為3.5 kV，霧化器壓力241 kPa。以氮氣作為干燥氣，流速設置為1.5 L/min。離子噴霧溫度設置為350 ℃。正負離子方式同時監(jiān)測，將選擇離子檢測作為掃描方式。

2.3 相關溶液制備

2.3.1 對照品儲備液制備 分別取適量何首烏、蘆薈、決明子、枸杞子、阿膠、人參、白術、枳實對照品，實施精密稱定，加入甲醇制備為含何首烏10 μg/mL、蘆薈2 μg/mL、決明子20 μg/mL、枸杞子10 μg/mL、阿膠2 μg/mL、人參20 μg/mL、白術20 μg/mL、枳實2 μg/mL單一成分溶液。（其中何首烏中大黃素含量0.184 mg/g，蘆薈中蘆薈大黃素含量為0.03 μmol/g，決明子中橙黃決明素含量為1.20%，枸杞子中枸杞多糖含量為0.35 g/g，阿膠中強脯氨酸的含量為10.20%，人參中人參皂苷含量>98%，白術中蒼術酮含量為43.7%，枳實中橙皮苷的含量為12.00%）。

2.3.2 供試品溶液 精密稱取樣品粉末0.1 g，放置在50 mL離心管內，加入40 mL的甲醇，超聲（250 W，40 kHz）30 min，置于室溫條件下混勻，過濾，并精密吸取4 mL續(xù)濾液在5 mL量瓶內，加入甲醛定容，混勻后采用0.45 μm微孔濾膜濾過，采集續(xù)濾液。

2.3.3 陰性樣品溶液 根據(jù)首薈通便膠囊處方比例與制備工藝制備不含何首烏、蘆薈、決明子、枸杞子、阿膠、人參、白術、枳實的陰性樣品，并根據(jù)2.3.2的方式獲取陰性樣品溶液。

2.3.4 專屬性試驗 取混合對照品溶液，供試品溶液以及陰性樣品溶液各5 μL，于上述色譜質譜條件下完成測定。結果樣品色譜圖和對照品色譜圖一致的保留時間處存在相應的色譜峰。而陰性樣品色譜圖中無相應色譜峰，說明了樣品測定無干擾。

2.3.5 線性關系考察與檢測限、定量限測定 精密吸取對照品儲備液以及適量的內標溶液，加入甲醇逐步稀釋，制備各待測物質量濃度為0.003～20 μg/mL的7個不同濃度混合對照品溶液，根據(jù)上述色譜-質譜條件測量峰面積。此外將待測物質峰面積和內標峰面積的比值作為縱坐標（Y），各物質質量濃度作為橫坐標（X），從而繪制標準曲線，同時完成線性回歸計算，獲取相應的標準曲線回歸方程。結果發(fā)現(xiàn)不同成分于相應的線性范圍內存在良好的線性關系。結果見表1所示。大黃素、蘆薈大黃素、橙黃決明素、枸杞多糖、強脯氨酸、人參皂苷、蒼術酮、橙皮苷的線性范圍分別為0.04～2.50 μg/mL（r=0.999 8）、0.034～0.998 0 μg/mL（r=0.999 6）、0.14～20 μg/mL（r=0.999 4）、0.04～20 μg/mL（r=0.999 9）、0.004～2 μg/mL（r=0.999 9）、0.05～2 μg/mL（r=0.999 6）、0.034～2.5 μg/mL（r=0.999 3）、0.007～0.2 μg/mL（r=0.999 5）。

2.3.6 精密度實驗 精密吸取上述2.3.5的混合對照品溶液，根據(jù)上述色譜條件進行連續(xù)6次的進樣，測定峰面積并計算RSD。結果顯示大黃素、蘆薈大黃素、橙黃決明素、枸杞多糖、強脯氨酸、人參皂苷、蒼術酮、橙皮苷的RSD分別為1.2%、1.5%、1.7%、2.1%、1.6%、1.9%、1.4%、2.0%，說明該儀器的精密度較為理想。

2.3.7 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液分別在0、2、4、6、8及24 h進樣檢測，計算峰面積。結果顯示：大黃素、蘆薈大黃素、橙黃決明素、枸杞多糖、強脯氨酸、人參皂苷、蒼術酮、橙皮苷峰面積的RSD分別為1.5%、2.3%、1.7%、1.3%、1.9%、1.7%、2.0%、1.8%，表示供試品溶液于24 h內穩(wěn)定性較佳。

2.3.8 重復性試驗 取同批樣品6分，分別根據(jù)上述方式制備供試品溶液，并予以測定，劑量峰面積，計算樣品含量。結果顯示：大黃素、蘆薈大黃素、橙黃決明素、枸杞多糖、強脯氨酸、人參皂苷、蒼術酮、橙皮苷的平均含量分別為492.3、1 809.4、507.3、679.3、614、109、57及22 μg/g，RSD分別為1.0%、1.5%、1.5%、1.8%、1.4%、1.4%、2.0%、1.6%、說明該方式的重復性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品0.05 g，精密稱取后分別加入混合對照品溶液適量，根據(jù)上述方式完成供試溶液的制備，予以進樣測定，并完成回收率的計算。見表2。

2.3.10 樣品測定 分別取3批樣品，根據(jù)上述方式制備供試品溶液完成測定，參照內標法計算樣品中不同成分含量。3種樣品中大黃素、蘆薈大黃素、橙黃決明素、枸杞多糖、強脯氨酸、人參皂苷、蒼術酮、橙皮苷的含量分別為0.491～0.499、1.790～1.802、0.506～0.512、0.681～0.684、0.610～0.614、0.102～0.110、0.056～0.058、0.020～0.022 mg/g。見表3。

3 討論

HPLC-MS/MS具有較高的專屬性以及靈敏度，可于較短的時間內同時對多種藥物成分進行有效的分離，同時完成準確的定量分析，繼而可有效提高檢測效率[11-13]。目前該方法已被廣泛應用于如楓蓼腸胃康合劑、健脾益腎丸等中藥制劑的有效成分分析中，且效果較為明顯。既往，臨床上尚無關于首薈通便膠囊8種成分含量分析的研究報道。其中HPLC-MS/MS不僅具有較好的選擇性以及靈敏度，同時不要求被測的成分完全分離，這極其有利于分析相對復雜的重要復方制劑[14-16]，因此本文選用HPLC-MS/MS法對首薈通便膠囊的8種有效成分含量實施同時測定。與此同時，HPLC-MS/MS法在測定的過程中采用內標法，這可有效提高測定的精密度以及準確度。相較于多反應監(jiān)測模式，HPLC-MS/MS法所采用的SIM模式專屬性較低，從而會促使樣品選擇離子流圖中部分測定成分出現(xiàn)多個色譜峰。而本文通過紫外檢測器定位測定成分色譜峰的保留時間，從而在一定程度上彌補了上述不足[17-18]。

在對各項被測成分的質譜參數(shù)實施優(yōu)化的過程中發(fā)現(xiàn)，大黃素于正離子檢測模式下的相應相對較好，且易產生加合離子峰。其他7個有效成分則在負離子模式下的相應顯著高于正離子模式，于負離子檢測模式下易產生加合離子峰，因此本文確定選擇正負離子模式對首薈通便膠囊的8個成分進行同時檢測。本研究通過考察乙腈-水、乙腈-乙酸銨水溶液、乙腈-甲酸水溶液等流動相體系，結果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-乙酸銨水溶液為流動相時，樣品內的各成分色譜峰分離較佳，且有效提高其檢測靈敏度。因此本方法最終采用乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相。此外在提取方法的選擇過程中發(fā)現(xiàn)，超聲以及回流提取的效果并無明顯差異，因此選用了較為漸變的超聲提取方式[19-20]。另外在考察可不同提取溶劑后，結果發(fā)現(xiàn)甲醇的提取率最高，因此將其作為提取溶劑。

綜上所述，HPLC-MS/MS法同時檢測首薈通便膠囊8種成分含量中具有快速、準確、高效以及靈敏的優(yōu)勢，可作為測定首薈通便膠囊內在化學指標成分含量的有效手段之一。

參考文獻

[1] Ji H，Liu Y，He F，et al.LC-MS Based Urinary Metabolomics Study of the Intervention Effect of Aloe-emodin on Hyperlipidemia Rats[J].J Pharm Biomed Anal，2018，33（156）：104-115.

[2]Torres-Giner S，Wilkanowicz S，Melendez-Rodriguez B，et al.Nanoencapsulation of Aloe vera in Synthetic and Naturally Occurring Polymers by Electrohydrodynamic Processing of Interest in Food Technology and Bioactive Packaging[J].J Agric Food Chemm，2017，65（22）：4439-4448.

[3]吳旭.HPLC-MS/MS法測定新復方蘆薈膠囊中蘆薈苷的含量[J].中國藥物評價，2018，35（5）：336-338.

[4]高春會，梁平，史淑萍，等.首薈通便膠囊預防腫瘤化療所致便秘的臨床觀察[J].中國老年保健醫(yī)學，2019，17（4）：86-87.

[5]李冰冰，譚玉軍，姚景春，等.首薈通便膠囊對慢傳輸型便秘模型大鼠腸道推進率和結腸黏液分泌的影響[J].世界中醫(yī)藥，2018，13（9）：2268-2271.

[6]徐經芳.首薈通便膠囊治療腫瘤化療后便秘的療效觀察[J].中國保健營養(yǎng)，2016，26（25）：141-142.

[7]卓婧.通便類軟膠囊中蘆薈苷檢測方法的研究[J].家庭醫(yī)藥，2018，33（12）：194-195.

[8]李梅.復方蘆薈膠囊對消化道腫瘤患者鹽酸羥考酮緩釋片引起便秘的影響[J].長春中醫(yī)藥大學學報，2018，34（2）：309-311.

[9]關小筠.西沙比利片合復方蘆薈膠囊治療老年功能性便秘30例臨床觀察[J].中國民族民間醫(yī)藥，2017，26（4）：104-105.

[10] 王軍倉.HPLC法測定復方蘆薈膠囊中蘆薈苷的含量[J].西北藥學雜志，2017，32（1）：48-50.

[11]高洋洋，李小麗，曹葉，等.動物源性食品中硝基呋喃代謝物的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定法[J].職業(yè)與健康，2019，35（14）：1905-1910.

[12]Zheng Q，Wen MQ，Jia J，et al.Determination of the Content of 4-FMA in Rat Plasma Samples by HPLC-MS/MS Method[J].Fa Yi Xue Za Zhi，2019，35（4）：419-422.

[13]Desai R，Roadcap B，Goykhman D，et al.Determination of Doravirine in Human Plasma Using Liquid-liquid Extraction and HPLC-MS/MS[J].Bioanalysis，2019，11（16）：1495-1508.

[14]Cui C，Wang H，Wang Z，et al.An ultra HPLC-MS/MS method for quantification of hypidone hydrochloride（YL-0919）and application to a pharmacokinetic study[J].Bioanalysis，2019，11（13）：1243-1254.

[15]冷萍，孫加琳，趙振寰，等.高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定大鼠血漿中抗腫瘤化合物WJD-A-1及其藥動學研究[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2019，39（14）：1467-1471.

[16]崔佳麗，趙高瓊，梅晶，等.高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定人血中8種有毒生物堿[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析，2019，19（5）：513-517.

[17]金中淦，宗明，傅之妍，等.超高效液相色譜串聯(lián)質譜檢測α-羥基丁酸方法的建立[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2019，42（1）：57-62.

[18]周偉燕，趙海建，曾潔，等.美國CRMLN參考方法同位素稀釋液相色譜質譜法與我國高效液相色譜法測定甘油三酯的比對研究[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2019，42（6）：446-452.

[19]秦延平，黃丹丹，李綱，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法快速檢測自來水中18種抗生素[J].預防醫(yī)學，2019，31（8）：857-861.

[20]林捷，張彩云，柯華，等.花草茶中11種殺菌劑QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜快速測定法[J].職業(yè)與健康，2019，35（6）：748-751.

（2019-11-14收稿 責任編輯：王楊）

基金項目：國家自然科學基金面上項目（30300435）

作者簡介：彭艷（1984.10—），女，碩士，實驗師，研究方向：藥物分析，E-mail：462662398@qq.com

通信作者：陶箭飛（1967.10—），女，碩士，主任藥師，研究方向：臨床藥學，E-mail：lyptjfll@163.com