多酶催化串聯(lián)策略在復(fù)雜天然產(chǎn)物合成中的應(yīng)用

賀俊斌，孟松，潘海學(xué)，唐功利

（中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所，生命有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200032）

結(jié)構(gòu)新穎、復(fù)雜多樣的天然產(chǎn)物及其衍生物一直以來(lái)都是現(xiàn)代藥物的重要組成部分和新藥發(fā)現(xiàn)的重要源泉。研究表明，在1981—2014 年間上市的1500 多種小分子藥物中，超過(guò)50%的藥物直接或間接來(lái)源于天然產(chǎn)物及其衍生物，包括著名的抗瘧藥青蒿素和抗腫瘤藥紫杉醇［1］。然而，傳統(tǒng)的從植物、微生物及動(dòng)物中提取分離天然產(chǎn)物的方法往往存在步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、提取效率低等問(wèn)題，一定程度上制約了新型藥物的研發(fā)［2-3］。因此，人工合成具有重要生物活性、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、新穎的天然產(chǎn)物具有重要意義。

天然產(chǎn)物全合成主要包括化學(xué)合成和生物合成。自1828 年德國(guó)化學(xué)家W?hler 實(shí)現(xiàn)尿素的合成以來(lái)［4］，天然產(chǎn)物的化學(xué)全合成取得了輝煌的成就，化學(xué)家們不斷挑戰(zhàn)合成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物，完成了包括維生素B12、?？舅?、軟海綿素等一系列具有里程碑意義的全合成工作［5-9］。盡管人們能夠設(shè)計(jì)合成自然界存在的幾乎任何天然化合物，甚至可以合成理論存在但自然界尚未發(fā)現(xiàn)的設(shè)想的理論分子，但在一些含有多手性中心、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物化學(xué)全合成過(guò)程中也存在一些問(wèn)題，如合成步驟繁瑣（通常幾十步）、產(chǎn)率低（通常＜1%）、產(chǎn)物選擇性不強(qiáng)、反應(yīng)條件劇烈、需要昂貴試劑或所用有機(jī)溶劑易造成污染、難以實(shí)現(xiàn)大量合成等［10-11］。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，天然產(chǎn)物生物合成取得了巨大的進(jìn)展。以合成生物學(xué)、酶催化合成、組合生物合成為主的生物合成為復(fù)雜天然產(chǎn)物的全合成提供了有效策略［12-16］。其中，體外酶催化合成因其具有催化效率高、反應(yīng)選擇性強(qiáng)、產(chǎn)物專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)［17-20］，吸引了研究人員的關(guān)注。本文作者介紹了近年來(lái)采用體外酶催化方法合成復(fù)雜天然產(chǎn)物的相關(guān)研究進(jìn)展，重點(diǎn)介紹了多酶催化串聯(lián)法在復(fù)雜天然產(chǎn)物合成中的應(yīng)用研究進(jìn)展以及目前存在的問(wèn)題和解決對(duì)策。

1 多酶催化串聯(lián)法合成復(fù)雜天然產(chǎn)物

串聯(lián)反應(yīng)提供了一種新的合成思路，其體系是一套經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)的反應(yīng)系統(tǒng)，每一步反應(yīng)的產(chǎn)物都作為下一步反應(yīng)的底物，在整個(gè)反應(yīng)體系中初始底物經(jīng)過(guò)逐步催化后，會(huì)最終轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的功能分子。在復(fù)雜天然產(chǎn)物的全合成中設(shè)計(jì)串聯(lián)反應(yīng)體系具有可以節(jié)省原料、溶劑及催化劑用量、減少反應(yīng)時(shí)間、無(wú)需進(jìn)行每步反應(yīng)之間的分離純化步驟等眾多優(yōu)點(diǎn)［21］。因此，串聯(lián)反應(yīng)體系已成為天然產(chǎn)物全合成中的重要合成策略。

酶催化串聯(lián)反應(yīng)源于大自然中生命有機(jī)體為了維持生命過(guò)程而進(jìn)化出的各種代謝通路。本質(zhì)上，大自然中的生命體便是一個(gè)復(fù)雜精妙的一鍋多酶串聯(lián)體系，在這個(gè)串聯(lián)系統(tǒng)中，酶作為催化劑，在多個(gè)區(qū)間分別參與進(jìn)行不同的代謝合成反應(yīng)，多步反應(yīng)環(huán)環(huán)相扣，最終形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜、多種多樣的生物活性分子（天然產(chǎn)物）［22-24］。體外酶催化串聯(lián)反應(yīng)可以分為一鍋串聯(lián)、一鍋分步串聯(lián)以及分步串聯(lián)。一鍋串聯(lián)反應(yīng)步驟簡(jiǎn)單、無(wú)需分離中間體產(chǎn)物、合成效率高，但有時(shí)體系中存在的輔因子或產(chǎn)生的副產(chǎn)物可抑制某些酶的活性。對(duì)此，可采用一鍋分步串聯(lián)或分步串聯(lián)進(jìn)行解決。然而，一鍋分步串聯(lián)步驟相對(duì)繁瑣，需要目標(biāo)中間體產(chǎn)物產(chǎn)生后，才能進(jìn)行下一步串聯(lián)反應(yīng)。此外，分步串聯(lián)需要中間體產(chǎn)物的分離純化，且耗時(shí)較長(zhǎng)。但不管哪種串聯(lián)方式，相比于化學(xué)催化劑，酶作為催化劑的多酶催化串聯(lián)體系往往具有催化效率高、毒性小、反應(yīng)條件簡(jiǎn)單溫和以及容易控制、選擇性強(qiáng)（化學(xué)、立體和區(qū)域）、產(chǎn)物構(gòu)型專一、省時(shí)環(huán)保等特點(diǎn)，因而在藥物、精細(xì)化工品、食品、農(nóng)化產(chǎn)品等的合成生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用［17-19，23，25-26］。隨著測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳操作等技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)越來(lái)越多結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物的生物合成途徑得到解析，在此基礎(chǔ)上研究者們也采用多酶催化串聯(lián)法成功合成了許多具有重要活性的天然產(chǎn)物。本節(jié)就近年來(lái)多酶催化串聯(lián)策略在復(fù)雜天然產(chǎn)物合成中的應(yīng)用作一介紹。

1.1 聚酮類化合物

腸道菌素（enterocin，1）是由日本科學(xué)家于1975年分離于鏈霉菌（Streptomycessp.）的一種聚酮類抗生素，具有良好的抗菌活性［27］。隨后人們從海洋微生物S.maritimus中也分離得到腸道菌素（1）以及聚酮類化合物wailupemycins［28］。Moore課題組［28-30］一直從事腸道菌素（1）的生物合成途徑、體外酶催化合成以及類似物合成研究，通過(guò)異源表達(dá)生物合成基因簇、基因敲除以及體外酶催化實(shí)驗(yàn)成功解析了腸道菌素（1）的生物合成途徑。腸道菌素（1）的生物合成來(lái)源于1 分子的苯甲酸（benzoic acid）和7 分子的丙二酸單酰輔酶A（malonyl-CoA），其生物合成基因簇中并不包括編碼環(huán)化酶或芳香化酶的基因，而是包含一個(gè)編碼黃素依賴的氧化酶基因（encM），該基因負(fù)責(zé)催化類Favorskii 氧化重排反應(yīng)從而形成腸道菌素（1）獨(dú)特的籠狀三環(huán)和吡喃酮結(jié)構(gòu)。在解析腸道菌素（1）的生物合成途徑后，該課題組通過(guò)表達(dá)純化腸道菌素（1）生物合成途徑中的關(guān)鍵酶以及利用商業(yè)化的輔因子蛋白，采用一鍋分步串聯(lián)在體外成功合成了腸道菌素（1），其總產(chǎn)率約25%［31］。值得一提的是，在體外一鍋串聯(lián)EncA/B、EncC、EncD 和EncN 蛋白時(shí)，其產(chǎn)物主要以wailupemycin F（2）和wailupemycin G（3）為主。隨后該課題組又通過(guò)不同酶相互串聯(lián)以及以苯甲酸類似物為底物，成功在體外酶法全合成了8個(gè)5-deoxyenterocin（4）類似物和16 個(gè)wailupemycin 類似物，其中包括18 個(gè)新化合物［32］。腸道菌素（1）的生物合成、體外酶催化合成以及類似物研究為后來(lái)復(fù)雜天然產(chǎn)物的生物合成研究提供了很好的思路（圖1）。

Gilvocarcins是S.griseoflavusG?3592 及其他鏈霉菌產(chǎn)生的一系列具有苯并［d］萘［1，2-b］吡喃-6-酮骨架結(jié)構(gòu)的非典型角蒽環(huán)聚酮化合物，具有顯著的抗腫瘤活性［33-34］。 臘伯羅霉素（rabelomycin，5）和defucogilvocarcin M（6）是gilvocarcin 生物合成途徑中的兩個(gè)中間體［35-36］。臘伯羅霉素（5）是1970 年分離于橄欖色鏈霉菌S.olivaceusATCC 21549 發(fā)酵液中的一種角蒽環(huán)類抗生素，具有良好的抗革蘭氏陽(yáng)性菌活性［37］。Rohr課題組［38］利用不同生物合成途徑來(lái)源的聚酮合酶，即來(lái)源于gilvocarcin、ravidomycin 和杰多霉素（jadomycin）生物合成途徑，采用多酶催化串聯(lián)一鍋法以乙酰輔酶A（acetyl-coA）和丙二酸單酰輔酶A 為底物在體外成功合成了抗生素臘伯羅霉素（5）。該體系包括6 個(gè)酶：酮基合成酶KSα和鏈長(zhǎng)因子KSβ融合的蛋白JadAB、?；d體蛋白質(zhì)RavC、?；d體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)酰基酶GilP、聚酮合酶相關(guān)的酮基還原酶GilF、兩個(gè)環(huán)化酶RavG 和JadD，經(jīng)一鍋反應(yīng)2h，臘伯羅霉素（5）的產(chǎn)率可達(dá)80%（圖2）。在此基礎(chǔ)上，該課題組又將6個(gè)不同來(lái)源的后修飾酶（3 個(gè)加氧酶GilOI、GilOII 和JadF、2 個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶GilM 和GilMT 以及1 個(gè)氧化還原酶GilR）與上述聚酮合酶進(jìn)行串聯(lián)，并加入了輔因子再生所需的黃素還原酶（flavin reductase）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase）；通過(guò)15 個(gè)酶進(jìn)行串聯(lián)催化，一鍋法在體外成功合成了defucogilvocarcin M（6）［36］。臘伯羅霉素（5）和defucogilvocarcin M（6）的體外全酶法合成進(jìn)一步闡明了gilvocarcin生物合成途徑中的氧化重排反應(yīng)，同時(shí)也為角蒽環(huán)聚酮化合物的全合成提供了新的策略。

司替霉素（steffimycin）是1967 年分離于斯特菲斯堡鏈霉菌（S.steffiburgensis）的一種蒽環(huán)類抗生素，具有顯著的抑癌作用；presteffimycinone（7）是其生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵中間體［39-41］。同樣地，利用光輝霉素（mithramycin）、gilvocarcin和司替霉素生物合成途徑中的不同聚酮合酶和后修飾酶，以乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A（由丙二酰輔酶A：?；d體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)?；窶atB合成）為底物，通過(guò)多酶催化串聯(lián)一鍋法在體外成功合成了presteffimycinone（7），其對(duì)確定司替霉素生物合成途徑中環(huán)化酶StfX 和酮基還原酶StfT 的催化順序提供了新的參考（圖2）［39-40］。類似地，聚酮類抗生素特曲霉素（tetracenomycins）也通過(guò)體外全酶法催化合成［42-43］。

圖1 多酶催化串聯(lián)法合成腸道菌素（1）和wailupemycinsFig.1 Multienzyme-catalyzed tandem synthesis of enterocin(1)and wailupemycins

1.2 生物堿類化合物

賽洛西賓（psilocybin，8）又名裸頭草堿、裸蓋菇素、光蓋菇素，最早分離于致幻蘑菇Psilocybe屬，是一種具有神經(jīng)致幻作用的神經(jīng)毒素，結(jié)構(gòu)上屬于吲哚生物堿類（色胺衍生物）［44-45］。研究表明，賽洛西賓（8）具有潛在的治療抑郁癥等精神疾病以及藥物上癮的效果，目前正在進(jìn)行治療抑郁癥的Ⅱ期臨床試驗(yàn)［46-47］。盡管賽洛西賓（8）在減輕抑郁癥及相關(guān)疾病方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，但其生物合成途徑一直以來(lái)未被解析。最近，F(xiàn)ricke等［48］通過(guò)體外酶催化實(shí)驗(yàn)以及生物轉(zhuǎn)化成功解析了賽洛西賓（8）的生物合成途徑，其主要有4個(gè)酶參與：色氨酸脫羧酶PsiD、細(xì)胞色素P-450 單加氧酶PsiH、激酶PsiK 和甲基轉(zhuǎn)移酶PsiM。進(jìn)一步的體外多酶催化串聯(lián)一鍋法研究發(fā)現(xiàn)，以4-羥基-L-色氨酸（4-hydroxy-L-tryptophan）為底物，利用PsiD、PsiK和PsiM 三個(gè)酶即可在體外實(shí)現(xiàn)賽洛西賓（8）的酶法全合成（圖3），產(chǎn)率約26%。賽洛西賓（8）的體外酶法全合成研究進(jìn)一步體現(xiàn)了多酶催化串聯(lián)法在藥物合成中的重要應(yīng)用價(jià)值。

圖2 Gilvocarcin V和司替霉素的結(jié)構(gòu)式及多酶催化串聯(lián)法合成臘伯羅霉素（5）、defucogilvocarcin M（6）和presteffimycinone（7）Fig.2 Chemical structures of gilvocarcin V and steffimycin and the multienzyme-catalyzed tandem synthesis of rabelomycin(5),defucogilvocarcin M(6)and presteffimycinone(7)

圖3 多酶催化串聯(lián)法合成賽洛西賓（8）Fig.3 Multienzyme-catalyzed tandem synthesis of psilocybin(8)

芐基異喹啉生物堿（benzylisoquinoline alkaloids）是一類結(jié)構(gòu)多樣的重要天然產(chǎn)物，具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、心血管保護(hù)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等方面的藥理活性，如目前廣泛使用的鎮(zhèn)痛藥嗎啡和可待因、抗癌藥長(zhǎng)春花堿以及具有抗菌消炎作用的小檗堿等［49-50］。芐基異喹啉生物堿目前主要從開(kāi)花植物中提取獲得，但存在植物資源匱乏、含量低、提取難度大、純度低等問(wèn)題；此外，化學(xué)全合成又受到產(chǎn)物手性的限制［49，51］。生物合成途徑上，芐基異喹啉生物堿的合成一般以氨基酸作為初始前體，如酪氨酸，再經(jīng)過(guò)一系列的羥化、脫羧、甲基化、Pictet-Spengler 縮合以及氧化還原等酶催化反應(yīng)生成不同的化合物［52］。最近，Wang 等［53］通過(guò)多酶催化串聯(lián)反應(yīng)成功實(shí)現(xiàn)了芐基異喹啉生物堿的體外酶法全合成。研究人員首先通過(guò)克隆表達(dá)與功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，篩選獲得了來(lái)源于Candidatus Nitrosopumilus salariaBD31 中的酪氨酸酶CnTYR和糞腸球菌（Enterococcus faecalisDC32）的酪氨酸脫羧酶EfTyrDC，隨后將它們與來(lái)源于紫色桿菌 （Chromobacterium violaceum） 的轉(zhuǎn)氨酶CvTAm 和來(lái)源于黃唐松草（Thalictrum flavum）的去甲烏藥堿合成酶TfNCS 進(jìn)行組合，以L-酪氨酸及其衍生物為底物，通過(guò)酶催化串聯(lián)一鍋法或分步串聯(lián)在體外成功合成了8 個(gè)高立體選擇性的芐基異喹啉生物堿［（9）～（16）］，包括6 個(gè)非天然生物堿；其轉(zhuǎn)化產(chǎn)率約35%～99%，分離產(chǎn)率約23%～66%（圖4）。其中，化合物13 能達(dá)到克級(jí)別規(guī)模的合成，為復(fù)雜天然產(chǎn)物的規(guī)?；苽涮峁┝酥匾?。

Thaxtomin 是瘡痂病菌代謝產(chǎn)生的一類植物毒素，最早是在1989 年分離于感染瘡痂病的土豆切片中；thaxtomin 系列化合物是一類含有4-硝基吲哚的二酮哌嗪分子，其化學(xué)結(jié)構(gòu)的顯著特征是4-硝基吲哚和C-羥基-2，5-二酮哌嗪環(huán)，差別在于N-甲基、酚羥基以及二酮哌嗪環(huán)上羥基的存在與否以及取代與否［54］。因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)組成單元，thaxtomin 家族化合物［（17）～（21）］尤其是thaxtomin A（17）作為除草劑和挑選耐受瘡痂病的土豆品種的篩選劑在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值［55］。然而在化學(xué)全合成thaxtomin 中仍存在立體或區(qū)域選擇等挑戰(zhàn)，而生物合成為其提供了更有效的策略［56-58］。Jiang 等［57］首先通過(guò)體外酶催化實(shí)驗(yàn)，確定了thaxtomin 生物合成途徑中TxtA、TxtB和TxtC 三個(gè)酶的功能并考察了它們的底物譜，其中TxtA 和TxtB 是兩個(gè)非核糖體肽合成酶，它們催化苯丙氨酸和4-硝基色氨酸合成N，N-二甲基二酮哌嗪環(huán)并具有底物寬泛性，而TxtC 是一個(gè)細(xì)胞色素P-450酶，其可以催化thaxtomin D（20）的C-14和C-20 位發(fā)生羥基化反應(yīng)。隨后研究人員們將這三個(gè)酶與thaxtomin 生物合成途徑中負(fù)責(zé)催化L-色氨酸（L-tryptophan）C-4 位發(fā)生硝基化反應(yīng)的P-450酶TxtE（嵌合蛋白TB14）進(jìn)行串聯(lián)，成功在體外通過(guò)酶催化全合成了thaxtomin化合物（圖5）。起初將TB14、TxtA、TxtB以及TxtC進(jìn)行串聯(lián)，以L-色氨酸和L-苯丙氨酸（L-phenylalanine）為底物一鍋法合成thaxtomin 化合物，但總轉(zhuǎn)化產(chǎn)率低于9%，可能與反應(yīng)體系中存在的NADPH再生體系有關(guān)。隨后他們采用分步串聯(lián)的策略，即首先串聯(lián)TB14、TxtA 和TxtB 三個(gè)酶，然后再加入TxtC，thaxtomin 的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率可達(dá)47%。通過(guò)多酶催化串聯(lián)一鍋法或分步串聯(lián)一鍋法策略，以L-色氨酸、L-苯丙氨酸以及它們的類似物為底物，Jiang 等［57］在體外實(shí)現(xiàn)了124 個(gè)thaxtomin 化合物的酶催化全合成，且研究表明部分化合物具有顯著的除草活性（IC50值小于2 μmol/L）。Thaxtomin化合物的體外酶法全合成進(jìn)一步體現(xiàn)了酶作為催化劑在豐富天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性方面的重要作用。

圖4 多酶催化串聯(lián)法合成芐基異喹啉生物堿[（9）～（16）]Fig.4 Multienzyme-catalyzed tandem synthesis of benzylisoquinoline alkaloids[(9)～(16)]

雙環(huán)霉素（bicyclomycin，22）是日本科學(xué)家于1972 年從鏈霉菌中分離獲得的一種抗生素，具有顯著的抗革蘭氏陰性菌活性，也是目前已知的唯一來(lái)源于天然產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄終止因子Rho蛋白的選擇性抑制劑［59-61］。雙環(huán)霉素（22）屬于氧雜橋環(huán)二酮哌嗪類化合物，其結(jié)構(gòu)特異，可分為三部分：［4，2，2］-氧雜橋環(huán)骨架、C1 三羥基基團(tuán)以及C5＝C5a環(huán)外亞甲基（圖6）。作為一種具有橋環(huán)三維結(jié)構(gòu)、脂肪鏈被高度氧化修飾的活性天然產(chǎn)物，雙環(huán)霉素（22）自發(fā)現(xiàn)以來(lái)就引起了有機(jī)合成化學(xué)家的極大興趣，其最高效且立體專一性的化學(xué)全合成是由Williams等［62-63］完成，整個(gè)合成路線有12步，總產(chǎn)率約為4%～5%。作者課題組一直從事復(fù)雜天然產(chǎn)物的生物合成研究，最近通過(guò)采用在體外重構(gòu)所有酶催化反應(yīng)的策略成功解析了雙環(huán)霉素（22）的生物合成途徑［64］。雙環(huán)霉素（22）的生物合成途徑包含7 個(gè)酶：1 個(gè)環(huán)二肽合酶BcmA、5 個(gè)非血紅素鐵依賴的雙加氧酶BcmB/C/E/F/G和1個(gè)細(xì)胞色素P-450 單加氧酶BcmD。其詳細(xì)途徑在體外通過(guò)逐個(gè)酶催化的方法解析如下：首先，BcmA 催化一分子異亮氨酰tRNA 和一分子亮氨酰tRNA 縮合并環(huán)化，形成雙環(huán)霉素（22）骨架環(huán)異亮氨酸亮氨酸（cIL）；隨后在BcmE、BcmC 和BcmG 催化的連續(xù)羥化反應(yīng)以及BcmB催化的脫氫-環(huán)氧化作用下，形成具有［4，2，2］-雙環(huán)骨架的氧雜橋環(huán)；最后經(jīng)BcmD 催化的羥化反應(yīng)和BcmF 催化的脫氫反應(yīng)形成最終的產(chǎn)物雙環(huán)霉素（圖6）。在此基礎(chǔ)上，以環(huán)二肽cIL 為底物，筆者課題組通過(guò)采用分步串聯(lián)策略，即BcmE 首先催化cIL 發(fā)生羥化反應(yīng)，隨后同時(shí)加入BcmB、BcmC、BcmD、BcmF和BcmG，一鍋法在體外實(shí)現(xiàn)了雙環(huán)霉素（22）的酶法全合成。雙環(huán)霉素（22）的生物合成途徑中包括了連續(xù)多步惰性C—H鍵活化，以及在C—H鍵活化基礎(chǔ)上的一步脫氫-環(huán)氧化-橋環(huán)形成過(guò)程，其體外酶法全合成的實(shí)現(xiàn)為構(gòu)筑含有多手性中心中鏈氧雜橋環(huán)的分子提供了的新途徑。

圖5 Thaxtomins的生物合成途徑Fig.5 Biosynthetic pathway of thaxtomins

1.3 萜類和甾體類化合物

赤霉素類（gibberellins，GAs）化合物是一類具有重要生理活性的植物激素，它們參與許多植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，如種子發(fā)芽、莖干延長(zhǎng)、誘導(dǎo)開(kāi)花、性別分化等，目前在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、釀造業(yè)、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用［65］。赤霉素類化合物在結(jié)構(gòu)上屬于四環(huán)二萜，其生物合成途徑目前基本被闡明。同植物其他萜類化合物的生物合成途徑，赤霉素類化合物的生物合成分為3個(gè)過(guò)程：牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）的合成，其主要是由乙酰輔酶A 通過(guò)甲羥戊酸（mevalonate）途徑或甲基赤藻糖磷酸途徑合成；GA12-醛的合成，其是由GGPP經(jīng)古巴焦磷酸合成酶（copalyl pyrophosphate synthase，CPS）、內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶（ent-kaurene synthase，KS）、內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶（ent-kaurenoic acid oxidase，KAO）以及內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶（ent-kaurene oxidase，KO）催化合成；赤霉素類化合物的合成，包括多步的氧化以及氧化去飽和過(guò)程［65］。

2011 年，Sugai 等［66］成功實(shí)現(xiàn)了赤霉素GA4（23）的體外酶法全合成（圖7）。研究人員首先以乙酸鈉（sodium acetate）為起始底物，通過(guò)甲羥戊酸途徑中4個(gè)酶的催化，在體外成功合成了甲羥戊酸，產(chǎn)率約54%。隨后以甲羥戊酸為底物，串聯(lián)6個(gè)生物合成相關(guān)的酶，成功在體外合成了關(guān)鍵前體化合物內(nèi)根-貝殼杉烯（ent-kaurene），產(chǎn)率約3%；而將這10個(gè)酶串聯(lián)起來(lái)也可以通過(guò)一鍋法全合成內(nèi)根-貝殼杉烯，但產(chǎn)率僅為0.3%。最后，研究人員將分離得到內(nèi)根-貝殼杉烯為底物，在反應(yīng)體系中加入兩個(gè)P-450氧化酶KO 和KAO 以及兩個(gè)非血紅素鐵依賴的氧化酶20ox 和3ox，成功合成了赤霉素GA4（23）。同樣地，將上述14 個(gè)酶進(jìn)行串聯(lián)通過(guò)一鍋法全合成GA4（23）時(shí)，產(chǎn)率為0.15%。

圖6 雙環(huán)霉素（22）的生物合成途徑（a）和體外酶催化合成（b）Fig.6 Biosynthetic pathway(a)and in vitro multienzyme-catalyzed synthesis(b)of bicyclomycin(22)

熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA，24）屬甾體膽酸類化合物，在臨床上主要用于治療膽結(jié)石、膽汁淤積性肝病、肝炎、脂肪肝等相關(guān)疾?。?7］。UDCA（24）目前主要是由?；蝙Z等動(dòng)物的膽汁中提取的鵝去氧膽酸（epimer chenodeoxycholic acid，CDCA）通過(guò)化學(xué)半合成獲得，但其產(chǎn)量并不能有效滿足臨床需求；生物合成中UDCA（24）則是由羥甾類脫氫酶類（hydroxysteroid dehydrogenases，HSDHs）催化CDCA轉(zhuǎn)化產(chǎn)生［68-69］。華東理工大學(xué)的許建和課題組［68］最近通過(guò)采用酶催化串聯(lián)一鍋法在體外成功實(shí)現(xiàn)了CDCA到UDCA的高效轉(zhuǎn)化。研究人員首先鑒定了一個(gè)來(lái)源于扭鏈瘤胃球菌（Ruminococcus torquesATCC 35915）的自養(yǎng)型羥甾類脫氫酶7β-HSDHRt，隨后將該酶與來(lái)源于Clostridium absonum的自養(yǎng)型羥甾類脫氫酶7α-HSDHCa進(jìn)行串聯(lián)，在體外一鍋法實(shí)現(xiàn)了從CDCA到UDCA（24）的合成，產(chǎn)率約73%，但同時(shí)存在中間體產(chǎn)物7-O-石膽酸（7-oxolithocholic acid，7-oxo-LCA）約5%。為了減少體系中中間體副產(chǎn)物的產(chǎn)生，研究人員隨后將7α-HSDHCa替換為來(lái)源于大腸桿菌（Escherichia coli）的7α-HSDHEc，采用分步串聯(lián)一鍋法進(jìn)行UDCA（24）的合成，即首先由7α-HSDHEc和乳酸脫氫酶LDH進(jìn)行CDCA的第一步氧化反應(yīng)，待CDCA 完全轉(zhuǎn)化后對(duì)7α-HSDHEc和LDH進(jìn)行煮沸滅活；再加入7β-HSDHRt和葡萄糖脫氫酶GDH 進(jìn)行第二步還原反應(yīng)。通過(guò)分步串聯(lián)一鍋法，UDCA（24）的產(chǎn)率可高達(dá)98%（圖8）。

圖7 多酶催化串聯(lián)法合成赤霉素GA4（23）Fig.7 Multienzyme-catalyzed tandem synthesis of gibberellin A4(23)

圖8 多酶催化串聯(lián)法合成熊去氧膽酸（24）Fig.8 Multienzyme-catalyzed tandem synthesis of ursodeoxycholic acid(24)

盡管實(shí)現(xiàn)了UDCA（24）的酶法高效合成，但上述酶催化串聯(lián)反應(yīng)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其體系中副產(chǎn)物7-oxo-LCA 會(huì)還原為CDCA，同時(shí)熱處理滅活7α-HSDHEc又耗時(shí)繁瑣，大大限制了該法進(jìn)一步的工業(yè)化應(yīng)用研究。對(duì)此，許建和課題組［69］又采用了固定化酶技術(shù)對(duì)UDCA 的酶法合成體系進(jìn)行了優(yōu)化。固定化酶技術(shù)是用物理法或化學(xué)法，將游離酶人工固定在特定載體上進(jìn)行特有的催化作用，可回收并長(zhǎng)時(shí)間使用的一種技術(shù)。固定化酶較游離酶具有穩(wěn)定性高、易于控制、可反復(fù)使用、回收方便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，因此在生物工程、醫(yī)學(xué)、能源開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域具有重要作用［70-71］。許建和課題組首先篩選了不同的固定化方法，最后將7α-HSDHEc和LDH、7β-HSDHRt-M1（突變體T189V/V207I）和GDH 分別在環(huán)氧化樹(shù)脂ES-103 上進(jìn)行了共固定化，并對(duì)固定化條件進(jìn)行了優(yōu)化。隨后研究人員設(shè)計(jì)了一種流動(dòng)式填充床反應(yīng)器，以固定化酶LDH-7α-HSDH@ES-103 和7β-HSDH-GDH@ES-103 為催化劑，通過(guò)優(yōu)化填充床反應(yīng)器系統(tǒng)條件，實(shí)現(xiàn)了CDCA 到UDCA（24）的高效轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化產(chǎn)率高達(dá)100%，時(shí)空產(chǎn)率約88.5 g/（L·d）（圖8）［69］。這樣一個(gè)將固定化技術(shù)與酶催化串聯(lián)法結(jié)合大量合成UDCA（24）的實(shí)例為復(fù)雜天然產(chǎn)物的規(guī)?；苽涮峁┝诵碌乃悸?。

1.4 大環(huán)內(nèi)酰胺類化合物

多環(huán)特特拉姆酸大環(huán)內(nèi)酰胺（polycyclic tetramate macrolactams，PoTeMs）是一類具有特特拉姆酸結(jié)構(gòu)單元及多環(huán)體系的大環(huán)內(nèi)酰胺類化合物，具有多樣的生物學(xué)活性［72］。斑鳩霉素（ikarugamycin，25）是第一個(gè)報(bào)道的5/6/5 三環(huán)PoTeMs 化合物， 1972 年從嗜色鏈霉菌（S.phaeochromogenes）中首次分離獲得，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗原蟲、抗?jié)兊壬锘钚裕?3-74］。此外，斑鳩霉素（25）還可抑制巨噬細(xì)胞中氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的攝取以及HIV-1 Nef 誘導(dǎo)的細(xì)胞表面CD4 受體蛋白的下調(diào)，被認(rèn)為是一種網(wǎng)格蛋白依賴性的內(nèi)吞抑制劑［75-76］。斑鳩霉素（25）因其多樣的生物活性自發(fā)現(xiàn)以來(lái)就引起了有機(jī)合成化學(xué)家對(duì)其全合成的探索。然而，斑鳩霉素（25）結(jié)構(gòu)的高度復(fù)雜性在很大程度上限制了高效化學(xué)合成方法的探索，目前化學(xué)全合成產(chǎn)率小于1%［72，77］。斑鳩霉素（25）的生物合成途徑由三個(gè)酶負(fù)責(zé)催化：雜合聚酮合酶IkaA（iPKS/NRPS）負(fù)責(zé)形成特特拉姆酸（26）、氧化還原酶IkaB 負(fù)責(zé)5/6 雙環(huán)體系的形成、乙醇脫氫酶IkaC 則負(fù)責(zé)斑鳩霉素（25）中內(nèi)5 元環(huán)的形成［72，74］。此外，斑鳩霉素（25）中的環(huán)己烯基單元可能是通過(guò)自發(fā)的Diels-Alder 反應(yīng)合成［72，74］。Greunke 等［72］通過(guò)采用酶催化串聯(lián)一鍋法在體外成功實(shí)現(xiàn)了斑鳩霉素（25）的全合成（圖9）。研究人員首先成功表達(dá)了來(lái)源于Streptomycessp.Tü6239 的蛋白IkaA 和IkaB以及來(lái)源于Salinispora arenicolaCNS-205的同源蛋白IkaC。隨后以乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A和L-鳥氨酸（L-ornithine）為底物，在反應(yīng)體系中同時(shí)加入IkaA、IkaB 和IkaC 以及相關(guān)輔因子，實(shí)現(xiàn)了斑鳩霉素（25）的體外酶法全合成，產(chǎn)率約9%。此外，為了減少成本，研究人員將IkaA、IkaB和IkaC與合成乙酰輔酶A的乙酸激酶AckA和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶Pta 以及與丙二酸單酰輔酶A 合成酶MatB 進(jìn)行串聯(lián)，一鍋法在體外也成功實(shí)現(xiàn)了斑鳩霉素（25）的酶法全合成。僅利用3個(gè)酶，就可構(gòu)筑斑鳩霉素（25）中15 個(gè)C—C 鍵、2 個(gè)C—N 鍵以及8個(gè)手性中心的形成，充分展示了酶催化的神奇之處，也充分體現(xiàn)了酶作為催化劑在復(fù)雜天然產(chǎn)物全合成中發(fā)揮的強(qiáng)大作用。

圖9 斑鳩霉素（25）的生物合成途徑Fig.9 Biosynthetic pathway of ikarugamycin(25)

1.5 UK-2A類似物

Fenpicoxamid（商品名Inatreq）是陶氏益農(nóng)公司最新研發(fā)的一種新型吡啶酰胺類農(nóng)用殺菌劑，其被真菌吸收后可在體內(nèi)重新轉(zhuǎn)化為UK-2A［78］。UK-2A 可特異性地抑制電子傳遞鏈泛醌Q1，阻斷線粒體呼吸作用從而發(fā)揮抗真菌作用，且無(wú)交叉耐藥性［79］。研究表明，UK-2A 的抗真菌活性主要來(lái)源于其C-3 位的3'-羥基-4'-甲氧基吡啶酸結(jié)構(gòu)單元［80-81］。近日，Tan 等［82］通過(guò)多酶催化串聯(lián)法成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)UK-2A 藥效官能團(tuán)C-3-吡啶甲酸結(jié)構(gòu)的定向改造。研究人員首先通過(guò)挖掘分析UK-2A 的生物合成基因簇并結(jié)合體外酶催化實(shí)驗(yàn)鑒定了7 個(gè)關(guān)鍵基因，闡明了UK-2A 的生物合成途徑。其中，C-3-吡啶甲酸結(jié)構(gòu)的合成是通過(guò)腺嘌呤苷酸結(jié)合蛋白UkaF 將3-羥基吡啶酸（3'-hydroxypicolinic acid）上載至肽基載體蛋白UkaG 上，然后經(jīng)P-450 酶UkaL 和甲基轉(zhuǎn)移酶UkaN 的修飾形成最后的C-3 位結(jié)構(gòu)片段。同時(shí)，考察UkaF 的底物譜發(fā)現(xiàn)其具有寬泛的底物雜泛性，可識(shí)別13 種水楊酸（salicylic acids）及其衍生物。隨后，研究人員通過(guò)多酶催化串聯(lián)一鍋法，以3-羥基吡啶酸或13 種水楊酸及其衍生物為底物，在體外成功合成了14 個(gè)新的脫?；鵘K-2A（deacyl UK-2A，DAUK-2A）類似物［（27）～（40）］，轉(zhuǎn)化產(chǎn)率高達(dá)100%；首次實(shí)現(xiàn)了UK-2A 的C-3 位官能團(tuán)的高效定向改造（圖10）。

圖10 多酶催化串聯(lián)法合成UK-2A類似物Fig.10 Multienzyme-catalyzed tandem synthesis of UK-2A analogues

1.6 核苷類化合物

核苷類似物islatravir（原名MK-8591，41）是美國(guó)默克公司研發(fā)的一種HIV 逆轉(zhuǎn)錄酶移位抑制劑，目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)研究，其非凡的功效和長(zhǎng)效的作用有望在降低HIV治療次數(shù)和暴露前預(yù)防感染中發(fā)揮作用［83-84］。Islatravir（41）主要通過(guò)化學(xué)合成獲得，但化學(xué)合成存在步驟繁瑣（需要12～18 步）且效率低等問(wèn)題，主要在于難以控制2'-脫氧核糖的立體選擇性［85-86］。鑒于此，Huffman等［87］在天然細(xì)菌核苷補(bǔ)救途徑的啟發(fā)下，采用逆向合成思路，通過(guò)定向進(jìn)化改造五種天然酶使其作用于非天然底物，并通過(guò)采用多酶催化串聯(lián)一鍋法成功實(shí)現(xiàn)了islatravir（41）的經(jīng)濟(jì)高效合成（圖11）。

圖11 多酶催化串聯(lián)法合成islatravir（41）Fig.11 Multienzyme-catalyzed tandem synthesis of islatravir(41)

細(xì)菌核苷補(bǔ)救途徑為脫氧核糖核苷提供了逆向合成方法，該過(guò)程主要使用三種酶降解嘌呤2'-脫氧核糖核苷：嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase，PNP）用磷酸替換核苷堿基得到脫氧核糖1-磷酸；隨后磷酸戊糖變位酶（phosphopentomutase，PPM）將磷酸鹽轉(zhuǎn)移至5位；所得的5-磷酸糖在5-磷酸脫氧核糖醛縮酶（deoxyribose 5-phosphate aldolase，DERA）催化下將醛醇縮醛裂解為3-磷酸甘油醛和乙醛。當(dāng)逆向合成時(shí)，該過(guò)程即可從簡(jiǎn)單的起始底物合成核苷［88-89］。基于此，研究人員充分利用了酶催化反應(yīng)的可逆性，采用逆向合成策略進(jìn)行islatravir（41）的合成。然而，islatravir（41）結(jié)構(gòu)中具有的炔基取代基和氟取代基不易被天然酶所識(shí)別。對(duì)此，研究人員首先對(duì)核苷補(bǔ)救途徑中的三種酶進(jìn)行了探索研究。通過(guò)定向進(jìn)化改造來(lái)源于E.coli的PNP 和PPM 以及來(lái)源于希瓦氏菌（Shewanella halifaxensis）的DERA，成功獲得了對(duì)非天然底物具有高活性高耐鹽的PNPRd5BB突變體和高活性的PPMRd3BB突變體，其活性較野生型酶分別提高了70 倍和350 倍；同時(shí)也獲得了高選擇性以及對(duì)乙醛高耐受的DERARd3BB突變體。由于PNP 和PPM 串聯(lián)的反應(yīng)被副產(chǎn)物磷酸鹽所抑制，研究人員向反應(yīng)體系中加入了蔗糖磷酸化酶（sucrose phosphorylase，SP）和蔗糖（sucrose），以消耗副產(chǎn)物無(wú)機(jī)磷酸鹽，推動(dòng)反應(yīng)平衡。為了合成3-磷酸-2-炔基甘油醛（42），研究人員選擇了對(duì)2-乙炔基甘油（43）先氧化再磷酸化的路線。通過(guò)對(duì)E. coli來(lái)源的泛酸激酶（pantothenate kinase，PanK）定向進(jìn)化并將其與海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）來(lái)源的熱穩(wěn)定乙酸激酶（acetate kinase，AcK）配對(duì)，提高了PanK 的活性（較野生型提高100 倍）和穩(wěn)定性，并實(shí)現(xiàn)了PanK 所需輔因子腺苷三磷酸的再生。在氧化還原酶的篩選中，研究人員鑒定了禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）來(lái)源的半乳糖氧化酶突變體（galactose oxidase，GOase）并對(duì)其進(jìn)行定向進(jìn)化，獲得了具有高活性高選擇性的GOaseRd13BB突變體。需要注意的是，GOase 催化的反應(yīng)體系需要額外的過(guò)氧化氫酶和辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）。

實(shí)現(xiàn)了從2-乙炔基甘油（43）到islatravir（41）合成的每一步反應(yīng)后，研究人員設(shè)計(jì)了一個(gè)3 步9 酶催化串聯(lián)反應(yīng)（圖11）。但由于反應(yīng)體系中引入的酶量較大，對(duì)終產(chǎn)物的過(guò)濾造成了困難，同時(shí)體系中的PanK 可直接催化初始底物2-乙炔基甘油（41）形成副產(chǎn)物。為此研究人員對(duì)PanK（配對(duì)Ack）和GOase 進(jìn)行了酶的固定化操作，減少了水溶液中的酶量，并避免了初始底物的直接磷酸化。最終，通過(guò)優(yōu)化酶催化串聯(lián)反應(yīng)平臺(tái)，首次實(shí)現(xiàn)了islatravir（41）的規(guī)模化合成，其總產(chǎn)率高達(dá)51%，純度高達(dá)95%［87］。Islatravir（41）的體外酶法高效全合成是酶催化串聯(lián)法在復(fù)雜天然產(chǎn)物合成應(yīng)用研究中的重大突破，其合成過(guò)程中涉及到的逆向合成思維以及定向進(jìn)化和酶的固定化等策略，為設(shè)計(jì)合成其他復(fù)雜分子提供了新的思路和重要借鑒。

1.7 其他化合物

除上述介紹的重要實(shí)例外，采用體外酶催化串聯(lián)一鍋法合成的天然產(chǎn)物還有維生素B12的前體hydrogenobyrinic acid（45）［90］、聚酮化合物灰黃霉素（griseofulvin，46）［91］、雜萜類merochlorin A（47）和merochlorin B（48）以及napyradiomycin A1（49）和napyradiomycin B1 （50）［92-93］、植物抗毒素camalexin（51）［94］、吡咯并吲哚類生物堿毒扁豆堿（physostigmine，52）［95］、色氨酸衍生物indolmycin（53）［96］、硝基咪唑類抗生素azomycin（54）［97］、糖類化合物碳霉糖（TDP-L-mycarose，55）［98］、多肽類抗生素56［99］、以及免疫抑制劑lipid IVA（57）［100］，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖12。

圖12 酶催化串聯(lián)法合成的一些其他化合物（45～57）Fig.12 Enzymatic tandem synthesis of other compounds 45～57

2 化學(xué)-酶催化串聯(lián)法合成復(fù)雜天然產(chǎn)物

化學(xué)-酶催化串聯(lián)就是將化學(xué)合成與酶催化合成進(jìn)行串聯(lián)，兩者互補(bǔ)，各取所長(zhǎng)，從而完成天然產(chǎn)物的合成?；瘜W(xué)催化劑如有機(jī)金屬催化劑具有寬泛的底物適用范圍和催化活性，可以彌補(bǔ)某些酶對(duì)非天然底物沒(méi)有催化活性以及在有機(jī)溶劑或高溫下出現(xiàn)的活性喪失等不足；而酶催化劑能在更加簡(jiǎn)單溫和的催化條件下將區(qū)域和立體選擇性發(fā)揮到極致，可以解決化學(xué)催化劑在沒(méi)有誘導(dǎo)劑或保護(hù)基團(tuán)的輔助下難以實(shí)現(xiàn)極高手性選擇性的問(wèn)題。然而，化學(xué)-酶催化串聯(lián)體系的實(shí)現(xiàn)較為困難，主要源于兩類催化劑所需的催化環(huán)境不同；當(dāng)生物酶和化學(xué)催化劑共存于同一反應(yīng)體系時(shí)往往存在相互抑制的情況［101］。盡管如此，利用酶自身催化反應(yīng)的高效性、高立體選擇性、高區(qū)域選擇性，以及利用化學(xué)催化劑具有的寬廣的底物適用范圍和催化活性，化學(xué)-酶催化串聯(lián)在復(fù)雜天然產(chǎn)物尤其是高手性化合物的合成中發(fā)揮了重要作用［102-106］。近年來(lái)，無(wú)論是化學(xué)-單酶催化串聯(lián)還是化學(xué)-多酶催化串聯(lián)，在復(fù)雜天然產(chǎn)物的合成中均取得了巨大的應(yīng)用進(jìn)展［107-111］。關(guān)于化學(xué)-酶催化串聯(lián)法在復(fù)雜天然產(chǎn)物合成中的應(yīng)用研究進(jìn)展，目前已有相關(guān)綜述進(jìn)行了較全面的總結(jié)［101-106，109］。本節(jié)以多殺菌素A（spinosyn A，58）［111］和肝素（heparin）［107］的化學(xué)-酶催化串聯(lián)合成研究為例，介紹化學(xué)合成與多酶法合成相互結(jié)合在復(fù)雜天然產(chǎn)物合成中的重要性。

2.1 多殺菌素A 的合成研究

多殺菌素A（58）是刺糖多胞菌（Saccharopolyspora spinosa）產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其作為生物殺蟲劑多殺菌素的主要活性成分之一，在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中占有重要地位［112］。多殺菌素A（58）分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，以含有21 個(gè)碳所組成的獨(dú)特的5/6/5/12-四環(huán)作為基本骨架，并通過(guò)氧糖苷鍵在C-9 位和C-17 位分別與三氧甲基鼠李糖和福樂(lè)氨糖連接，整個(gè)分子中含有17個(gè)手性中心。多殺菌素A（58）的化學(xué)全合成已經(jīng)由Evans、Paquette、Roush 和Dai 四個(gè)課題組分別獨(dú)立完成，但由于多殺菌素A（58）獨(dú)特的四環(huán)結(jié)構(gòu)以及分子中眾多的手性中心，在合成過(guò)程中給他們帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)［103，113］。多殺菌素A（58）的生物合成途徑已被解析（圖13）：其四環(huán)骨架結(jié)構(gòu)（59）是由模塊化Ⅰ型聚酮合酶SpnA-E 催化1 分子丙酰輔酶A、9 分子丙二酸單酰輔酶A 和1 分子甲基丙二酸單酰輔酶A 結(jié)合而成；隨后在SpnJ 的催化下將15-OH 氧化為羰基得到化合物60，并在SpnM 催化下脫水生成多烯化合物61；化合物61 在SpnF 催化的［4+2］-環(huán)加成Diels-Alder 反應(yīng)中形成化合物62，繼而在鼠李糖轉(zhuǎn)移酶SpnG 作用下進(jìn)行糖基化，并由SpnL催化C-2 位和C-14 位相連形成化合物63；化合物63 在甲基轉(zhuǎn)移酶SpnH、SpnI 和SpnK 的作用下對(duì)鼠李糖單元羥甲基化；最終在SpnP 的催化下引入福樂(lè)氨糖合成最終產(chǎn)物多殺菌素A（58）［114-116］。

基于化學(xué)催化可合成寬廣的底物和酶催化反應(yīng)具有很高的立體選擇性和區(qū)域選擇性，研究人員在2014 年采用化學(xué)-酶催化串聯(lián)法成功實(shí)現(xiàn)了多殺菌素A（58）的全合成（圖13）［111］。由于多殺菌素A 生物合成途徑中化合物59 的結(jié)構(gòu)只是推測(cè)而來(lái)，尚未分離鑒定，研究人員首先采用化學(xué)法合成了多烯大環(huán)內(nèi)酯化合物59?；衔?4 通過(guò)不對(duì)稱乙基化和羥醛縮合反應(yīng)等5步轉(zhuǎn)化獲得化合物65，隨后發(fā)生Stille 偶聯(lián)、Julia-Kocienski 烯基化以及Yamaguchi 大環(huán)內(nèi)酯化，經(jīng)7 步轉(zhuǎn)化完成了酶催化前體59 的合成。隨后研究人員以化合物59 為底物，通過(guò)在反應(yīng)體系中加入多殺菌素A（58）生物合成途徑相關(guān)的8 個(gè)酶以及優(yōu)化體系中各酶的濃度，在體外一鍋法實(shí)現(xiàn)了化合物66 的合成，其總轉(zhuǎn)化產(chǎn)率約19.6%，意味著每一步酶催化反應(yīng)的平均轉(zhuǎn)化產(chǎn)率至少為81.6%。由于多殺菌素A（58）生物合成途徑中最后一步SpnP 催化的糖基化反應(yīng)在體外需要輔助蛋白作用才能發(fā)揮活性，而多殺菌素A（58）生物合成基因簇中并沒(méi)有相關(guān)編碼基因存在。因此，研究人員最后采用了化學(xué)方法，在Lewis 酸活化下對(duì)化合物66 引入氨基葡萄糖實(shí)現(xiàn)了多殺菌素A（58）的全合成。多殺菌素A（58）的化學(xué)-酶催化串聯(lián)全合成工作充分體現(xiàn)了酶催化反應(yīng)的高效性、專一性和簡(jiǎn)便性，同時(shí)也證實(shí)了化學(xué)合成與生物合成相結(jié)合的策略在復(fù)雜天然產(chǎn)物合成中的重要價(jià)值。

圖13 化學(xué)-酶催化串聯(lián)法合成多殺菌素A（58）Fig.13 Chemoenzymatic synthesis of spinosyn A(58)

2.2 肝素的合成研究

化學(xué)-酶催化串聯(lián)合成的另一個(gè)經(jīng)典的例子是2011 年報(bào)道的肝素的全合成［107］。肝素是臨床上廣泛使用的抗凝藥物，是葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）或艾杜糖醛酸（iduronic acid，IdoA）和葡萄糖胺（glucosamine，GlcN）通過(guò)1→4 糖苷鍵連接形成的二糖重復(fù)單元組成的糖胺聚糖。肝素大小不一、結(jié)構(gòu)各異，第一個(gè)化學(xué)全合成的五糖抗凝藥磺達(dá)肝素（商品名Arixtra）總共涉及50多步反應(yīng)，且反應(yīng)條件復(fù)雜、產(chǎn)率極低（小于0.1%），極大地限制了商業(yè)化應(yīng)用［117-118］。肝素的體內(nèi)生物合成首先是在N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶（N-acetyl glucosaminyl transferase） 和肝素合酶（heparosan synthase-2，HS2）的作用下形成N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸交替連接的糖鏈骨架，隨后在N-硫酸化酶（N-sulfotransferase，NST）、C5-異構(gòu)酶（C5-epimerase，C5-epi）以及不同O-硫酸化酶（O-sulfotransferase，OST）的作用下對(duì)糖鏈骨架進(jìn)行修飾，從而得到不同大小及結(jié)構(gòu)的肝素。利用酶催化反應(yīng)高效的立體專一性，Xu等［107］采用化學(xué)-酶催化串聯(lián)法首次實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)超低分子量肝素［（68）和（69）］的合成（圖14）。研究人員借助上述不同的糖基轉(zhuǎn)移酶（來(lái)源于E. coliK5 的KfiA和來(lái)源于Pasteurella multocida的pmHS2）、硫酸化酶以及C5-異構(gòu)酶，通過(guò)精細(xì)調(diào)控反應(yīng)順序，將天然葡萄糖胺、葡糖醛酸及硫酸根進(jìn)行“組合”，并結(jié)合堿性（三乙胺，triethylamine）條件下的脫保護(hù)化學(xué)過(guò)程，只需10～12 步反應(yīng)就高效合成了兩個(gè)超低分子量肝素［（68）和（69）］，其產(chǎn)率分別為45%和37%，且抗凝血活性與商品藥磺達(dá)肝素相當(dāng)。肝素化學(xué)-酶法全合成的實(shí)現(xiàn)是化學(xué)-酶催化串聯(lián)法在復(fù)雜分子合成應(yīng)用中的里程碑創(chuàng)舉，其為抗凝血藥物肝素的研發(fā)開(kāi)辟了新的途徑。

圖14 化學(xué)-酶催化串聯(lián)法合成超低分子量肝素（68）和（69）Fig.14 Chemoenzymatic synthesis of ultralow molecular weight heparins（68）and（69）

3 結(jié)語(yǔ)

實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物的體外酶法全合成不僅可以拓展“酶”作為催化劑的應(yīng)用潛力，也為復(fù)雜天然產(chǎn)物的制備提供了新的思路。體外酶催化合成具有高效性、高選擇性、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，在復(fù)雜天然產(chǎn)物的合成中發(fā)揮了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。然而，體外酶法全合成的發(fā)展仍面臨諸多挑戰(zhàn)。首先，盡管復(fù)雜天然產(chǎn)物的生物合成研究近年來(lái)取得了很大進(jìn)展，但與化學(xué)合成相比，人們對(duì)于由生物大分子負(fù)責(zé)的生物合成機(jī)制的理解仍顯不足。天然產(chǎn)物的體外酶催化全合成需要在其生物合成途徑了解的基礎(chǔ)上進(jìn)行，這樣才能保證酶催化反應(yīng)中初始底物的真實(shí)性以及酶催化串聯(lián)反應(yīng)的有效性。然而一方面天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣，另一方面相似化合物的生物合成途徑也是共性與差異共存，因此人們還需繼續(xù)努力挖掘生物合成基因簇和闡明更多的生物合成途徑。相信隨著測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)以及基因編輯、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、遺傳轉(zhuǎn)化等生物技術(shù)的迅速發(fā)展，越來(lái)越多復(fù)雜天然產(chǎn)物的生物合成途徑將得到解析，從而為復(fù)雜天然產(chǎn)物的體外酶催化全合成奠定基礎(chǔ)。其次，體外酶催化反應(yīng)的實(shí)現(xiàn)需要生物合成途徑中所有參與反應(yīng)的酶在體外能夠穩(wěn)定獲得且有活性，但目前仍有很多目標(biāo)蛋白無(wú)法通過(guò)常規(guī)的生物技術(shù)獲得、或蛋白不穩(wěn)定、或活性很低，極大限制了體外酶催化全合成的應(yīng)用。另外，復(fù)雜天然產(chǎn)物生物合成途徑中參與反應(yīng)的酶的功能多種多樣、酶學(xué)性質(zhì)不同，在體外將它們串聯(lián)在一起時(shí)容易出現(xiàn)蛋白互不兼容、反應(yīng)條件互不合適、中間體產(chǎn)物及輔因子容易抑制一些酶的活性等問(wèn)題，很大程度上影響了酶催化全合成的效率。對(duì)此，可通過(guò)優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)、篩選同源基因、構(gòu)建融合蛋白等來(lái)獲得目標(biāo)蛋白；通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件、固定化、定向進(jìn)化等技術(shù)提高酶的穩(wěn)定性和兼容性。此外，也可通過(guò)分步串聯(lián)策略或多酶催化串聯(lián)流動(dòng)體系提高蛋白穩(wěn)定性、減少中間體產(chǎn)物及輔因子對(duì)酶活性的抑制，從而最大程度地提高體外酶催化串聯(lián)體系的合成效率。在體外酶催化途徑的設(shè)計(jì)中，應(yīng)該綜合考慮化學(xué)合成和酶催化的優(yōu)勢(shì)，不拘泥于全酶串聯(lián)，在一些特殊步驟中引入化學(xué)合成也將大大提高整體合成效率。綜上所述，天然產(chǎn)物的體外酶催化全合成研究近年來(lái)取得了較大進(jìn)展，相信隨著合成生物學(xué)理念的進(jìn)一步完善，蛋白質(zhì)工程和酶工程技術(shù)的發(fā)展，體外酶催化全合成將成為復(fù)雜天然產(chǎn)物合成的重要手段之一。