工業(yè)絲狀真菌土曲霉合成生物技術研究進展及展望

黃雪年，唐慎，呂雪峰

（中國科學院青島生物能源與過程研究所，山東省合成生物學重點實驗室，中國科學院生物燃料重點實驗室，山東 青島266101）

自然界微生物豐富的種質資源、代謝途徑及其調控機制的多樣性，結合合成生物學使能技術的快速發(fā)展，構成了從研發(fā)優(yōu)質微生物底盤細胞到高效微生物細胞工廠及終端目標產品的微生物合成生物技術領域。絲狀真菌作為一類重要的微生物，在食品、醫(yī)藥、化工等國計民生的領域發(fā)揮了重要的作用，而絲狀真菌合成生物技術的發(fā)展已經(jīng)展示了更大的工業(yè)應用潛力。

圖1 土曲霉的各種形態(tài)Fig.1 The morphologies of A.terreus

土曲霉是一種環(huán)境中常見的絲狀真菌，具有土褐色致密直柱形分生孢子頭、密集的產孢細胞和很小的分生孢子（圖1），它的無性孢子（分生孢子）的萌發(fā)溫度范圍較寬（11～48 ℃），而且能夠耐受高滲透壓，可以廣泛分布于各種生境中。像其他曲霉一樣，土曲霉最初也被認為是嚴格的無性生殖，通過產生無性孢子進行傳播繁殖，直到2013 年才首次觀察到它可以進行有性繁殖［1］。由于土曲霉并非傳統(tǒng)食品發(fā)酵使用真菌，所以不如米曲霉、黑曲霉和紅曲霉等食品安全使用微生物那樣為大眾所知。但事實上，土曲霉已經(jīng)在生物化工和醫(yī)藥領域展現(xiàn)出了非常大的應用價值，是生物基化學品衣康酸和降血脂藥物洛伐他汀的工業(yè)生產菌，其產品年銷售額高達幾十億美元。成功的生產應用也證明土曲霉在初級代謝產物和次級代謝產物合成方面都具有很強的能力，并展現(xiàn)出了非常突出的工業(yè)發(fā)酵性能，具有成為典型性絲狀真菌底盤細胞應用于合成生物技術開發(fā)的價值。近年來，土曲霉在工業(yè)菌株改造與發(fā)酵工藝優(yōu)化、生物合成機制解析等方面都引起了國內外學者的關注，使其合成生物技術研究方面取得顯著進步。本文將對土曲霉的上述研究進展進行系統(tǒng)介紹，并對土曲霉合成生物技術研究的未來發(fā)展進行討論。

1 土曲霉合成生物技術工具開發(fā)

與大腸桿菌和釀酒酵母等模式生物相比，絲狀真菌遺傳改造技術仍不夠系統(tǒng)且相對低效，可供選擇的篩選標記、啟動子和終止子等遺傳改造元件也比較有限。目前只有少數(shù)常用的篩選標記被證實在土曲霉中可用，如潮霉素抗性基因hph、吡啶硫氨素抗性基因ptrA、博來霉素抗性基因ble和基于尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的篩選標記pyrG［2-3］，還有一些在其他絲狀真菌中有效的篩選標記仍有待驗證［4］。

（1）啟動子構巢曲霉的PgpdA啟動子是研究較多的啟動子，在絲狀真菌中應用廣泛，土曲霉最初遺傳改造也是使用PgpdA啟動子驅動目的基因表達［5］。此外，構巢曲霉PtrpC、PadhA和紅曲霉Pmgpd等異源啟動子也有被應用于土曲霉遺傳改造中。Tet 誘導啟動子系統(tǒng)具有較好的可控性，在黑曲霉中有很好的應用效果［6］，Sun 等［7］通過用Tet 啟動子系統(tǒng)替換土曲霉一個沉默NRPS-like 基因的啟動子，成功誘導性激活了該基因。土曲霉糖化酶Gla1 的啟動子是最早被使用的土曲霉內源啟動子，1999 年Villanueva等［8］用該啟動子在土曲霉中異源表達輪狀病毒核衣殼蛋白VP6，但未能檢測到目的蛋白，可能是目的基因密碼子不匹配，也可能是由于土曲霉糖化酶系本就不發(fā)達，啟動子活性太弱。本文作者研究組為了更好地對土曲霉工業(yè)菌株進行代謝工程改造，對土曲霉內源基因3-磷酸甘油醛脫氫酶基因gpdAt和檸檬酸合酶基因citA的啟動子進行了系統(tǒng)的比較表征，獲得了簡短且高效的啟動子元件，最短的僅262 bp，克服了很多常用絲狀真菌啟動子過長（約2 kb）不利于操作的缺點［9-10］。此外，還參照轉錄組信息，將基因 ATEG_02809、 ATEG_03846、 ATEG_09960（lovA）、 ATEG_09961 （lovB）、 ATEG_09964（lovD）的啟動子應用于產洛伐他汀土曲霉工業(yè)菌株改造（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。

（2）同源重組絲狀真菌一個非常顯著的特點是DNA 雙鏈斷裂修復過程主要是依靠非同源末端連接途徑（non-homologous DNA end joining， NHEJ） 和同源重組修復途徑（homology recombination， HR），這使得在絲狀真菌中外源DNA 主要是通過隨機插入的方式整合到基因組上，同源重組整合效率非常低。其優(yōu)點是當只需要表達某個目的基因時，可與篩選標記共轉化，得到表達元件整合位點和拷貝數(shù)都有差異的轉化子庫，這些不確定性有利于篩選到性能更好的轉化子。其缺點也很明顯，依賴基因打靶的一些遺傳改造策略執(zhí)行難度大，如基因敲除、基因定點表達、同源基因或突變體體內比較分析、啟動子替換等。研究人員在絲狀真菌模式生物粗糙脈孢菌中發(fā)現(xiàn)通過失活NHEJ 途徑可以顯著提高外源基因的同源重組效率，從而解決基因打靶效率低的問題［11］。這一技術很快被推廣應用，極大地促進了絲狀真菌的遺傳改造研究。本文作者研究組［12］在土曲霉工業(yè)菌株中通過敲除ku80基因阻斷NHEJ 途徑，成功將基因打靶效率從不到5%提高到90%以上，隨后進一步敲除pyrG基因獲得了尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型底盤細胞，并建立了基于pyrGAn的雙向篩選遺傳轉化體系。最后結合改良后的Cre/loxP位點特異性重組系統(tǒng)對pyrGAn篩選標記進行快速切除，實現(xiàn)篩選標記的循環(huán)使用，解決了篩選標記不足的問題［12-13］。利用這個遺傳操作平臺可以對土曲霉進行多基因、多位點、多策略的遺傳改造。

（3）基因編輯基于細菌和古細菌免疫機制開發(fā)的CRISPR/Cas9 基因編輯技術，因其簡單、高效備受矚目，廣泛應用于各類生物細胞的遺傳改造研究中。由于缺乏質粒和可靠的強啟動子元件等，CRISPR/Cas9 技術在絲狀真菌中的應用進度相對滯后。近幾年經(jīng)過改良后也被成功地應用在越來越多的絲狀真菌中［14-15］，包括粗糙脈菌［16］、里氏木霉［17］、米曲霉［18］、黑曲霉［19-20］和玉蜀黍黑粉菌［21］等。田朝光課題組［22］在產纖維素酶嗜熱毀絲霉中利用CRISPR/Cas9 技術實現(xiàn)了多個基因的同時敲除，顯示出了該技術在絲狀真菌基因編輯中的優(yōu)勢和應用前景。目前，還沒有關于CRISPR/Cas9 技術在土曲霉中應用的報道。

2 降血脂藥物洛伐他汀的土曲霉細胞工廠

高血脂是心血管疾病的重要誘因，控制血脂水平是預防繼發(fā)心血管疾病的有效手段。他汀類藥物能夠通過抑制羥甲戊二酰輔酶A（HMGCoA）還原酶活性來降低膽固醇的體內合成，成為最主要的降血脂藥物，占市場總額的80%以上。巨大的商業(yè)價值使得他汀類降血脂藥物研發(fā)成為最成功、最著名的藥物研發(fā)案例之一。洛伐他?。╨ovastatin）是由土曲霉合成的一種聚酮類化合物，是首個被批準上市的他汀類降血脂藥物（美國食品藥品監(jiān)督管理局FDA 于1987年批準），備受矚目。

2.1 洛伐他汀的生物合成

洛伐他汀，又名monacolin K，最早于1979 年在紅曲霉中被首次發(fā)現(xiàn)，隨后Merck公司研究團隊發(fā)現(xiàn)土曲霉也能合成洛伐他汀，且具有更高的產量，并最終成功應用于洛伐他汀的工業(yè)生產［23］。作為明星小分子，土曲霉的洛伐他汀合成基因簇于1999 年被首次鑒定，引起學術界的廣泛關注［24］。通過一系列的反向遺傳學和生物化學研究，洛伐他汀的生物合成途徑被完全鑒定，整個合成途徑受特異性轉錄激活因子LovE 的調控，碳骨架主要由兩個還原型PKS（LovB 和LovF）參與合成（圖2）。首先，LovB 在烯?；€原酶LovC 的作用下合成dihydromonacolin L［25］，然后在硫酯酶LovG 的作用下從LovB 的ACP 結構域上釋放下來［26］，接著在細胞色素P-450 酶LovA 的作用下發(fā)生羥基化和脫水作用生成monacolin L，隨后LovA繼續(xù)催化C8 位發(fā)生羥基化生成母核monacolin J［27］。與此同時，另外一個PKS LovF 負責合成2-甲基丁酸側鏈，在?；D移酶LovD 的作用下轉移至monacolin J 的C8 位羥基上生成終產物洛伐他?。?4，28］。

圖2 土曲霉洛伐他汀生物合成途徑Fig.2 Biosynthesis pathway of lovastain in A.terreus

洛伐他汀工業(yè)生產菌株主要是通過誘變育種方式篩選獲得的，圍繞生物合成途徑的代謝工程改造的成功案例很少。LaeA 是一個來源于構巢曲霉的次級代謝產物合成全局性調控因子，在土曲霉ATCC20542 中過表達LaeA 將洛伐他汀產量提高了4～7 倍［29］。在土曲霉ATCC20542 中用組成型強啟動子PadhA替換乙酰輔酶A 羧化酶ACCase的啟動子，強化前體供應，但是效果并不顯著，只將洛伐他汀產量從62.7mg/L 提高到88mg/L［30］。研究人員還發(fā)現(xiàn)敲除土曲霉ATCC20542 的甾醇調節(jié)元件結合蛋白（SREBP）和SREBP 分裂激活蛋白（ACAP）分別將洛伐他汀產量提高了2.6 倍和5.1 倍［31］。但是這些改造都是在普通低產菌株中進行的，洛伐他汀初始產量比工業(yè)菌株低了約兩個數(shù)量級，目前還沒有在高產菌株中成功改造的報道。

2.2 合成生物技術策略改進辛伐他汀生產工藝

1992 年，Merck 公司又基于洛伐他汀開發(fā)了藥效更好的半合成衍生物辛伐他?。╯imvastatin，Zocor），作為第二代他汀類藥物，迅速成為全球暢銷藥物，專利期過后年銷售額仍穩(wěn)定達到30 億美元。與洛伐他汀相比辛伐他汀只是在側鏈上多了一個甲基，在工業(yè)上辛伐他汀是以洛伐他汀為原料通過多步化學反應合成的，其生產工藝大致可分為三個步驟。首先是土曲霉發(fā)酵生產洛伐他汀，然后通過堿水解洛伐他汀獲得無側鏈的monacolin J，最后通過化學方法重新加上新的側鏈合成辛伐他汀。Tang 課題組基于土曲霉的酰基轉移酶LovD 建立了一種從monacolin J 到辛伐他汀的生物催化方法，可替代原來的化學法，該成果獲得2012 年美國總統(tǒng)綠色化學挑戰(zhàn)獎的綠色合成路線獎［32-35］。至此，堿水解洛伐他汀生產monacolin J 成為唯一未被生物催化替代的工藝，該過程復雜繁瑣、反應條件苛刻，而且需要使用大量的濃酸、濃堿和有機試劑，環(huán)境污染嚴重，因此開發(fā)一種綠色高效的monacolin J 生產工藝非常有必要。包括Merck 在內的研究團隊也曾嘗試開發(fā)生物轉化方法，但是由于效率太低，都未能實現(xiàn)工業(yè)應用［36-39］。

基于構建的土曲霉遺傳操作平臺，本文作者研究組以洛伐他汀工業(yè)生產菌株為底盤細胞進行系統(tǒng)的代謝工程改造，構建了能直接發(fā)酵生產monacolin J 的土曲霉細胞工廠（圖3）。首先，鑒定了一個具有自主知識產權的洛伐他汀水解酶PcEST，能夠高效地水解洛伐他汀的2-甲基丁酸側鏈生成monacolin J，催化效率達到國外專利酶的232 倍［40-41］。鑒于該酶的高效催化性能，利用內源啟動子PgpdAt構建了水解酶PcEST 的真菌表達元件，并整合至洛伐他汀土曲霉工業(yè)生產菌株的基因組上，使PcEST 在土曲霉菌株中高效異源表達，成功將95%的洛伐他汀轉化成monacolin J，獲得了第一代生產monacolin J 的土曲霉細胞工廠，打通了技術路線（圖3）［40］。

圖3 生產辛伐他汀前體物monacolin J土曲霉細胞工廠的設計策略Fig.3 Construction of monacolin J-producing cell factory in A.terreus

在工業(yè)生產中洛伐他汀殘留超過0.5%會增加分離純化的難度，而第一代細胞工廠有5%的殘留，會增加企業(yè)生產成本。研究組開發(fā)了水解酶PcEST 高通量篩選方法，采用定向進化技術獲得了高效的水解酶PcEST 突變體，結合啟動子優(yōu)化構建了第二代細胞工廠，在實驗室條件下成功將殘留控制在0.5%以下，但是發(fā)酵條件變化對水解效率影響較大，穩(wěn)定性不足并不適合大規(guī)模的工業(yè)生產［42］。隨后，研究組通過基因組重測序對工業(yè)菌株的生物合成途徑和遺傳背景進行了分析，利用建立的高效遺傳操作平臺克服工業(yè)菌株遺傳背景復雜等困難，實現(xiàn)了負責側鏈合成的PKS 基因lovF的完全敲除，成功阻斷了洛伐他汀合成的最后一步反應，實現(xiàn)了monacolin J 的高效積累，獲得了完全無洛伐他汀殘留的第三代土曲霉細胞工廠［43］。

真菌次級代謝產物的合成受環(huán)境因素的影響很大，這些外部因素在細胞內通過全局調控和特異性調控最終影響到整個合成途徑。會使得在工業(yè)生產過程中批次間波動很大，增加工藝控制難度，這一現(xiàn)象同樣存在于土曲霉發(fā)酵生產洛伐他汀的工業(yè)生產過程中。研究組在第三代產monacolin J 細胞工廠的基礎上，以土曲霉內源組成型強啟動子PgpdAt過表達基因簇特異性轉錄調控因子lovE和構巢曲霉laeA，其中過表達laeA未能提高monacolin J 的產量。而過表達lovE顯著加強lovE的轉錄并維持在較高水平，將monacolin J 產量從 10.73mmol/L 提高到了16.36mmol/L，提高了52.5%。此外，還發(fā)現(xiàn)第三代菌株和過表達laeA菌株的monacolin J 產量受培養(yǎng)基影響很大，在兩種不同培養(yǎng)基中的產量相差約30%，而過表達lovE的菌株在兩種不同培養(yǎng)基中發(fā)酵合成的monacolin J 差異很小，這說明用組成型強啟動子過表達lovE有助于維持合成途徑的通量保持穩(wěn)定，從而提高菌株的發(fā)酵魯棒性，對發(fā)酵環(huán)境變化有更好的適應能力［43］。這項工作證明轉錄水平的改造是一種很有效的合成生物學改造策略，不僅能提高目標化合物的產量，還可以提高菌株的發(fā)酵魯棒性。這種改造策略在生產次級代謝產物的絲狀真菌工業(yè)菌株中應用較少，而該研究是一個可供參考的成功案例。

3 生物基化學品衣康酸的土曲霉細胞工廠

衣康酸是由土曲霉發(fā)酵產生的一種不飽和二元有機酸，分子內部含有一個活潑的雙鍵和兩個羧基，雙鍵和羧基呈共軛關系，使得衣康酸的性質非?；顫?，既可以自身聚合也能與其他單體發(fā)生聚合反應，因此廣泛應用于化學合成工業(yè)，例如合成樹脂、塑料、合成纖維和制藥領域等，應用前景廣闊［44］。目前衣康酸的全球需求量約為4～6 萬噸/年，年銷售額近10 億元/年，并保持逐年增長趨勢，市場處于供不應求狀態(tài)?；谝驴邓岬膽们熬?，美國能源部已將其列為十二種最具價值的生物基平臺化合物之一，引起廣泛關注［45］。

3.1 衣康酸生物合成途徑

土曲霉合成衣康酸很早就被發(fā)現(xiàn)和應用，但是直到2002 年發(fā)現(xiàn)順烏頭酸脫羧酶CadA 之后才確定它是通過順烏頭酸脫羧生成的，2008 年獲得了CadA 的核苷酸序列，并通過體外酶活和釀酒酵母中異源表達確定了其活性［46］。2011 年，Li 等［47］通過比較轉錄組分析發(fā)現(xiàn)cadA的轉錄水平確實與衣康酸產量呈正相關，而且還發(fā)現(xiàn)毗鄰的三個基因也表現(xiàn)出一致的變化趨勢，包括一個線粒體三羧酸轉運蛋白編碼基因mttA、一個MFS 超家族轉運蛋白基因mfsA和一個轉錄調控因子，提示這三個基因可能也與衣康酸的合成相關，共同組成衣康酸合成基因簇。更有意思的是衣康酸基因簇與洛伐他汀基因簇相鄰，在發(fā)酵工藝研究中也初步發(fā)現(xiàn)兩者的合成具有相關性，但是尚未被更系統(tǒng)的研究證實［48］。

基于前期的生物化學分析和近期的組學研究結果，提出了生物合成途徑的模型（圖4）。葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑后進行三羧酸循環(huán)生成檸檬酸，烏頭酸酶催化檸檬酸合成順烏頭酸，順烏頭酸在線粒體三羧酸轉運蛋白MttA 的作用下轉運到細胞質中，然后由定位于細胞質的順烏頭酸脫羧酶CadA 催化脫羧生成衣康酸，最后經(jīng)MFS 轉運蛋白MfsA 分泌至細胞外［47，49］。另外，檸檬酸也可能通過MttA 轉運到細胞質中，然后由細胞質烏頭酸酶催化生成順烏頭酸，繼而合成衣康酸。雖然整個合成過程非常簡單，僅在TCA 循環(huán)的基礎上多了一步由CadA 催化的脫羧反應就能合成衣康酸，但是關于其合成的調控機制尚未研究。土曲霉工業(yè)菌株的衣康酸發(fā)酵產量可達到80g/L，糖酸轉化率高于60%。而三羧酸循環(huán)是高效的物質與能量轉換的核心環(huán)節(jié)，順烏頭酸只是烏頭酸酶催化檸檬酸合成異檸檬酸反應過程中的一個中間體，絕大部分生物中只存在極少量順烏頭酸，因此只有在特殊機制作用下土曲霉才能實現(xiàn)衣康酸的高效積累。

3.2 衣康酸菌株代謝工程改造

土曲霉液體深層發(fā)酵生產衣康酸最早由輝瑞公司于1955 年實現(xiàn)工業(yè)化應用，近20 年隨著我國生物技術產業(yè)水平的快速發(fā)展，衣康酸發(fā)酵產業(yè)基本轉移到了我國。較高的成本（2 美元/千克）仍然是限制其下游應用領域拓展的主要因素。雖然在工業(yè)生產過程中，通過菌株誘變和發(fā)酵工藝優(yōu)化已經(jīng)將產量提高到了80g/L，但之后近40 年菌株性能沒能再進一步提高。隨著真菌遺傳改造技術的進步，菌株的理性改造被寄予厚望（圖5）。6-磷酸果糖激酶（PfkA）是糖酵解途徑中的關鍵限速酶，受下游產物檸檬酸和能量物質ATP 的反饋抑制，為了解除通過PfkA 靶點對糖酵解的反饋抑制，研究人員通過定點突變破壞磷酸化位點和刪除抑制物結合區(qū)域的方式獲得活性更高且不受檸檬酸反饋抑制的PfkA 突變體mtPfkA［50］。隨后，將該突變體酶引入產衣康酸土曲霉菌株中進行異源表達，加快糖酵解途徑的通量，把衣康酸的產量從15g/L提高至30g/L，發(fā)酵周期由150h 縮短為100h，效果顯著［5］。但是該策略在工業(yè)菌株中應用時并沒有效果，可能是工業(yè)菌株產量已經(jīng)遠高于30g/L，糖酵解通量已經(jīng)很高，并非限速環(huán)節(jié)［51］。

增強菌株的逆境抵抗力是合成生物技術研究的重要策略，有利于提高菌株的發(fā)酵強度。工業(yè)生產時發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中攪拌和通氣的連續(xù)性非常重要，中斷5min 就會延滯衣康酸的合成并顯著影響最終產量，說明在發(fā)酵過程中呼吸作用非?；钴S且很重要，溶氧不足會打破平衡改變代謝流。為了提高菌株抵抗缺氧逆境的能力，Lin 等［52］通過在土曲霉中過表達透明顫菌血紅蛋白，把衣康酸的發(fā)酵產量由40g/L 提高到46.8g/L。但在工業(yè)菌株中過表達透明顫菌血紅蛋白在正常的衣康酸發(fā)酵條件下未能提高產量，只在供氧不足條件下有小幅的改善［9］。另外，在土曲霉發(fā)酵產衣康酸過程中，快速將大量葡萄糖轉化成衣康酸，高強度呼吸作用會產生氧自由基， 影響細胞活性， 交替氧化酶（alternative oxidase，AOX）是線粒體呼吸鏈中交替呼吸途徑的末端氧化酶，研究表明它不僅有助于去除氧自由基還有助于提高細胞抗逆性［53］。研究人員在產衣康酸土曲霉工業(yè)菌株中過表達土曲霉內源和來自黑曲霉的異源aoX1基因，衣康酸合成能力不但沒有提高，反而顯著下降（本文作者課題組未發(fā)表結果）。這一結果說明過表達的AOX 確實在土曲霉中行使了功能，但是由于衣康酸積累機制較復雜，該改造策略整體而言并不有益于衣康酸的積累?？赡苁且驴邓岱e累機制和能量平衡有關，因為交替呼吸途徑會將正常的電子傳遞和能量合成過程進行解離，從而改變細胞能量狀態(tài)，影響衣康酸的高效積累。

圖4 土曲霉的衣康酸生物合成途徑Fig.4 The biosynthesis pathway of itaconic acid in A.terreus

圖5 產衣康酸土曲霉菌株改造策略Fig.5 Metabolic engineering of the itaconic acid-producing A.terreus

基于生物合成途徑的解析，本研究組在工業(yè)生產菌株中對衣康酸合成途徑進行了系統(tǒng)的代謝工程改造［51］。用強啟動子PgpdAt對衣康酸合成途徑中的關鍵酶（順烏頭酸脫羧酶CadA、檸檬酸合酶CitA、烏頭酸酶AcoA、丙酮酸羧化酶PYC、三磷酸甘油醛脫氫酶GPD 和黑曲霉6-磷酸果糖激酶突變體mtPfkA）、轉運蛋白（線粒體三羧酸轉運蛋白MttA、衣康酸分泌蛋白MfsA）和調控因子（ATEG_09969、ATEG_01954）進行過表達。其中過表達順烏頭酸脫羧酶CadA 將衣康酸產量從80.5g/L 提高到88.1g/L，提高了9.4%，并且在生產中顯著縮短了發(fā)酵時間。MfsA 被推測是負責將衣康酸分泌至細胞外的轉運蛋白，過表達MfsA 將衣康酸產量提高了5%，這顯示MfsA 確實與衣康酸分泌有關。但是過表達其他基因并沒有達到提高產量的效果。

除了合成途徑改造之外，研究人員還關注了衣康酸降解途徑。研究過程中發(fā)現(xiàn)土曲霉能夠利用衣康酸作為唯一碳源進行生長，這說明土曲霉中存在降解衣康酸的途徑。通過轉錄組和體外酶活分析，發(fā)現(xiàn)衣康酸可以在衣康酰-CoA轉移酶AtIct、衣康酰-CoA 水合酶AtIch 和檸蘋酰-CoA 裂解酶AtCcl 的作用下轉化成丙酮酸和乙酰-CoA，重新回到中心碳循環(huán)中［54］。在工業(yè)菌株中分別敲除這三個基因，基因缺失菌株的細胞提取物確實不再能降解衣康酸，但是在正常發(fā)酵條件下衣康酸產量無顯著變化。可能是衣康酸發(fā)酵過程中葡萄糖供應充足，且該條件下有利于衣康酸的合成和積累，降解途徑處于沉默狀態(tài)，因此阻斷降解途徑無法提高衣康酸的最終產量。

此外，本文作者課題組通過對土曲霉菌株進行基因工程改造簡化了衣康酸發(fā)酵工藝［10］。土曲霉的淀粉水解酶系不如黑曲霉發(fā)達，在工業(yè)上只能利用淀粉水解葡萄糖作為碳源進行發(fā)酵，而淀粉水解制糖需要經(jīng)過淀粉酶處理、高溫噴射液化和糖化酶水解糖化過程，增加了生產成本。用強啟動子在土曲霉中異源表達來自黑曲霉的糖化酶gla1，并根據(jù)蛋白組數(shù)據(jù)進行信號肽優(yōu)化，使土曲霉直接利用淀粉液化液發(fā)酵生產衣康酸的產量從約20g/L 提高到了67.6g/L。再結合發(fā)酵工藝優(yōu)化，產量達到78.2g/L，接近利用葡萄糖作為碳源時的產量，省去了淀粉液化液的糖化過程。

除了天然生產菌株的改造，也有研究嘗試通過合成生物技術用其他異源底盤細胞來生產衣康酸，包括檸檬酸生產菌株黑曲霉、解脂耶氏酵母、大腸桿菌等［55-56］。但是合成能力仍遠低于土曲霉，圍繞土曲霉工業(yè)菌株的代謝工程改造仍然是重要關注點。目前土曲霉的改造雖然有一定效果但并未取得重大突破，其原因是關鍵的衣康酸積累機制尚不清楚。因此，解析積累機制并進行針對性的改造仍值得期待，多個層面的機制均有可能。在酶學層面，通常烏頭酸酶催化檸檬酸轉化成異檸檬酸的過程中很少釋放并積累順烏頭酸，土曲霉烏頭酸酶可能具有特殊的酶學特性使其與其他物種不同，可以積累順烏頭酸進而合成衣康酸。在化合物反饋抑制層面，有研究顯示衣康酸能夠抑制異檸檬酸裂合酶活性，因此衣康酸的合成可以進一步抑制異檸檬酸經(jīng)TCA 的消耗，從而積累順烏頭酸合成衣康酸。另外，土曲霉合成衣康酸時需要限氮少磷的條件，提示可能存在物質合成與能量/還原力平衡調控。

4 土曲霉次級代謝產物生物合成研究

絲狀真菌具有很好的次級代謝產物合成潛力，產生了許多與人類生活密切相關的重要次級代謝產物，如青霉素、他汀類降血脂藥物、免疫抑制劑環(huán)孢霉素以及食品色素等。這些化合物的生物合成主要是由核心酶負責合成基本骨架，然后在修飾酶的輔助下合成更具結構多樣性的終產物，這些相關基因通常會在基因組上形成一個特異性的生物合成基因簇。根據(jù)核心基因的不同，次級代謝產物通?？煞譃榫弁厦福╬olyketide synthase，PKS）合成的聚酮類、非核糖體肽合成酶（non ribosomal peptide synthetase，NRPS）合成的非核糖體肽類、萜烯環(huán)化酶（terpene cyclase，TC）合成的萜類和二甲烯丙基色氨酸合成酶 （dimethylallyl tryptophan synthase，DMATS）合成的吲哚類等。近年來，組學研究發(fā)現(xiàn)絲狀真菌合成次級代謝產物的潛力被嚴重低估，次級代謝產物合成基因簇數(shù)量遠超預期，也遠多于該物種中已發(fā)現(xiàn)的次級代謝產物的數(shù)量，在實驗室基本培養(yǎng)條件下大部分基因簇都處于沉默狀態(tài)。如何挖掘這些潛在的次級代謝產物資源成為新的關注點，也陸續(xù)開發(fā)了很多激活沉默基因簇策略，大致可以分為非特異性激活和特異性激活兩類［57-60］。

非特異性激活包括單菌多次級代謝產物方法（one strain-many compounds，OSMAC）、表觀遺傳基因改造、化學表觀遺傳和全局調控因子調控等策略。OSMAC 是基于次級代謝產物生物合成受復雜的環(huán)境因素影響，通過優(yōu)化發(fā)酵條件可以改變一些合成途徑的轉錄水平從而獲得不同的產物，常用的是優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過與放線菌共培養(yǎng)的方法也成功激活一些化合物的合成途徑［61］。此外，基因的轉錄還會受到表觀遺傳的影響，組蛋白去乙?；⒓谆蚐UMO 化等表觀遺傳修飾會影響基因組局部區(qū)域是處于常染色質還是異染色質狀態(tài)，異染色質狀態(tài)下基因不會被轉錄或者轉錄不活躍［62］。一些生物合成基因簇就是因為位于異染色質區(qū)域從而處于沉默狀態(tài)，敲除負責組蛋白去乙?；膆daA基因［63］、甲基化的cclA基因［64］或SUMO 化的sumO基因［65］都可以改變染色質的表觀遺傳修飾，從而會影響或激活一些次級代謝產物的合成。化學表觀遺傳策略則是通過在培養(yǎng)過程中添加相應的組蛋白修飾酶抑制劑來替代上述相關基因敲除，從而獲得類似效果［62，66］。全局調控是真菌次級代謝產物調控的一個重要環(huán)節(jié)，LaeA 是研究最多的一個真菌次級代謝相關的全局調控因子，在曲霉中普遍存在，通過敲除或過表達laeA常被用于促進或激活某些次級代謝產物的合成［29，67-71］。

特異性激活策略包括核心基因啟動子替換、特異性轉錄調控因子激活和基因簇異源重構等。次級代謝產物骨架通常是由核心基因負責合成，用可控強啟動子替換核心基因的天然啟動子是發(fā)掘新化合物的一個有效手段［7，72-73］。但是其缺陷也很明顯，次級代謝產物的合成通常是需要很多酶或輔助蛋白共同參與的復雜過程，包括產物的釋放、轉運和后修飾等，只激活一個核心基因得到的只是一個中間體或者根本無法得到產物。特異性轉錄調控因子激活策略可以很好彌補這一不足，獲得了很好的應用效果。真菌次級代謝產物合成基因簇內通常會有一個轉錄調控因子，可以特異性地調控其所在基因簇的轉錄，從而調控代謝產物的合成［74］。通過啟動子替換或者過表達方式激活特異性轉錄調控因子，可以進一步激活整個基因簇，從而獲得最終產物［75-77］。除此之外，將基因簇在模式底盤細胞中進行異源重構也是一種常用的基因簇挖掘研究策略［78］，常用的底盤細胞包括大腸桿菌［79］、釀酒酵母［25］、鏈霉菌［80］和為絲狀真菌開發(fā)的構巢曲霉［81］。異源重構策略對于沒有特異性轉錄調控因子的基因簇尤為重要。它的缺點在于基因簇通常較大，很難準確預測各基因的相關性和作用順序，目標基因數(shù)量多，操作難度大。

土曲霉作為洛伐他汀降血脂藥物開發(fā)的成功案例，其出色的次級代謝產物合成能力很早就受到研究者的關注，發(fā)現(xiàn)了很多新穎的化合物（表1）。生物信息學分析也證實了土曲霉確實具有強大的次級代謝產物合成能力，有31 個PKS、17 個NRPS、19 個類NRPS 以及2 個PKS-NRPS 雜合酶。除了洛伐他汀之外，近年來還有不少土曲霉基因簇被成功鑒定，并發(fā)現(xiàn)了絲狀真菌次級代謝產物合成新機制。但是，這些研究主要集中在PKS 和NRPS 類，萜類和吲哚類的研究還比較少。下文將對部分代表性研究工作進行介紹，包括化合物類型、生物合成途徑和研究方法。

表1 土曲霉已被研究基因簇及其下游產物Tab.1 Biosynthetic gene clusters and products identified in A.terreus

續(xù)表

4.1 聚酮類天然產物

聚酮是研究較多的一類次級代謝產物，土曲霉中共有31 個PKS 基因，其中13 個的產物已經(jīng)被鑒定。 其中洛伐他汀基因簇和10， 11-dehydrocurvularin基因簇都分別含有2個PKS基因，azasperpyranones基因簇含有3個PKS。

4.1.1 土曲霉酮

土曲霉酮（+）-terrein是土曲霉中最主要的次級代謝產物之一，具有抗菌、抗癌、抑制植物生長等多種生物活性。土曲霉酮的結構于20 世紀50年代被鑒定，隨后的生物合成途徑研究證明了其來源于聚酮合成途徑［98］，是從一個6元環(huán)變到5元環(huán)［82］，直到2014 年其生物合成基因簇和合成途徑才被發(fā)現(xiàn)（圖6）。Zaehle 等［83］在挖掘土曲霉黑色素合成基因簇時，發(fā)現(xiàn)敲除nrPKS 基因ATEG_00145（terA）使菌株失去了土曲霉酮合成能力。隨后通過生物信息學和轉錄水平分析對其基因簇進行了預測，并進行了基因敲除驗證，結合異源重構提出了其生物合成途徑。TerA 以乙酰輔酶A作為起始單元、以丙二酰輔酶A 作為延伸單元，但它的產物鏈長控制并不嚴謹，會因延伸次數(shù)差異合成不同分子量的產物，當4個丙二酰輔酶A 延伸單元被利用時會合成 2， 3-dehydro-6-hydroxymellein，進一步被TerB 或其他酮還原酶還原為6-hydroxymellein，并最終在TerC、TerD、TerE 和TerF 的作用下形成終產物土曲霉酮。目前，具體在哪些酶作用下從6 元環(huán)中間產物變成變成5元環(huán)土曲霉酮尚不清楚，有待進一步解析。隨后，該課題組還發(fā)現(xiàn)土曲霉酮生物合成至少受三種獨立的環(huán)境因素誘導，甲硫氨酸、限氮和缺鐵，這些環(huán)境因素通過全局調控因子AreA、AtfA 和HapX 將信號最終傳遞至生物合成基因簇，誘導土曲霉酮合成［99］。

圖6 (+)-Terrein的生物合成基因簇及合成途徑Fig.6 Gene cluster in the biosynthesis pathway of(+)-terrein in A.terreus

4.1.2 土曲霉酸

土曲霉酸（terreic acid）也是一種從土曲霉中分離得到的quinone epoxide化合物，具有良好的抑制布魯頓氏酪氨酸激酶活性而成為潛在的癌癥治療藥物，因此受到關注。Boruta 等［100］通過OSMAC 策略激活了土曲霉ATCC20542 中terreic acid的生物合成，然后根據(jù)生物信息學分析推測其生物合成的是PKS ATEG_06275 所在基因簇（從ATEG_06272 到ATEG_06278），但是并未進行實驗驗證。2014年，Guo等［84］將土曲霉中核心基因atX（ATEG_06275） 兩側從ATEG_06270 到ATEG_06282的12個基因分別進行敲除，通過對敲除菌株發(fā)酵液的分析，鑒定了terreic acid 的生物合成基因簇，并提出了初步的生物合成途徑假設，但是仍有一些問題未解決。隨后，蔡孟浩課題組通過在甲醇酵母中進行合成途徑的異源重構，修正并完善了terreic acid 的生物合成途徑［85］。由hrPKS AtX 合成并釋放中間產物6-methylsalicylic acid，在脫羧酶AtA的催化下脫羧羥化形成3-methylcatechol，進一步在P-450單加氧酶AtE作用下生成3-methyl-1，2，4-benzenetriol，然后在被環(huán)氧酶AtD 氧化羥基化生成terremutin，最后在氧化還原酶AtC的作用下形成terreic acid（圖7）。

4.1.3 黃綠青霉素

黃綠青霉素（citreoviridin）是一種ATP 合酶抑制劑，被作為乳腺癌靶向治療藥物研究。研究人員發(fā)現(xiàn)生物體中負責某抑制劑生物合成的基因簇中通常會存在一個額外的靶基因拷貝或者一個抗性基因，以這些抗性基因作為定位導向，可作為預測抑制劑類型次級代謝產物生物合成基因簇的有效策略。研究人員利用生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，citreoviridin 的作用靶點ATP 合成酶β 鏈CtvE 位于hrPKS CtvA（ATEG_09617）所在基因簇內，從而推測該基因簇即負責citreoviridin 生物合成。Lin等［90］通過在構巢曲霉中重構citreoviridin 生物合成途徑，發(fā)現(xiàn)ctvA、ctvB、ctvC和ctvD即可實現(xiàn)citreoviridin 的生物合成。首先，由核心酶CtvA 合成一個α-pyrone 中間體，在SAM 依賴型甲基轉移酶CtvB 的催化下羥基甲基化生成citreomontanin，然后末端烯烴異構化形成（17Z）-hexaene，再被FAD 單加氧酶CtvC 雙環(huán)氧化，最終由水解酶CtvD催化tetrahydrofuran ring 的形成，進而生成終產物citreoviridin（圖8）。

4.2 非核糖體肽類天然產物

非核糖體肽類化合物是由NRPS 合成的含氨基酸次級代謝產物，土曲霉中共有17 個NRPS 基因，目前，其中4 個的產物已經(jīng)被鑒定。

圖7 Terreic acid的生物合成基因簇及合成途徑Fig.7 Gene cluster in the biosynthesis pathway of terreic acid in A.terreus

圖8 Citreoviridin的生物合成基因簇及合成途徑Fig.8 Gene cluster in the biosynthesis pathway of citreoviridin in A.terreus

Acetylaranotin 是一種屬于多硫代二酮哌嗪（epipolythiodioxopiperizine， ETP） 的類真菌毒素，通常具有獨特的二硫化橋或多硫化橋。根據(jù)絲狀真菌ETP 類化合物生物合成基因簇系統(tǒng)發(fā)育分析，土曲霉中有兩個疑似NRPS 基因ATEG_03470 和ATEG_08427 負責acetylaranotin 的合成［101］。2013 年，Wang 課題組［93］通過基因敲除的方式確認ATEG_03470 是acetylaranotin 合成的核心酶， 敲除ATEG_03470 之后不再合成acetylaranotin。進一步通過生物信息學分析和體內基因敲除鑒定了acetylaranotin 的生物合成基因簇，包括NRPS 基因ataP（ATEG_03470）和8 個相關基因，并基于敲除菌株中間產物積累和生物信息學分析提出了生物合成途徑（圖9）。兩個苯丙氨酸在核心酶AtaP 的作用下形成二聚體cyclo-（L-Phe-L-Phe），由AtaTC 中AtaC 結構域催化發(fā)生雙羥基化，然后在AtaIMG 的谷胱甘肽轉移酶結構域（AtaG）作用下結合兩分子谷胱甘肽，緊接著又通過二肽酶AtaJ 水解脫去兩分子谷氨酸，在ATaIMG 的碳-硫裂解酶結構域（AtaI）作用下繼續(xù)水解生成表二硫醇中間體。AtaTC 的巰基氧化酶結構域（AtaT）將游離的兩個巰基氧化形成跨環(huán)二硫化橋，并由P-450 酶AtaF 催化發(fā)生雙環(huán)氧化，進一步生成具有吡咯烷結構的中間體，然后在?；D移酶AtaH 作用下乙?；?，最終通過苯甲酸對-羥化酶AtaY 催化形成oxepine 環(huán)，獲得acetylaranotin［93］。

圖9 Acetylaranotin的生物合成基因簇及合成途徑Fig.9 Gene cluster in the biosynthesis pathway of acetylaranotin in A.terreus

4.3 類非核糖體肽天然產物

NRPS-like 與NRPS 的差異在于C 結構域，被TE 或R 結構域所取代。土曲霉中共有19 個NRPSlike 基因，Wang 課題組做了比較系統(tǒng)的研究，目前有6個已經(jīng)完成了產物鑒定［2，7，95］。

黑色素是自然界中一種常見的色素，真菌通過合成黑色素來抵御逆境。真菌比較常見的黑色素是一種來源于真菌聚酮途徑的二羥基萘（DHN）類黑色素，但是基因組挖掘并未在土曲霉中發(fā)現(xiàn)合成DHN 黑色素的PKS 基因。Guo 等［2］發(fā)現(xiàn)在土曲霉中敲除NRPS-like ATEG_03563（atmelA）后，會產生白化的孢子。進一步的基因敲除和體外酶活等實驗證實ATEG_03563 和酪氨酸酶ATEG_03564 負責合成一種新的非典型孢子色素Aspmelanin，并提出了其生物合成途徑［95］。兩分子的對羥基苯丙酮酸在AtmelA 的作用下生成aspulvinone E，然后在酪氨酸酶TyrP的催化下發(fā)生羥基化生成不穩(wěn)定的中間產物，并最終自發(fā)形成孢子色素Asp-melanin。在此期間研究人員還發(fā)現(xiàn)孢子色素Asp-melanin 合成過程中存在空間調控現(xiàn)象（圖10）。AtmelA 和ApvA（ATEG_02004）這兩個NRPS-like 合成的產物都是化合物aspulvinone E，ApvA 只在菌絲中產生aspulvinone E 并最終形成aspulvinone 類化合物，而AtmelA 只在分生孢子中產生aspulvinone E，并最終參與孢子色素的合成［102］。另外還發(fā)現(xiàn)，催化aspulvinone E 形成aspulvinone H 的異戊烯基轉移酶AbpB，同時還可以催化NRPS-like BtyA（ATEG_02815）的產物butyrolactone Ⅱ發(fā)生類似的反應生成butyrolactone I。這種空間分布可能是轉錄調控及酶定位的差異導致的，也說明真菌次級代謝產物合成具有復雜的調控機制。

4.4 萜類天然產物

萜類是最豐富的一類次級代謝產物，結構新穎且活性好，在植物和真菌中都有大量存在。土曲霉有很好的萜類合成潛力，含有12 個萜類生物合成基因簇，絕大部分還未被鑒定，值得關注。

4.4.1 Aspterric acid

Aspterric acid 是一種強效除草劑，抑制二羥酸脫水酶（DHAD）的活性可達亞微摩爾級。土曲霉中aspterric acid 的生物合成基因簇是通過抗性基因作為預測導向被發(fā)現(xiàn)的。研究人員分析發(fā)現(xiàn)DHAD 同源基因astD位于一個萜類合成基因簇內，基因簇中包括一個TC 基因astA（ATEG_04416），還有兩個細胞色素P-450 酶基因astB和astC。由于該基因簇在土曲霉中是沉默的，Yan 等［97］將該基因簇中的基因逐步在釀酒酵母中異源表達，成功產生了aspterric acid 和其中間體，從而解析了其生物合成途徑（圖11）。farnesyl diphosphate 在AstA的作用下環(huán)化生成（-）-daucane，然后在AstB 的作用下進一步氧化，將甲基轉化為羧酸并形成環(huán)氧化物，另一個甲基被AstC 氧化生成羥基并推動分子內環(huán)氧化合物的開環(huán)，生成aspterric acid。

圖10 土曲霉Asp類黑色素的生物合成機制Fig.10 Biosynthesis of Asp-melanin in A.terreus

4.4.2 土曲雜萜

圖11 Aspterric acid的生物合成基因簇及合成途徑Fig.11 Gene cluster in the biosynthesis pathway of aspterric acid in A.terreus

土曲雜萜（terretonin）是土曲霉中一種聚酮-萜類雜合的混源萜類化合物，早在20 世紀80 年代，研究人員就用同位素標記證明terretonin 的合成包括聚酮和萜類途徑［103］。這說明其生物合成應該同時需要PKS 和異戊烯基轉移酶參與。Guo等［88］通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)nrPKS 基因ATEG_10080（trt4）附近有一個異戊烯基轉移酶基因ATEG_10078（trt2），這表明trt4和trt2可能參與terretonin 的合成。隨后基因敲除實驗證實了這一推測，結合與構巢曲霉austiol合成基因簇的比對分析結果，最終確定了合成terretonin 基因簇的范圍，并初步提出了terretonin 的生物合成途徑假設。Matsuda 等［89］通過在米曲霉中異源重構的方式進一步完整解析了terretonin 的生物合成途徑。即Trt4 負責合成并釋放聚酮化合物3， 5-dimethylorsellinic acid （DMOA）， 然后farnesyl pyrophosphate（FPP）與DMOA 在Trt2 的催化下生成farnesyl-DMOA，緊接著依次在Trt5、Trt8、Trt1、Trt9、Trt3 的作用下發(fā)生甲基化、環(huán)氧化、環(huán)化、氧化和羥基化生成terrenoid，隨后在多功能P-450 酶Trt6 和異構酶Trt14 共同作用下形成terretonin D，最終由Trt7 催化兩次氧化生成terretonin（圖12）。該雜合化合物是由基因簇內兩個不同類型核心酶共同參與合成的。

4.5 聚酮-非核糖體肽雜合天然產物

PKS-NRPS雜合酶是一類比較特殊的次級代謝產物合成核心酶，此類酶中同時含有PKS 和NRPS模塊，因此其產物通常是聚酮和氨基酸的含氮復合物，結構新穎，所以受到關注。土曲霉NIH2624基因簇注釋結果顯示土曲霉只有一個PKS-NRPS雜合酶基因ATEG_00325。近期，本研究組通過基因組挖掘策略在土曲霉中又發(fā)現(xiàn)了一個PKS-NRPS雜合酶ATEG_00913。

圖12 Terretonin的生物合成基因簇及合成途徑Fig.12 Gene cluster in the biosynthesis pathway of terretonin acid

4.5.1 異戊二霉素

PKS-NRPS 雜合酶編碼基因ATEG_00325 所在基因簇在實驗室條件下是沉默的，Gressler 等［96］研究發(fā)現(xiàn)該基因簇的表達受部分氨基酸的誘導和糖的抑制，RT-PCR 分析顯示在產生異戊二霉素（isoflavipucine）的條件下與ATEG_00325 相鄰的一些基因的轉錄水平有相關性，預測isoflavipucine的生物合成基因簇可能包含ATEG_00325、ATEG_00326、 ATEG_00329、 ATEG_00330、 ATEG_00331 這五個基因，并且通過同位素標記實驗推測了其可能的生物合成途徑，但是很多關鍵的反應還有待實驗驗證（圖13）。這項研究不僅提出了一種系統(tǒng)誘導真菌沉默基因簇的方法，還關注到了初級和次級代謝產物之間的緊密聯(lián)系。

4.5.2 土曲吡喃酮

土曲霉MEFC01 重測序后進行antiSMASH 分析發(fā)現(xiàn)了之前被注釋為PKS 的ATEG_00913（pytA）其實是一個PKS-NRPS 編碼基因。由于該基因簇在實驗室條件下是沉默的，本研究組用土曲霉內源組成型強啟動子PgpdAt替換基因簇中特異性轉錄調控因子ATEG_00919的天然啟動子，成功激活了這個沉默的基因簇，發(fā)現(xiàn)該基因簇合成一類土曲吡喃酮（pyranterreones）化合物。隨后，通過氨基酸C13 標記方式確定雜合酶的NRPS 模塊是選擇絲氨酸作為延伸底物，結合基因敲除結果提出了這類聚酮-氨基酸雜合化合物的生物合成途徑（圖14）［76］。該研究從基因組測序到沉默基因簇激活，再到基因敲除和分子探針標記，是絲狀真菌次級代謝產物基因組挖掘的一個成功案例。

4.6 合成一個目標天然產物的兩個獨立基因簇間的協(xié)同調控機制

如上所述實例，次級代謝產物的合成通常只含有一個核心基因，只有少數(shù)基因簇中含有兩個核心基因，如洛伐他汀基因簇含有兩個PKS。另外，次級代謝產物合成相關基因通常位于同一個基因簇內，極少有兩個獨立的基因簇共同合成一個化合物。近期，本研究組在土曲霉中發(fā)現(xiàn)了一種復雜新穎的絲狀真菌次級代謝產物合成及調控機制（圖15）。

圖13 Isoflavipucine的生物合成基因簇及合成途徑Fig.13 Gene cluster in the biosynthesis pathway of isoflavipucine in A.terreus

基因簇A含有ATEG_03629（nrPKS）和ATEG_03630（NRPS-like）兩個核心基因，基因簇B 含有ATEG_07659（hrPKS）和ATEG_07661（nrPKS）兩個核心基因，由于這兩個基因簇在實驗室基本培養(yǎng)基條件下是沉默的，以前報道都只是通過異源重構方式進行了初步鑒定。Zhao 課題組在釀酒酵母中異源表達了ATEG_03629 和ATEG_03630 這兩個核心酶基因，發(fā)現(xiàn)其能夠合成5-甲基苔色醛［104］。Wang 課題組通過在構巢曲霉中異源重構ATEG_07659/ATEG_07661 基因簇，發(fā)現(xiàn)該基因簇能夠合成asperfuranone［81］。本研究組通過培養(yǎng)條件優(yōu)化成功激活這兩個基因簇，并意外發(fā)現(xiàn)這兩個獨立基因簇共同參與合成一類含有6/6/6/6 稠環(huán)（6/6/6/6 tetracyclic system） 的新化合物azasperpyranones。在此基礎上，進一步通過體內基因敲除和體外酶學驗證，對兩個基因簇內各基因進行了功能分析，系統(tǒng)解析該類化合物的生物合成途徑。同時，還發(fā)現(xiàn)這兩個獨立的基因簇之間雖然存在空間距離，但是存在一種由三個轉錄調控因子介導的多層級轉錄調控，使得它們能夠相互協(xié)調共同參與同一個化合物的合成［92］。

圖14 Pyranterreones的生物合成基因簇及途徑Fig.14 Gene cluster in the biosynthesis pathway of pyranterreones in A.terreus

圖15 兩個獨立基因簇協(xié)同合成化合物azasperpyranonesFig.15 Synergistic synthesis of azasperpyranones under the catalysis of key enzymes encoded by two gene clusters

這是首次在絲狀真菌中發(fā)現(xiàn)由兩個獨立的基因簇中的四個核心基因共同合成一個次級代謝產物，也是首次發(fā)現(xiàn)兩個獨立基因簇在多層級的協(xié)同調控機制下共同作用，這種合成機制有助于生物合成結構更加復雜的化合物，并獲得更加有益于生存的生物活性。該發(fā)現(xiàn)對于研究絲狀真菌合成復雜化合物的生物機制具有重要意義，為真菌次級代謝產物生物合成途徑解析和新型天然產物基因組挖掘提供了新思路。

5 土曲霉底盤細胞的合成生物技術應用前景

很多具有應用價值的次級代謝產物由于天然宿主調控機制復雜、培養(yǎng)難度大或者周期較長等因素，生產效率非常低，嚴重阻礙了其應用開發(fā)前景，例如植物、難培養(yǎng)微生物和一些極端微生物。隨著合成生物學近年來的快速發(fā)展，構建目標產品導向的異源高效微生物細胞工廠成為研究熱點。將完整的合成途徑在底盤細胞進行異源重構，以避免天然宿主的特異性調控，從而實現(xiàn)高產，而在此過程中底盤細胞的選擇非常重要。通過工業(yè)發(fā)酵生產衣康酸和洛伐他汀，土曲霉展現(xiàn)出了強大的初級代謝產物和次級代謝產物生產能力，以及良好的工業(yè)發(fā)酵性能，生長快速、營養(yǎng)需求簡單且碳源利用率高，工業(yè)生產具有高效率、低成本的優(yōu)勢。并且土曲霉產孢能力強、抗逆性能好，菌絲體發(fā)酵形態(tài)適合大規(guī)模發(fā)酵，在我國已經(jīng)建立了成熟的土曲霉發(fā)酵工藝，最大單罐體積300t。由此可知，這些土曲霉工業(yè)菌株具備作為底盤細胞用于合成生物技術開發(fā)不同目標產品的優(yōu)良條件，工業(yè)發(fā)酵放大難度相對較小，有利于實現(xiàn)最終的產業(yè)化應用。

5.1 次級代謝產物基因組挖掘的異源底盤細胞

在異源底盤細胞中重構合成途徑是鑒定沉默基因簇的一種有效方法，真菌天然產物由于其生物合成機制的一些特殊性，使得其在大腸桿菌和釀酒酵母等模式生物中很難高效異源重構。首先，大腸桿菌屬于原核生物，缺少真核生物轉錄后mRNA 剪接機制，釀酒酵母雖然屬于真核生物，但是并不能很準確地識別其它真核生物基因內含子和外顯子，異源表達時都需要使用目的基因的cDNA，尤其是在基因簇包含的基因較多時操作難度會較大。其次，由于缺少相關的磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶，PKS 和NRPS 在野生型大腸桿菌和釀酒酵母中都沒有活性，通過引入合適的外源磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶可以解決該問題，但是活性仍舊較低［25，79］。另外，真菌P-450催化系統(tǒng)與原核生物的具有一定特殊性，還原伴侶不能通用，而且絲狀真菌P-450 酶在細菌或釀酒酵母中功能性表達難度很大。絲狀真菌作為異源表達宿主可以很大程度上避免這些問題，可以準確地完成其他真菌來源基因轉錄后的后修飾，不需要額外去除基因中的內含子，可以實現(xiàn)合成基因簇的整體轉移整合。研究人員開發(fā)并利用構巢曲霉作為底盤細胞成功鑒定了一些真菌沉默基因簇的產物，這說明用絲狀真菌作為底盤細胞是切實可行的［81］。但是，如果底盤細胞次級代謝產物本身的合成能力較弱，獲得產物量會很少，會增加后續(xù)研究的難度。產洛伐他汀土曲霉工業(yè)菌株具有很高的洛伐他汀產量，這說明其次級代謝產物合成能力強，合成前體供應充足，P-450 催化系統(tǒng)高效，更容易實現(xiàn)目標途徑化合物的高產，有助于新型天然產物生物合成途徑解析研究。

5.2 聚酮類化合物高效合成的細胞工廠

聚酮類化合物在絲狀真菌、蕈菌和植物中廣泛存在，并顯示出很好的應用價值，如藥物和天然色素等，很多中藥的活性成分也是聚酮。有些化合物由于產量太低或者培養(yǎng)種植效率太低，大量制備難度大，成本很高，限制了其下游研發(fā)或推廣應用。土曲霉工業(yè)菌株卓越的洛伐他汀生產能力說明其聚酮類天然產物合成的上游途徑非常發(fā)達，作為底盤細胞用于生產其他異源次級代謝產物，尤其是聚酮類化合物時可以保證充足的底物供應，是目標化合物高產的重要保障。例如，蒽醌類化合物大黃素是中藥大黃的主要活性成分，也是一種天然色素，由于中藥植物種植效率低、限制多，使得其成本很高且產能很低，應用市場受限。近期，本研究組以產洛伐他汀土曲霉工業(yè)菌株作為底盤細胞，開發(fā)了能直接合成大黃素的細胞工廠，初步搖瓶發(fā)酵產量達到了2g/L［105］。這說明土曲霉確實是聚酮類化合物生物合成的理想底盤細胞，至于其他類型天然產物的適用性有待評估。而且，成熟的土曲霉工業(yè)發(fā)酵基礎，使其相較于其它底盤細胞開發(fā)的細胞工廠，在發(fā)酵規(guī)模放大方面難度相對較小，更具產業(yè)化競爭力。

5.3 高值有機酸生物合成的細胞工廠

如前所述，產衣康酸土曲霉菌株能快速地通過中心代謝途徑，將簡單的葡萄糖碳源轉化成衣康酸，其他有機酸副產物極少，說明它具有很好的葡萄糖攝取及轉化能力。而且該菌株具有很好的低pH 耐受能力，發(fā)酵初始pH 約4.0，開始產酸后pH可降至2.0。例如，反式烏頭酸是一種不飽和三羧酸，具有很好的殺線蟲活性和成為具有重要應用價值生物基化學品的潛力，但是由于缺乏可靠的生產方式，其應用潛力未能挖掘。近期，本研究組以產衣康酸工業(yè)菌株為底盤細胞，將其改造成能夠發(fā)酵生產反式烏頭酸的細胞工廠，初步的20t 發(fā)酵罐示范產量達到30g/L［106］。發(fā)酵過程中pH 低至1.5，在該條件下大腸桿菌和酵母等底盤細胞很難正常生長。因此，在設計初級代謝產物細胞工廠時，尤其是酸性化合物，土曲霉是一種可供選擇的底盤細胞。

6 展望

隨著合成生物技術的快速發(fā)展，很多微生物底盤細胞被陸續(xù)開發(fā)和應用。土曲霉作為絲狀真菌底盤細胞，因其卓越的發(fā)酵性能和成熟的工業(yè)應用基礎而受到關注。相較于目前已經(jīng)開發(fā)相對成熟的其他模式微生物體系，土曲霉合成生物技術研究還有很多不足之處需要加強。首先，可選用的遺傳元件少，如篩選標記、啟動子和終止子等，遺傳元件是合成生物技術開發(fā)的基礎模塊，遺傳改造元件庫的建設將是一個重要研究任務。尤其是啟動子，包括土曲霉在內的絲狀真菌啟動子元件很少進行系統(tǒng)表征，其強弱及變化趨勢都不明確，這也使得絲狀真菌目前還很難像大腸桿菌和釀酒酵母等模式生物那樣進行相對定量可控性的遺傳改造。其次，CRISPR/Cas9基因編輯技術有待開發(fā)，一些絲狀真菌中已經(jīng)成功開發(fā)了CRISPR/Cas9基因編輯技術，展現(xiàn)出明顯先進性的同時也有一些不足，比如編輯效率比在酵母中要低得多，不同基因位點的編輯效率也不同，還有應用策略有局限性，目前還僅限于基因的定點突變、替換和敲除破壞。在開發(fā)適用于土曲霉CRISPR/Cas9基因編輯技術的同時應該努力改善上述缺陷。最后，細胞工廠性能評估也是合成生物技術開發(fā)的一個重要環(huán)節(jié)，相較于單細胞微生物，多細胞真菌的高通量分析難度更大，開發(fā)可靠的高通量篩選和發(fā)酵評估方法將是一個很具挑戰(zhàn)的任務。加強上述研究將顯著提升土曲霉及絲狀真菌合成生物技術研究水平，提供更多可供選擇的設計策略，構建更加高效的土曲霉細胞工廠。此外，這些也是絲狀真菌相關研究中的共性問題，土曲霉合成生物技術研究也將促進其他絲狀真菌的發(fā)展。