從翻譯后修飾角度解析人工合成途徑與底盤細胞的適配性

尤迪，葉邦策，2

（1 華東理工大學微分析與生物系統(tǒng)工程實驗室，生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海200237； 2 浙江工業(yè)大學工程生物學與健康研究中心，長三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，藥學院，杭州 浙江310014）

自20 世紀初創(chuàng)建以來，合成生物學突破了傳統(tǒng)的“自上而下”理念，形成了以人工設(shè)計為主導(dǎo)、系統(tǒng)化和標準化生物技術(shù)為手段的“自下而上”正向工程學思路，構(gòu)建標準化和通用型的生物元件模塊（如基因線路、酶、代謝途徑等），在簡約型底盤細胞中進行整合、測試和優(yōu)化，實現(xiàn)定量可控的平臺化新生命系統(tǒng)的高效運行?；诤铣缮飳W的工業(yè)生物技術(shù)也成為了解決當前人類健康、資源、能源和環(huán)境等問題最具潛力的技術(shù)方法。在合成生物學的飛速發(fā)展過程中，產(chǎn)物合成核心元件的標準化及其與底盤細胞的適配性則是制約人工生物合成系統(tǒng)“能力提升”的“卡脖子”問題［1］。為了克服這一難題，我們必須解決以下幾個基礎(chǔ)問題：闡明合成代謝調(diào)控機制，建立微生物合成的理論與方法，設(shè)計及構(gòu)建人工微生物合成體系（工程化菌種），實現(xiàn)生物合成的定向性和高效性。

現(xiàn)有的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用菌株主要是通過傳統(tǒng)的隨機選育方法或單一代謝途徑修飾的方法獲得。生物學家逐漸發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的代謝工程方法僅僅通過合成途徑的優(yōu)化改造，對于高效生物合成的作用是非常有限的，甚至導(dǎo)致對細胞行為的不良影響，危及整個工程菌的性能［2-3］。隨著生命科學技術(shù)的發(fā)展，系統(tǒng)生物技術(shù)方法、網(wǎng)絡(luò)調(diào)控分子機制、人工元件設(shè)計及模型優(yōu)化已經(jīng)越來越滲透到微生物合成體系研究領(lǐng)域［4-6］，微生物高效合成產(chǎn)物主要取決于合成途徑中關(guān)鍵節(jié)點酶的催化效率及前體供應(yīng)，考慮到合成代謝通路的動力學控制并不僅僅局限在一個單獨的反應(yīng)或途徑中，而是分布在整個網(wǎng)絡(luò)甚至整個系統(tǒng)中，微生物合成的工程改造必須從單個代謝通路的優(yōu)化轉(zhuǎn)變到代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及生物系統(tǒng)的優(yōu)化（圖1）。因此，加深理解微生物合成代謝與調(diào)控的分子基礎(chǔ)，揭示工程化設(shè)計的（內(nèi)源及外源）生物合成體系與細胞整體代謝網(wǎng)絡(luò)的交互作用及適配性機制是當前微生物合成理論與方法研究的重要方向。

微生物擁有極其復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和響應(yīng)機制以應(yīng)對培養(yǎng)環(huán)境及胞內(nèi)代謝狀態(tài)變化，利用多種調(diào)控模式調(diào)節(jié)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)及代謝流分布［4，7-12］。已有的研究表明，微生物細胞調(diào)控其（內(nèi)源性或嵌入性）工程化設(shè)計生物合成體系有以下3 種方式：基因轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)節(jié)胞內(nèi)代謝酶豐度［13-15］；變構(gòu)效應(yīng)及翻譯后修飾調(diào)控胞內(nèi)代謝酶活性［16-17］；前體供應(yīng)及輔因子濃度影響合成代謝反應(yīng)速率［18-19］。與此同時，代謝工程及合成生物學的研究重點也相應(yīng)地聚焦在：生物合成元件的挖掘、設(shè)計、優(yōu)化、改造及組裝；調(diào)控元件及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化，維持合成代謝酶的高表達；前體及輔因子工程，強化前體與輔因子供應(yīng)；代謝酶優(yōu)化改造，解除產(chǎn)物的變構(gòu)反饋抑制。這些分工明確的系統(tǒng)性研究深化了對微生物合成理論與方法的理解，實現(xiàn)了微生物藥物［20-23］、生物燃料及化學品［24-27］、生物基聚合物［28-30］的高效合成。然而，作為微生物固有體系的組分， 翻譯后修飾（post-translational modification， PTM）系統(tǒng)對工程化生物合成途徑的調(diào)控機制及合成效率的影響仍缺乏系統(tǒng)研究，基于翻譯后修飾的代謝工程及合成生物學也鮮有報道。

圖1 底盤細胞對人工生物合成途徑的影響（基因表達調(diào)控、前體及輔因子供應(yīng)、酶活性調(diào)控和產(chǎn)物轉(zhuǎn)運等）Fig.1 Effect of chassis cells on artificial biosynthesis pathways(gene expression regulation,precursor and cofactor supply,enzyme activity regulation,product transport,etc.)

1 ?；鵆oA與蛋白質(zhì)?；揎?/h2>

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是一種所有生命體都廣泛存在的重要調(diào)控機制，主要包括磷酸化、甲基化、?；取TM 能夠通過酶活性調(diào)節(jié)，改變亞細胞定位、與分子伴侶間相互作用、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及其與DNA 結(jié)合能力等方式，賦予其修飾蛋白質(zhì)全新的功能和性質(zhì)。

以酰基化為代表的蛋白質(zhì)翻譯后修飾一直是廣受追捧的研究熱點。1964 年Allfrey 和同事首次在真核細胞中，發(fā)現(xiàn)了組蛋白的賴氨酸存在乙?；揎?，并指出這種乙?；揎椌哂兄匾霓D(zhuǎn)錄調(diào)控功能［31-32］；1997 年非組蛋白（如腫瘤抑制蛋白p53）中也發(fā)現(xiàn)了賴氨酸乙酰化修飾的存在［33］；2002 年更進一步發(fā)現(xiàn)了原核細胞中可逆賴氨酸乙?；╮eversible lysine acylation，RLA）對乙酰CoA 合成酶活性的調(diào)控機制［34］。隨著高分辨率質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究證實RLA 是一種真核細胞及原核細胞中都廣泛存在的蛋白質(zhì)功能調(diào)控模式［34-36］。

蛋白質(zhì)的乙?；且粋€動態(tài)可逆的過程，生物體存在兩種蛋白質(zhì)乙?；瘷C制：①酶催化機制，通過乙酰轉(zhuǎn)移酶將乙酰CoA 上的乙?；鶊F轉(zhuǎn)移到賴氨酸側(cè)鏈氨基；②非酶乙酰化機制，酰基化反應(yīng)是高放熱反應(yīng)，且形成的酰胺鍵非常穩(wěn)定，細胞內(nèi)高濃度的乙酰CoA或乙酰磷酸（AcP）在堿性pH 條件下可自發(fā)乙?；鞍踪|(zhì)賴氨酸的側(cè)鏈氨基［37-38］。由于兩種乙?；瘷C制（酶催化和非酶催化）在細胞中同時存在，目前尚無有效方法區(qū)分底物蛋白的乙?；揎検怯赡姆N機制產(chǎn)生。去乙?；磻?yīng)是蛋白質(zhì)乙酰化的逆向反應(yīng)，在酶催化和非酶催化的乙酰化反應(yīng)中，有部分能通過去乙?；傅拇呋撊ヒ阴；?，另一部分則不能發(fā)生去乙酰化，細胞如何處理這些不能脫去乙酰化的蛋白質(zhì)的機理尚不明確。

乙?；泻土速嚢彼幡?氨基的正電荷，提高其疏水性的同時增大賴氨酸側(cè)鏈體積。因此，賴氨酸的乙?；瘯种破鋫?cè)鏈形成氫鍵，及其與負電荷殘基發(fā)生靜電相互作用的能力，卻能增加與其他蛋白相互作用的范德華力。除了乙?；鶊F之外，其他?；鶊F也可以?；嚢彼岬膫?cè)鏈氨基，如丙酰化［39］、丁?；?0］、琥珀?；?1］、丙二?；?2］、戊二?；?3］、巴豆?；?4］、β-羥基丁?；?5］，以及最新發(fā)現(xiàn)的苯甲酰化［46］、乳酸化［47］等。不同的?；揎椩斐闪说鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的多元性，以調(diào)節(jié)酶催化活性、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或與其他分子間相互作用的方式影響細胞的代謝過程。根據(jù)?；鶊F性質(zhì)的不同，?；揎椏煞譃?類：①疏水非極性?；绫；⒍□；桶投辊；?，它們在乙?；嚢彼釟埢幕A(chǔ)上，延伸了烴鏈，進一步增加其疏水性；②極性?；?，例如β-羥基丁酰化和2-羥基異丁?；?，其特點是包含一個可與其他分子形成氫鍵的羥基；③酸性?；?，例如丙二酰化、琥珀?；臀於；?，這種類型的酰基化修飾能使賴氨酸電荷由+1 變?yōu)?1，電荷改變程度與磷酸化相當（由0到-2），因此，這類酰基化修飾與前兩類差異顯著。這些修飾基團結(jié)構(gòu)和功能的多樣性無疑增加了蛋白質(zhì)修飾機制與調(diào)控研究的復(fù)雜性［36］。

?；揎椀陌l(fā)生與基礎(chǔ)營養(yǎng)代謝的失衡緊密相關(guān)。微生物細胞內(nèi)氮源匱乏或碳流溢出導(dǎo)致胞內(nèi)AcP 和乙酰CoA 積累，繼而引發(fā)高水平的蛋白質(zhì)乙?；?，這些乙?；鞍锥酁榇x酶并且大量分布于TCA 循環(huán)、糖酵解、脂肪酸代謝、丙酮酸代謝等多種中心代謝途徑，緩沖碳流過量帶來的壓力，反饋影響中心代謝，葡萄糖、乙酸、乳酸等碳源的過量均能導(dǎo)致這種乙?；答佇?yīng)［38，48-49］。

隨著翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究證實，蛋白質(zhì)酰基化水平的改變依賴于與之對應(yīng)的?；鵆oA 濃度。微生物中不同的酰基CoA 來源也不盡相同，例如，乙酰CoA 和琥珀酰CoA 主要來源于TCA 循環(huán)，丙二酰CoA 主要來源于乙酰CoA 羧化酶催化的乙酰CoA 羧化反應(yīng)（脂肪酸合成的第一步反應(yīng)）。因此，乙?；顽牾；赡芘c能量代謝關(guān)聯(lián)，丙二?；揎梽t可能與脂肪酸代謝相關(guān)。這種推測在隨后的研究中得到證實，由葡萄糖/丙酮酸添加引起的糖酵解及TCA 循環(huán)增強，細胞內(nèi)乙酰化和琥珀?；揎椝揭搽S之提升［50］；抑制脂肪酸合成酶的情況下，丙二酰CoA 累積，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)丙二?；揭搽S之升高［51］。此外，外源脂肪酸鹽的添加同樣會引起細胞內(nèi)?；降牟▌?，乙酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽或丁酸鹽的添加均能通過增加胞內(nèi)相應(yīng)?；鵆oA積累引起酰基化修飾水平的顯著提高［52］。

2 ?；鵆oA與微生物天然產(chǎn)物合成

微生物，是目前已知的天然產(chǎn)物或次級代謝產(chǎn)物合成的主要底盤細胞，利用微生物生產(chǎn)所得的次級代謝產(chǎn)物例如抗生素、生物堿、萜類、酚類等廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)為代表的多種產(chǎn)業(yè)中。葡萄糖、脂肪酸、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)代謝為次級代謝產(chǎn)物合成提供所需的各種?；鵆oA 類前體和輔因子，這些前體物質(zhì)的供給充足是產(chǎn)物合成的先決和保障，前體物質(zhì)的供應(yīng)能力也在一定程度上決定和制約著產(chǎn)物的合成能力。

2.1 ?；鵆oA積累促進產(chǎn)物合成

乙酰CoA不僅是TCA 循環(huán)的必需組分，也是細胞內(nèi)脂質(zhì)、氨基酸和次級代謝產(chǎn)物合成的重要前體，乙酰CoA還能通過各種途徑轉(zhuǎn)化生成其他?；鵆oA，用于更多代謝產(chǎn)物如聚酮類、芪類、黃酮類、生物能源類及生物材料等物質(zhì)的合成。聚酮類化合物具有多樣的分子結(jié)構(gòu)、功能和生物活性，比如抗細菌（紅霉素、四環(huán)素）、抗真菌（灰黃霉素、兩性霉素）、抗寄生蟲（阿維菌素、奈馬克丁）、抗癌（多柔比星）以及免疫抑制（雷帕霉素）等。聚酮類物質(zhì)的合成與脂肪酸合成類似，是一種鏈延伸式的合成方式：在聚酮合酶（PKSs）的催化作用下，以酰基CoA為起始單元，不同類型的其他?；鵆oA（如乙酰CoA、丙酰CoA、丙二酰CoA、甲基丙二酰CoA等）為延伸單元，重復(fù)脫羧縮合形成聚酮鏈環(huán)。例如，紅霉糖多孢菌的紅霉素合成，一個起始單元丙酰CoA和六個延伸單元甲基丙二酰CoA由多個PKSs催化縮合形成紅霉素的主環(huán)6-脫氧紅霉內(nèi)酯B（6-dEB）；抗生素鏈霉菌的竹桃霉素合成，以乙酰CoA為起始單元，6個甲基丙二酰CoA為延伸單元；委內(nèi)瑞拉鏈霉菌的酒霉素合成，以丙酰CoA為起始單元，1個丙二酰CoA和4個甲基丙二酰CoA為延伸單元；諾爾斯鏈霉菌的制霉菌素合成，以乙酰CoA為起始單元，3個甲基丙二酰CoA及15個丙二酰CoA為延伸單元等。植物合成的芪類和黃酮類化合物（例如赤松素和白藜蘆醇），是由植物特有的PKS Ⅲ催化丙二酰CoA合成，在微生物中通過合成生物學方法設(shè)計合成途徑，異源表達PKS Ⅲ，也能實現(xiàn)這類物質(zhì)的高效合成。生物能源類物質(zhì)（如丁醇、長鏈脂肪醇、脂肪酸及烷烴等），多以乙酰CoA、丙二酰CoA及其他?；鵆oA為合成前體。聚羥基脂肪酸酯（PHA）由乙酰CoA及各種羥基脂酰CoA聚合而成，是一種具有良好的生物相容性、生物可降解性和熱加工性能的天然高分子生物材料。

通過代謝工程及合成生物學手段強化?；鵆oA前體的供應(yīng)，是提高產(chǎn)物合成效率的常用策略。例如，在黃酮類物質(zhì)的生物合成中，通過過表達異源乙酰CoA羧化酶和敲除酰基CoA：甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶的方式，優(yōu)化丙二酰CoA合成途徑，增強丙二酰CoA供應(yīng)，顯著促進泥質(zhì)鏈霉菌中光神霉素合成［18］。在委內(nèi)瑞拉鏈霉菌中，敲除前體（2S）-丙二酸乙酯酰CoA代謝相關(guān)基因meaA，共表達泰樂菌素聚酮合酶與途徑特異型調(diào)控因子PikD，增強前體供應(yīng)，使泰樂酮產(chǎn)量提高了10倍［19］。在紅霉素的工業(yè)生產(chǎn)中，利用適量濃度正丙醇的添加，增強丙酰CoA 供應(yīng)，激活丙酰CoA羧化酶，加速甲基丙二酰CoA的轉(zhuǎn)化率，可提高紅霉素的產(chǎn)量［53-54］；通過敲除丙酰CoA羧化酶的負調(diào)控蛋白PccD，提高丙酰CoA的同化效率和甲基丙二酰CoA供應(yīng)，實現(xiàn)了紅霉素產(chǎn)量的翻倍［55］。在天藍色鏈霉菌中，敲除G6P脫氫酶和過表達乙酰CoA羧化酶，增強丙二酰CoA的供應(yīng)，最終使放線菌素的產(chǎn)量提高了近5倍［56］。

在芪類物質(zhì)的合成中，通過增加丙二酰CoA供應(yīng)，同樣可以實現(xiàn)白藜蘆醇和赤松素生物合成的顯著提高［57-58］。在倍半萜青蒿素的前體紫穗槐二烯的生物合成中，通過過表達乙醛脫氫酶和乙酰CoA 合成酶，增強乙酰CoA 代謝流，使得紫穗槐二烯產(chǎn)量提高了一倍［59］。通過重塑中心代謝的方式，提高胞內(nèi)乙酰CoA 供應(yīng)，實現(xiàn)倍半萜烯類化合物法呢烯（β-farnesene）發(fā)酵單位達130g/L［60］。在生物能源類物質(zhì)的生物合成中，提高乙酰CoA供應(yīng)，可使正丁醇產(chǎn)量提升2倍，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)敲除乙醇脫氫酶ADH1-5和過表達乙醛脫氫酶突變體adeEA267T/E568K，強化乙酰CoA 供應(yīng)，正丁醇產(chǎn)量進一步增加了40%［61］。

除了提高前體酰基CoA的供應(yīng)之外，消除與產(chǎn)物合成無關(guān)的?；鵆oA消耗也是強化前體供應(yīng)的有效手段。以常用的底盤細胞大腸桿菌為例，高速生長期代謝溢出產(chǎn)生的乙酸是有氧發(fā)酵的主要副產(chǎn)物，乙酸積累對細胞生長和產(chǎn)物合成都有負面影響，是一種碳源的損耗［62］。因此，針對這種碳源損耗的代謝工程改造有利于提高產(chǎn)物的合成。

乙酸主要來源于兩個途徑：磷酸轉(zhuǎn)乙?；?乙酸激酶（Pta/AckA）途徑和丙酮酸氧化酶（PoxB）途徑［63］。在大腸桿菌中，敲除pta能夠有效減少乙酸生成，同時增加產(chǎn)物白介素-2 和脂肪酶的合成［64-65］；敲除pta同樣能使脂肪酸產(chǎn)量提高20%［66］；同時敲除pta和ackA可使乙酸異戊酯產(chǎn)量增加一倍［67］，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)敲除poxB雖然能進一步降低乙酸生成，但產(chǎn)物產(chǎn)量卻沒有隨之增加［68］。在真氧產(chǎn)堿桿菌和棕色固氮菌中采用相同的策略，同樣實現(xiàn)聚羥基丁酸酯（PHB）產(chǎn)量提高2.5 倍［69-71］。Mccleary 等［72］認為，敲除Pta/AckA 途徑能有效減少乙酸的生成，但也會造成ATP 和AcP 合成受限，可能在一定程度上影響細胞的生長代謝。對此，Kim等［73］采用反義RNA技術(shù)降低Pta/AckA表達水平，也可實現(xiàn)產(chǎn)物產(chǎn)量2倍的增長。

為了實現(xiàn)產(chǎn)物合成的最優(yōu)化，除了針對Pta/AckA 途徑和PoxB 途徑的敲除/敲低之外，也需要配合其他競爭途徑關(guān)鍵酶的敲除改造。例如，組合敲除ackA、乳酸脫氫酶和富馬酸還原酶，可使乙醇產(chǎn)量提高2 倍［74］；組合敲除乳酸脫氫酶、乙醇脫氫酶和富馬酸還原酶，可使正丁醇產(chǎn)量提高1 倍［75］；組合敲除pta、富馬酸還原酶、乳酸脫氫酶和乙醇脫氫酶，結(jié)合培養(yǎng)條件的優(yōu)化，可使丁酸鹽終產(chǎn)量提高近10倍［76］。

2.2 ?；鵆oA積累誘發(fā)?；种菩?yīng)

外源性或內(nèi)源性因素引起的細胞內(nèi)?；鵆oA波動是翻譯后修飾調(diào)控系統(tǒng)啟動的“開關(guān)”。胞內(nèi)?；鵆oA 的累積誘發(fā)產(chǎn)物合成相關(guān)代謝途徑大量代謝酶和調(diào)控蛋白的?；?，抑制終產(chǎn)物合成，這種翻譯后修飾引發(fā)的反饋調(diào)控主要表現(xiàn)在兩個層面：轉(zhuǎn)錄層面調(diào)控和翻譯后修飾層面調(diào)控。

轉(zhuǎn)錄層面的調(diào)控主要通過調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的?；綄崿F(xiàn)。微生物的生長過程往往伴隨著碳、氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)的供給波動，由不同轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能夠消除營養(yǎng)物質(zhì)劇烈波動引起的代謝紊亂，以及由此產(chǎn)生的對細胞生長、分化、繁殖和次級代謝產(chǎn)物合成的不良影響。大量的研究發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)許多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是?；男揎椀孜?，其修飾位點多位于DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，通過改變賴氨酸的電荷，抑制與DNA 的結(jié)合活性的方式影響靶基因的轉(zhuǎn)錄［77-79］。例如，類球紅細菌中氧敏調(diào)控因子FnrL 的乙?；种破渑c靶標DNA 的相互作用［80］；沙門氏菌中亮氨酸響應(yīng)調(diào)控因子Lrp 的乙?；瘜?dǎo)致其DNA 結(jié)合活性的顯著降低［81］，毒力調(diào)控因子PhoP 的乙?；芙档推涠拘裕?2］，毒力調(diào)控因子HilD 的乙?；茉鰪娖浞€(wěn)定性［83］；天藍色鏈霉菌中氮調(diào)控因子GlnR 的多位點乙?；@著抑制其DNA 結(jié)合能力和協(xié)同調(diào)控能力［84］；紅霉糖多孢菌中磷調(diào)控因子PhoP 的丙?；瘡娏乙种破銹HO 結(jié)構(gòu)域的DNA 結(jié)合活性，削弱對靶基因的調(diào)控能力［85］。微生物的生長和次級代謝產(chǎn)物合成過程并非依賴某一調(diào)控因子的單線調(diào)控，而是涉及更為復(fù)雜的包括全局調(diào)控因子和特異性調(diào)控因子在內(nèi)的多線交互調(diào)控［86-87］，這些調(diào)控因子的?；揎?，在影響靶基因轉(zhuǎn)錄的同時，也可能對初級代謝和次級代謝產(chǎn)生其他重要的影響。

翻譯后修飾層面的調(diào)控則是通過?；；鵆oA合成的催化酶，調(diào)節(jié)其酶活性實現(xiàn)。雖然不同?；鵆oA 的來源有所不同，但是內(nèi)/外源的脂肪酸同化是其共通的來源途徑。微生物細胞脂肪酸的同化途徑有三種：?；鵆oA合成酶途徑，?；鵄cP合成酶途徑和脂肪酸激酶途徑。其中，?；鵆oA合成酶途徑的催化酶是最為典型的?；揎椀孜?。以乙酰CoA 合成酶（Acs）為例，其活性受到關(guān)鍵位點的可逆乙?；{(diào)控，乙?；軌蛑苯右种朴袡C酸的腺苷化和乙酰CoA 的合成［88］，已有的研究報道涉及大腸桿菌［89-90］、假單胞菌［91］、枯草芽孢桿菌［92］、鏈霉菌［93-96］和分枝桿菌［97］等多種微生物。除了Acs以外，其他?；鵆oA合成酶也存在類似的翻譯后修飾調(diào)控，?；鵆oA合成酶的活性對于細胞生長和次級代謝產(chǎn)物合成尤為重要，其活性異常不僅會導(dǎo)致?；鵆oA供應(yīng)異常、胞內(nèi)能量失衡、嚴重時甚至還會引發(fā)細胞的生長缺陷［98-99］。

酰基化修飾對代謝酶或調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后修飾水平的雙層調(diào)控會直接影響?；鵆oA類前體的有效供應(yīng)和次級代謝產(chǎn)物的合成。例如，以丙酰CoA 為前體的紅霉素合成途徑中，外源添加正丙醇或丙酸鹽會誘發(fā)全局調(diào)控因子PhoP 以及紅霉素合成途徑催化酶丙二酸半醛脫氫酶、丙醛脫氫酶、SAM 合成酶和丙酰CoA 合成酶的丙?；?，抑制紅霉素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄、前體丙酰CoA 的利用和紅霉素合成［100］；以丙二酰CoA 為前體的十一烷基靈菌紅素生物合成中，丙二酸鹽添加引起高水平的蛋白質(zhì)丙二?；?，抑制產(chǎn)物的合成［101］；以丁酰CoA 為前體的丁醇合成過程中，丁醇合成途徑代謝酶的丁酰化也抑制了終產(chǎn)物的合成［101］；在人工構(gòu)建的大腸桿菌細胞工廠用于赤松素的合成過程中，同樣存在由于產(chǎn)物合成途徑催化酶（4-對香豆酸連接酶和芪合成酶）的丙二?；种屏舜呋钚裕瑥亩鴮?dǎo)致赤松素的產(chǎn)率下降［16］。

綜上所述，酰基CoA 積累對合成代謝具有雙重效應(yīng)：一方面，前體供應(yīng)的增加，能夠促進生物合成效率；另一方面，?；w的增加，會造成合成代謝途徑相關(guān)酶的?；教岣?，抑制代謝酶催化活性及產(chǎn)物合成效率。因此，解析?；鵆oA“雙重身份”——?；w及代謝前體之間的相互影響與平衡，揭示?；揎棇铣纱x酶活性的調(diào)控機制，從?；鵆oA 平衡及蛋白質(zhì)翻譯后修飾角度研究微生物（內(nèi)源或外源）合成途徑與底盤細胞自身代謝網(wǎng)絡(luò)的互作機制，協(xié)調(diào)合成途徑各元件之間、合成途徑與底盤細胞之間的適配性等是微生物合成體系設(shè)計與優(yōu)化需要解決的共性科學問題（圖2）。

3 翻譯后修飾代謝工程策略及應(yīng)用

?；鵆oA 的代謝樞紐地位，以及在基礎(chǔ)營養(yǎng)代謝和合成代謝之間“承上啟下”的角色，推動了一系列圍繞?；鵆oA 展開的代謝工程和生物合成設(shè)計與改造工作。以工程策略側(cè)重點的不同，分為傳統(tǒng)的“開源節(jié)流型”——增加前體供應(yīng)的同時消除競爭途徑的消耗，和新型的“平衡型”——翻譯后修飾代謝工程改造策略。

翻譯后修飾代謝工程（PTM-ME）是2018 年由我國科學家提出的一種新型的微生物合成代謝優(yōu)化設(shè)計策略［16-17］，與傳統(tǒng)策略所不同的是，該策略集合了傳統(tǒng)策略“開源節(jié)流”的優(yōu)點，取長補短，從?；鵆oA 平衡及蛋白質(zhì)翻譯后修飾角度分析微生物內(nèi)源性或嵌入性工程化設(shè)計生物合成體系與細胞整體代謝網(wǎng)絡(luò)之間的互作機制，通過調(diào)節(jié)和優(yōu)化代謝酶/?；到y(tǒng)，提高合成代謝途徑代謝流以及與底盤細胞的適配性（圖3）。該策略的基本路線是：解析?；x的調(diào)控機制→篩選產(chǎn)物反饋抑制的關(guān)鍵靶點→代謝酶酰基化的脫敏改造或?；到y(tǒng)的優(yōu)化改造，消除反饋抑制，強化產(chǎn)物合成。目前，PTM-ME 策略已成功應(yīng)用于聚酮化合物（紅霉素）、生物能源類物質(zhì)（丁醇）以及芪類化合物（赤松素）的高效合成。

圖2 ?；鵆oA積累對合成代謝的雙重效應(yīng)Fig.2 Dual effects of acyl-CoA accumulation on anabolism

圖3 翻譯后修飾代謝工程策略原理示意圖Fig.3 Schematic diagram for the PTM-ME strategy

3.1 PTM-ME應(yīng)用于紅霉素的高效合成

紅霉素是醫(yī)藥和畜牧業(yè)中常用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。在紅霉素的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，研究者發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)丙二酰化和丙?；瘯绊懢w生長及紅霉素的合成，且胞內(nèi)丙二?；?丙?；脚c產(chǎn)物合成效率呈負相關(guān)［17，85，100-101］。紅霉素合成前體丙二酰CoA/丙酰CoA 的適量供應(yīng)有利于產(chǎn)物合成，當前體丙二酰CoA/丙酰CoA 積累過量時，又會產(chǎn)生?；?yīng)，抑制產(chǎn)物合成。Xu等［85］運用丙二?；揎椊M學技術(shù)，從132 個蛋白上共鑒定到192 個丙二?；揎椢稽c，結(jié)合生物信息學分析發(fā)現(xiàn)丙二?；揎椀鞍自诤颂求w及中心代謝途徑中顯著富集，其中，乙酰CoA 合成酶（Acs）和谷氨酰胺合成酶的活性受到丙二?；娘@著抑制。由于正丙醇或丙酸鹽添加是提高紅霉素發(fā)酵單位的常用手段，研究者隨后對丙?；M學的研究證實，?；鵆oA 濃度的動態(tài)改變會引起蛋白質(zhì)酰基化水平與紅霉素產(chǎn)量隨之改變的連鎖反應(yīng)。利用定量酰基化組學技術(shù)，酶學特征分析和?；M分析，研究者確定了丙?；揎検怯绊懠t霉素產(chǎn)量的關(guān)鍵修飾，從兩個層面負調(diào)控紅霉素的合成： 一是通過抑制丙二酸半醛脫氫酶（MmsA2）、丙醛脫氫酶（Adh）、SAM 合成酶（SAMS）和丙酰CoA 合成酶（PrpE）的活性阻礙丙酰CoA 的合成；二是通過對全局調(diào)控因子PhoP 的抑制，降低其PHO 結(jié)構(gòu)域的DNA 結(jié)合活性，削弱靶基因紅霉素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄［13］以及細胞對碳源的利用。在此基礎(chǔ)上，研究者利用PTM-ME 策略，對酰基化酶和?；揎椣到y(tǒng)分別進行了脫敏和優(yōu)化改造。通過敲除丙酰轉(zhuǎn)移酶（GNAT）、過表達去丙酰化酶（SrtN）和?；幻舾忻福⊿ACE_1780）等方式，消除丙?；瘜t霉素合成的抑制作用，最終實現(xiàn)工業(yè)高產(chǎn)菌中紅霉素的產(chǎn)量翻番［81，96-97，99］（圖4）。

圖4 PTM-ME應(yīng)用于紅霉素的高效合成示意圖Fig.4 Efficient synthesis of erythromycin with the PTM-ME strategy

3.2 PTM-ME應(yīng)用于丁醇的高效合成

在生物能源類物質(zhì)丁醇的生物合成中，丙酮丁醇梭菌由產(chǎn)酸期到產(chǎn)醇期的過渡伴隨著由生長狀態(tài)到孢子狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，以及胞內(nèi)AcP 和丁酰磷酸（BuP）含量的升高，從而導(dǎo)致對數(shù)中后期胞內(nèi)乙酰化和丁?；降纳撸?7］。研究者通過定量?；M學分析，一共鑒定到458個乙?；稽c和1109 個丁?；稽c，顯著富集于丁醇合成相關(guān)的丙酮酸途徑、丁酸鹽途徑和丁酰CoA 合成途徑。結(jié)合深入的分析挖掘，篩選出了由于活性受到乙酰化/丁?；种贫绊懢w產(chǎn)醇的代謝酶，包括醇/醛脫氫酶AdhE1、丁醛脫氫酶BdhA、乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶（CA_C2873）、3-羥基丁酰CoA 脫氫酶（Hbd）、3-羥基丁酰CoA 脫氫酶（Crt）、丁基CoA 脫氫酶（Bcd）等［101］。利用PTM-ME 策略對這些代謝酶的進行改造，也能夠一定程度上消除丁?；姆答佉种?，提高丁醇產(chǎn)量（本文作者團隊未發(fā)表的數(shù)據(jù)）。

3.3 PTM-ME 應(yīng)用于大腸桿菌人工合成赤松素的高效合成

PTM-ME 除了能應(yīng)用于內(nèi)源性生物合成途徑的優(yōu)化改造，對于嵌入型生物合成途徑的優(yōu)化及其與底盤細胞適配性的調(diào)節(jié)同樣適用。以赤松素為例，研究者在底盤細胞大腸桿菌中嵌入了赤松素的3 個合成元件：苯丙氨酸氨基裂解酶PAL，4-對香豆酸CoA 連接酶4CL 和芪合成酶STS。其運作原理是，PAL 利用苯丙氨酸轉(zhuǎn)化生成反式-肉桂酸，經(jīng)4CL 催化生成反式-肉桂酰CoA，再由STS催化與三分子丙二酰CoA縮合生成終產(chǎn)物赤松素。

在人工構(gòu)建的赤松素合成過程中，由于丙二酰CoA 前體的供應(yīng)是赤松素合成的限速步驟，因此添加丙二酰CoA激活劑淺藍霉素，能有效提高丙二酰CoA前體的供應(yīng)和赤松素產(chǎn)量［58］。在隨后的淺藍霉素添加過程中，研究者再次發(fā)現(xiàn)了由于?；种茖?dǎo)致的產(chǎn)物合成下降的現(xiàn)象，過量的淺藍霉素添加誘發(fā)了三個合成元件催化酶的丙二?；揎棧ㄟ^抑制4CL 和STS 的活性，阻礙赤松素的合成。對此，研究者利用PTM-ME策略，對酰基化敏感的4CL和STS丙二?；稽c進行改造，采取將賴氨酸替換為精氨酸的方式，將其改變?yōu)閷︴；幻舾械臓顟B(tài)，在一定程度上消除了酰基化抑制效應(yīng)，使得赤松素產(chǎn)量提高了近兩倍（圖5）［16］。這些研究表明，PTM-ME策略對于解除內(nèi)源性及外源性產(chǎn)物合成途徑中?；鵆oA誘發(fā)的?；答佉种?、強化產(chǎn)物合成，都具有十分可觀的成效。

圖5 PTM-ME應(yīng)用于赤松素的高效合成示意圖Fig.5 Efficient synthesis of pinosylvine with the PTM-ME strategy

4 總結(jié)與展望

基因工程技術(shù)和模塊元件設(shè)計與構(gòu)建方法的不斷進步，加速了以產(chǎn)物合成最優(yōu)化為導(dǎo)向的“量身定做”型合成生物學的發(fā)展進程。但是，構(gòu)建標準、高效、可控的微生物細胞工廠仍然面臨嚴峻挑戰(zhàn)，究其根本，微生物底盤細胞自身的代謝網(wǎng)絡(luò)與產(chǎn)物合成途徑/嵌入式產(chǎn)物合成途徑的兼容性一直是亟待解決的核心問題。

雖然已有的代謝工程策略從多個角度，提高前體供應(yīng)，阻斷競爭旁路，盡最大可能實現(xiàn)產(chǎn)物合成通路代謝流的最優(yōu)化，但是不得否認的是，產(chǎn)量瓶頸極大地阻礙了微生物細胞工廠的開發(fā)潛力。尋求產(chǎn)量的突破，從合成生物學的角度來說，“平衡”是不容忽視的，在產(chǎn)物合成途徑中前體?；鵆oA 的供應(yīng)一旦超過了底盤細胞利用極限，就會觸發(fā)酰基化效應(yīng)，也可以理解為?；鳛橐环N臨時的碳源存儲，緩解了碳源過量對細胞的傷害，這也是產(chǎn)物合成途徑與底盤細胞“失配性”的體現(xiàn)。如何解決“失配性”向“適配性”的轉(zhuǎn)變，讓細胞維持最小的生長所需，實現(xiàn)最大的產(chǎn)物合成，就必須要考慮?；揎棇A(chǔ)代謝和合成代謝的反饋作用。

微生物代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極其復(fù)雜，內(nèi)源性或嵌入的工程化設(shè)計生物合成體系與細胞整體代謝網(wǎng)絡(luò)存在多方面多層次交叉互作，PTM-ME 策略正是在增強前體供應(yīng)代謝工程和消除競爭途徑代謝工程的基礎(chǔ)上，引入了平衡前體供應(yīng)和前體利用的理念，以微生物?；揎椪{(diào)控機制為指導(dǎo)，設(shè)計針對?；揎椀母脑彀悬c，減少?；揎椧鸬奶紦p耗及碳流抑制，提高產(chǎn)物合成效率。如果把整個生物合成系統(tǒng)比作一臺“電腦”，那么PTM-ME 的角色就是“散熱器”，緩解過載運行的熱量堆積，保障“CPU”的高速運作。因此，PTM-ME 策略不應(yīng)僅僅局限于代謝工程設(shè)計，也可嘗試拓展應(yīng)用于元件工程、線路工程、基因組與細胞工程等領(lǐng)域的設(shè)計，促進蛋白質(zhì)翻譯后修飾線路在生物技術(shù)領(lǐng)域的推廣。雖然PTM-ME 技術(shù)現(xiàn)處于初級階段，但可以預(yù)見的是，若與其他工程策略的聯(lián)手組合，結(jié)合最新的基因編輯等優(yōu)質(zhì)技術(shù)，定能實現(xiàn)“1+1＞2”的功效，賦予細胞更大更強的產(chǎn)能。我們相信，在不久的將來，翻譯后修飾代謝工程及其優(yōu)化策略能夠在智能人工合成途徑與底盤細胞的設(shè)計、組裝、優(yōu)化以及工業(yè)化方面做出重要貢獻。