合成生物學(xué)在感染性疾病防治中的應(yīng)用

蒲璐，黃亞佳，楊帥，金帆

（中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院，中國(guó)科學(xué)院定量工程生物學(xué)重點(diǎn)研究室，廣東 深圳 518055）

合成生物學(xué)是生物科學(xué)在21 世紀(jì)出現(xiàn)的一個(gè)分支學(xué)科。在近20 年的時(shí)間里，合成生物學(xué)已經(jīng)發(fā)展成為一門通過(guò)結(jié)合工程學(xué)和生物學(xué)原理，以系統(tǒng)合理的方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化的生物元件進(jìn)行重組、創(chuàng)造和設(shè)計(jì)，來(lái)獲取具有可預(yù)測(cè)性和應(yīng)用性的功能型生物裝置、系統(tǒng)或生物體的科學(xué)［1］。隨著對(duì)可用基因模塊的不斷開(kāi)發(fā)，以及對(duì)生物分子模塊的進(jìn)一步了解，并結(jié)合數(shù)學(xué)建模，合成生物學(xué)家們可以借鑒基因和基因組的基本要素及其組合原理，來(lái)設(shè)計(jì)、合成和重建已存在的基因元件或構(gòu)建新的基因零件來(lái)重塑生命系統(tǒng)［2-4］。

合成基因回路中包含了基本的信號(hào)響應(yīng)調(diào)控元件，這些元件可以受特定的外源刺激或內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的激活，對(duì)后續(xù)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控［5］。這些可以控制基因的“開(kāi)關(guān)”通常是觸發(fā)誘導(dǎo)型蛋白質(zhì)和DNA 之間［6-7］或是適配體和轉(zhuǎn)錄開(kāi)啟之間［8-9］的相互作用，反過(guò)來(lái)說(shuō)，信號(hào)響應(yīng)調(diào)控元件與調(diào)控因子的相互作用通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄翻譯，響應(yīng)外源性或內(nèi)源性的輸入信號(hào)?；蜷_(kāi)關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)改善了不同功能基因在同一時(shí)空表達(dá)的兼容性［10］，使得復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建成為可能，如多觸發(fā)信號(hào)輸入和時(shí)序控制［11-12］、共同控制［13-14］和反饋控制［15］回路元件等，同時(shí)也使得可預(yù)測(cè)功能性的復(fù)雜蛋白能夠?qū)崿F(xiàn)高精度原位的動(dòng)態(tài)表達(dá)。

合成生物學(xué)的理念和方法被運(yùn)用到生物醫(yī)學(xué)中，為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)注入了新的思路和策略。合成生物學(xué)療法的基本原理，如圖1 所示，是通過(guò)將人工構(gòu)建的生物分子或“編程化”的有機(jī)體等人工合成生物系統(tǒng)轉(zhuǎn)入宿主內(nèi)，重建內(nèi)穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)疾病引起的系統(tǒng)紊亂或功能異常等［16］。合成生物學(xué)已在感染性疾病、代謝性疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等的診斷治療和預(yù)防上顯示出巨大的潛力［17］。本文作者著重介紹合成生物學(xué)在感染性疾病診療和預(yù)防中的研究進(jìn)展。

1 感染性疾病概述及其治療瓶頸

一般將感染性疾?。?8］定義為由病原微生物引起的機(jī)體疾病，常見(jiàn)的如炎癥或器官功能障礙等。感染性病原體的種類包括細(xì)菌、病毒、真菌等。其中細(xì)菌感染性疾病有鼠疫、百日咳、猩紅熱以及細(xì)菌性敗血癥等；病毒感染性的疾病種類較多，最常見(jiàn)的是流行病毒引起的感冒，另外還有病毒性肝炎、麻疹、帶狀皰疹等；真菌感染導(dǎo)致的疾病，常見(jiàn)的比如腳氣病，就是皮膚癬菌引起的足部皮膚真菌感染［19］。病原菌更容易侵襲免疫力低下的人群，引起各種感染性疾病。

針對(duì)不同的病原體引起的感染，有相對(duì)應(yīng)的診斷和治療方案。利用抗生素、抗毒素等直接消滅病原體或消除毒素的藥物治療是感染性疾病的基本治療手段。然而，隨著抗病原體藥物的廣泛長(zhǎng)期使用，病原體的耐藥性日漸增強(qiáng)，遠(yuǎn)快于人們研制新抗病原體藥物的速度。某些地區(qū)抗生素的濫用有時(shí)反而使感染概率增加或感染加重，特別對(duì)一些自身有免疫缺陷病的患者，用抗病原體藥物已經(jīng)難以控制其體內(nèi)的病原體感染［20］。

圖1 合成生物學(xué)治療原理[16]Fig.1 Schematic for synthetic biology therapy[16]

2 合成生物學(xué)對(duì)抗感染性疾病的優(yōu)勢(shì)

為了解決病原體造成的人類健康問(wèn)題，研究者們開(kāi)始嘗試新的方法，合成生物學(xué)的理念也因此被應(yīng)用到感染性疾病的治療和預(yù)防中。在過(guò)去十幾年里，針對(duì)感染性疾病防治的工程化合成生物學(xué)醫(yī)學(xué)元件逐步邁向臨床化，其中一部分現(xiàn)已經(jīng)處于從理論、體外試驗(yàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到臨床試驗(yàn)的過(guò)渡階段。

相比于傳統(tǒng)依靠化學(xué)合成獲取抗病原體藥物，合成生物學(xué)通過(guò)對(duì)現(xiàn)有生物系統(tǒng)進(jìn)行改造，實(shí)現(xiàn)微生物自我繁殖，不需要建立大型化工廠，成為更加高效、清潔、符合市場(chǎng)期待的新興技術(shù)。進(jìn)入21世紀(jì)后，新抗病原體藥物的研發(fā)進(jìn)入瓶頸期，以“造物”為特色的合成生物學(xué)的出現(xiàn)正好滿足了人們的期望。不同于大多數(shù)的廣譜抗病原體藥物，合成生物學(xué)療法通常針對(duì)特定的目標(biāo)病原體，并且可以根據(jù)病人的實(shí)際情況給出定制性的方案。此外，隨著計(jì)算機(jī)科學(xué)與合成生物學(xué)相結(jié)合，通過(guò)算法、模型、機(jī)器學(xué)習(xí)等手段來(lái)設(shè)計(jì)基因回路，預(yù)測(cè)合成效果，模擬代謝路徑，記錄過(guò)程與結(jié)果，優(yōu)化體系，使得合成效率和效果得到不斷的提升，大大縮短了開(kāi)發(fā)新藥的時(shí)間，這些都是傳統(tǒng)治療手段無(wú)法比擬的。

如今，合成生物學(xué)已在感染性疾病的領(lǐng)域做出了初步嘗試，逐漸改變了對(duì)病原體的診斷和治療方式；在細(xì)菌感染性疾病中顯示出了理想的治療效果和巨大的潛力；為病毒感染性疾病致病機(jī)理的研究提供了新的思路；并參與到了感染性疾病預(yù)防的研究中。

3 合成生物學(xué)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用

合成生物學(xué)在疾病診斷方面已展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)。合成生物學(xué)家通過(guò)人工設(shè)計(jì)基因回路改造人體自身細(xì)胞、細(xì)菌、病毒等生命體，這些人工構(gòu)建的生命體能夠感知疾病特異性信號(hào)或人工信號(hào)、特異性靶向異常細(xì)胞和病灶區(qū)域，表達(dá)報(bào)告分子，達(dá)到疾病診斷的目的。有的人工改造生命體同時(shí)具備診斷和治療的功能，會(huì)在檢測(cè)到目標(biāo)信號(hào)的同時(shí)，釋放治療藥物。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)是目前核酸檢測(cè)的主流方法。而近年來(lái)，基于規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）技術(shù)的檢測(cè)手段因其快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便、對(duì)專業(yè)設(shè)備和基礎(chǔ)設(shè)施要求低等特性正快速發(fā)展起來(lái)。

2014年，Collins等［21］首次將CRISPR/Cas技術(shù)引用核酸分子診斷，開(kāi)發(fā)了一種低成本的能區(qū)分出寨卡病毒（Zika Virus，ZIKV）亞型的紙基傳感器。這種檢測(cè)方法首先是從樣本中提取RNA 靶標(biāo)并進(jìn)行擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物滴加到含有凍干細(xì)胞組分和生物蛋白的紙片上，激活凍干組分發(fā)生生化反應(yīng)，紙片會(huì)發(fā)生肉眼可見(jiàn)的顏色變化，從而指示ZIKV 的存在。在此檢測(cè)平臺(tái)的幫助下，可以辨別臨床癥狀相似的ZIKV 和登革熱病毒（Dengue Virus，DENV），正確診斷出患者所感染的病毒類型僅需3h。當(dāng)檢測(cè)到ZIKV 時(shí)，將樣品與凍干的CRISPR/Cas9 混合，利用CRISPR/Cas9 對(duì)PAM 區(qū)域優(yōu)異的序列識(shí)別能力，還可以區(qū)分不同亞型的ZIKV，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速準(zhǔn)確的毒株特異性診斷。

2016 年，張鋒等［22］鑒別出可以被用來(lái)切割細(xì)菌RNA 序列的CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)，深入研究發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)不同于靶向DNA 的CRISPR/Cas9 或CRSPR/Cas12a系統(tǒng)，Cas13a切割完靶標(biāo)RNA后依然保持活性，會(huì)繼續(xù)切割非靶標(biāo)RNA，這種非特異性切割后來(lái)被稱為附屬切割（collateral cleavage）［23］。在此基礎(chǔ)上，張鋒課題組與Collins課題組［23］合作將CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)與重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增 （recombinase ploymerase amplification，RPA）技術(shù)結(jié)合，使樣本中極微量的核酸能夠在37℃、0.5h 內(nèi)實(shí)現(xiàn)數(shù)量級(jí)的擴(kuò)增，同時(shí)加入了一個(gè)單鏈RNA 熒光報(bào)告探針，組成新的診斷工具“SHERLOCK”（specific highsensitivity enzymatic reporter unlocking），用來(lái)檢測(cè)ZIKV、DENV 或其他病原體等。如圖2 所示，SHERLOCK 的工作流程是：靶標(biāo)RNA 經(jīng)RPA 和T7 RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增后，激活Cas13a的附屬切割活性，切割底物產(chǎn)生熒光信號(hào)，經(jīng)檢測(cè)靈敏度已達(dá)到5×10-14mol/L。2018 年，張鋒團(tuán)隊(duì)［24］再次升級(jí)了SHERLOCK 技術(shù)，推出SHERLOCK v2，新版本的檢測(cè)系統(tǒng)中引入了3種來(lái)自不同種屬細(xì)菌的Cas13 蛋白和Cas12a 蛋白（LwaCas13a 、PsmCas13b、CcaCas13b 和AsCas12a），能在同一樣品中檢測(cè)出多種病毒感染，如能同時(shí)檢出ZIKA和DENV，從只檢測(cè)1 個(gè)靶標(biāo)RNA 進(jìn)化到同時(shí)檢測(cè)4 個(gè)靶標(biāo)RNA，發(fā)出4 種不同顏色的熒光信號(hào)；并利用CRISPR type-Ⅲ中的Csm6酶，設(shè)計(jì)CRISPR系統(tǒng)使得Cas13 剪切后的序列是Csm6 酶的靶向序列，放大其測(cè)試信號(hào)，進(jìn)一步增強(qiáng)了該方法的靈敏度，定量測(cè)量濃度最終低至2×10-18mol/L，敏感度提高了100倍。同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)還開(kāi)發(fā)了一種玻璃纖維試紙條，SHERLOCK v2 組分可以在紙上凍干再水化，90min就可以檢測(cè)到濃度2×10-8mol/L以上的ZIKA 和DENV 的單鏈RNA。2019 年，Collins等［25］開(kāi)發(fā)了一種可批量應(yīng)用的、可編程的CRISPR 響應(yīng)智能材料體系，可用于便攜、精確、快速、定量且時(shí)空可控地檢測(cè)危險(xiǎn)病毒病原體，區(qū)分病原菌、人類DNA 的基因型。張鋒等［26］將Cas13 的抗病毒活性與其診斷能力結(jié)合起來(lái)，建立了一個(gè)強(qiáng)大和快速可編程的診斷和抗病毒系統(tǒng)，命名為CARVER（Cas13-assisted restriction of viral expression and read out），靶向病人細(xì)胞中淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）、甲型流感病毒（IAV）和皰疹性口炎病毒（VSV）的單鏈RNA，使細(xì)胞中病毒RNA 的水平降低了約30%，流感病毒的感染力降低了約45%，CARVER 技術(shù)使CRISPR/Cas13 技術(shù)邁向靶向治療以及抗病毒藥物開(kāi)發(fā)的新領(lǐng)域。

2018 年Doudna 等［27］發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cas12a 蛋白在剪切靶向的dsDNA 后能高效地切割非特異性單鏈DNA（ssDNA），基于此開(kāi)發(fā)了DETECTR（DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter）技術(shù)。與SHERLOCK 類似，DETECTR 將RPA 與Cas12a相結(jié)合，擴(kuò)增產(chǎn)物激活Cas12a 的附屬切割活性，切割底物產(chǎn)生熒光信號(hào)（圖2）。DETECTR 技術(shù)可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出是否有高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus， HPV） 感染： HPV16（100%）、HPV18（92%），在單核苷酸多態(tài)性分析、癌癥篩查、細(xì)菌和病毒感染檢測(cè)及耐藥性篩查等方面有廣泛的應(yīng)用潛力。

中國(guó)科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所趙國(guó)屏院士團(tuán)隊(duì)王金博士［28］也發(fā)現(xiàn)了Cas12a 對(duì)于靶標(biāo)ssDNA 和非靶標(biāo)ssDNA 的切割特性，并基于此原理開(kāi)發(fā)了 HOLMES （an one-hour low-cost multipurpose highly efficient system）［29］技術(shù)。HOLMES 技術(shù)可以準(zhǔn)確檢測(cè)出諸如日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus， JEV）和偽狂犬病病毒（Pseudo Rabies Virus，PRV）等。

4 合成生物學(xué)在細(xì)菌感染性疾病治療中的應(yīng)用

合成生物學(xué)在細(xì)菌感染性疾病治療中的應(yīng)用，主要集中對(duì)細(xì)菌生物被膜的治療中。

圖2 基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的SHERLOCK[23]和DETECTR[27]檢測(cè)技術(shù)原理示意圖Fig.2 Schematic for molecular diagnostic testing using CRISPR/Cas based technologies SHERLOCK[23]and DETECTR[27]

4.1 細(xì)菌感染性疾病與生物被膜

細(xì)菌感染是致病菌或條件致病菌侵入宿主體內(nèi)，產(chǎn)生毒素和其他代謝產(chǎn)物所引起的局部或全身性感染。按病情的緩急程度，可以將細(xì)菌感染性疾病分為急性感染和慢性感染。實(shí)際上，急性感染和慢性感染是細(xì)菌感染宿主兩個(gè)不同過(guò)程的結(jié)果，這兩種類型的感染涉及細(xì)菌內(nèi)部不同的分子機(jī)制。發(fā)生急性感染時(shí)，細(xì)菌在宿主體內(nèi)處于浮游狀態(tài)，快速的生長(zhǎng)及傳播；而發(fā)生慢性感染時(shí)，細(xì)菌會(huì)選擇在宿主體內(nèi)定殖，形成生物被膜，這個(gè)過(guò)程相對(duì)慢一點(diǎn)，但會(huì)造成長(zhǎng)期持續(xù)性的感染?？股貑?wèn)世后，在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間里，細(xì)菌感染都受到了控制，尤其是急性細(xì)菌感染，抗生素治療往往能收到良好的治療效果。然而近幾十年來(lái)，抗生素用量不斷加大，療效卻難以令人滿意，抗生素不得不更新?lián)Q代，卻依然趕不上耐藥菌株出現(xiàn)的速度。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，高分子材料在醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，留置尿管、中心靜脈插管、氣管插管等操作引起的導(dǎo)管相關(guān)感染［30］（catheter related infection，CRI）越來(lái)越常見(jiàn)，已經(jīng)成為院內(nèi)感染的主要原因，占醫(yī)院感染的80%以上。造成CRI的重要因素之一是導(dǎo)管在體內(nèi)留置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)菌在其表面黏附定殖并形成生物被膜。細(xì)菌生物被膜也是造成長(zhǎng)期慢性細(xì)菌感染和細(xì)菌出現(xiàn)抗生素耐藥性的重要原因之一［31］。

細(xì)菌生物被膜［32］是細(xì)菌黏附于接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂類等，將其自身包裹在其中而形成的大量細(xì)菌聚集體。如圖3所示，生物被膜的形成［33］通常有以下幾個(gè)步驟：初始階段，少量細(xì)菌可逆地黏附在接觸表面；然后細(xì)菌開(kāi)始繁殖，通過(guò)菌體表面黏附性物質(zhì)將彼此黏結(jié)在一起，發(fā)展形成微菌落；以微菌落為基本單位，逐漸形成成熟的生物被膜；生物被膜中的細(xì)菌游離到環(huán)境中去，尋找新的定殖表面。

細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)環(huán)境，幫助自身生存的一種生命形式。細(xì)菌生物被膜相關(guān)的細(xì)菌慢性感染難以根治的原因有以下幾點(diǎn)：①細(xì)菌在宿主體內(nèi)形成的生物被膜使得細(xì)菌具有很強(qiáng)的耐藥性［34］，生物被膜內(nèi)的細(xì)菌幾乎對(duì)所有的抗生素都不敏感，即使依靠高于正常劑量成百倍的藥物也不易徹底治愈；②生物被膜內(nèi)的細(xì)菌能抵抗和干擾宿主的防衛(wèi)機(jī)制，具有極強(qiáng)抗免疫系統(tǒng)的能力，造成持續(xù)性感染；③生物被膜是細(xì)菌感染的病灶，從生物被膜中游離出來(lái)的細(xì)菌除了能進(jìn)一步擴(kuò)大感染，也具有更強(qiáng)的毒性［35］。針對(duì)細(xì)菌慢性感染的治療，更多的是針對(duì)細(xì)菌生物被膜的治療，合成生物學(xué)家們通過(guò)改造噬菌體或工程菌，使其可以瓦解生物被膜，殺死具有強(qiáng)耐藥性的細(xì)菌，或者阻斷細(xì)菌對(duì)抗生素抵抗機(jī)制，削弱這些細(xì)菌的耐藥性，起到輔助治療的作用。

4.2 工程噬菌體在生物被膜治療中的應(yīng)用

噬菌體是侵襲細(xì)菌的病毒，有嚴(yán)格的宿主特異性。鑒于噬菌體是自然存在的細(xì)菌的“獵殺者”，噬菌體成為治療細(xì)菌感染的一種選擇。

在早期具有代表性的一例工程噬菌體研究中，Lu和Collins［36］通過(guò)改造本身就是大腸桿菌宿敵的T7 噬菌體，使其能合成特定的酶來(lái)瓦解細(xì)菌生物被膜，進(jìn)而殺死被保護(hù)在生物被膜中的細(xì)菌。他們成功構(gòu)建了能夠持續(xù)表達(dá)DspB 蛋白的裂解性噬菌體T7-DspB，DspB 蛋白是能夠水解β-1，6-N-乙?；?α-葡萄酰胺的酶，而被水解的物質(zhì)是生物被膜胞外聚合物重要的組成成分，即DspB 能夠破壞生物被膜的外部結(jié)構(gòu)。改造后的工程噬菌體T7-DspB 在消除生物被膜的過(guò)程中采取雙管齊下的攻擊策略，如圖4 所示，在T7-DspB 噬菌體開(kāi)始侵襲生物被膜時(shí)，不斷地增殖和表達(dá)DspB，隨著宿主菌被裂解，新生代的T7-DspB 噬菌體和DspB 也被釋放到生物被膜中，繼續(xù)感染其他細(xì)菌，同時(shí)降解生物被膜。在T7-DspB 噬菌體感染生物被膜體外實(shí)驗(yàn)測(cè)試中，生物被膜中的細(xì)菌數(shù)減少量達(dá)到99.997%，殺菌效果是使用未改造的噬菌體感染生物被膜的約4.5倍。

Lu 課題組［37］于2019 年開(kāi)發(fā)了一種高通量的篩選方法，能夠迅速擴(kuò)大噬菌體的宿主范圍，減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。他們通過(guò)自然進(jìn)化和結(jié)構(gòu)建模，發(fā)現(xiàn)了T3 噬菌體尾絲蛋白中的宿主范圍決定區(qū)域（host-range-determining regions，HRDRs），接著通過(guò)位點(diǎn)定向突變對(duì)這些區(qū)域進(jìn)行高通量的篩選。受到抗體特異性工程的啟發(fā)，這種方法探索出尾絲蛋白深層功能多樣性的同時(shí)，最小化了對(duì)整體尾絲蛋白結(jié)構(gòu)的影響，從而獲得了合成的“噬菌體”。研究發(fā)現(xiàn)，高通量突變HRDRs 篩選出的噬菌體具有廣泛的宿主適用性，這些噬菌體還通過(guò)減緩細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)，在體外試驗(yàn)中表現(xiàn)出長(zhǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制性，并在小鼠模型中展現(xiàn)出相同的抑菌效果。

圖3 生物被膜形成過(guò)程示意圖[33]Fig.3 Schematic of biofilm formation[33]

圖4 利用工程噬菌體T7-DspB消除生物被膜的策略示意圖[36]Fig.4 Schematic for dispersing biofilms with engineered bacteriophage T7-DspB[36]

雖然科學(xué)家們已經(jīng)在利用工程噬菌體防治生物被膜中取得一系列進(jìn)展，如工程噬菌體治療單一或多菌株生物被膜［38-42］后，生物被膜明顯消散，然而由于生物被膜的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，體外體內(nèi)環(huán)境的差異性等原因，完全瓦解病人體內(nèi)的生物被膜依然是亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。工程噬菌體和其他抗菌藥物的聯(lián)合使用，是治療細(xì)菌感染的另一種可選方案。

Ryan 等［43］測(cè)試了聯(lián)合使用T4 噬菌體和頭孢噻肟消除大腸桿菌菌株ATCC11303 形成的生物被膜的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用104PFU/mL 和107PFU/mL的噬菌體可將頭孢噻肟治療大腸桿菌生物被膜的最小生物被膜清除濃度分別再降低2倍和8 倍，噬菌體和抗生素的聯(lián)合使用優(yōu)于單獨(dú)使用抗生素消除生物被膜的效果。比起單獨(dú)使用抗生素治療，噬菌體和抗生素聯(lián)合使用的效果在其他菌株，如金色葡萄球菌［44］和克雷白氏肺炎桿菌［45］等菌株的生物被膜消除中，也有明顯提升的效果。通過(guò)合成生物學(xué)改造后的噬菌體聯(lián)合抗生素使用，在一些情況下會(huì)展示出更好的結(jié)果。諸如環(huán)丙沙星等抗生素會(huì)破壞細(xì)菌的DNA，給細(xì)胞帶來(lái)氧化壓力，致使細(xì)菌啟動(dòng)SOS 響應(yīng)的DNA 修復(fù)系統(tǒng)［46］。Lu 和Collins［47］通過(guò)改造M13 噬菌體，使其能表達(dá)LexA3，而LexA3 可以抑制細(xì)菌SOS 應(yīng)激機(jī)制的開(kāi)啟，如圖5 所示。工程噬菌體M13-LexA3顯著增強(qiáng)了三類抗生素的殺菌效果，他們分別是喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類抗生素。在體外試驗(yàn)中，工程噬菌體M13-LexA3 和喹諾酮的聯(lián)合使用殺死耐藥菌的效率比單獨(dú)使用喹諾酮時(shí)的殺菌效率，提升了約5000倍。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)使用氧氟沙星治療被大腸桿菌感染的小鼠，小鼠存活率僅為20%，而由工程噬菌體M13-LexA3和氧氟沙星聯(lián)合治療的感染小鼠，存活率達(dá)到了80%。

我國(guó)上海噬菌體與耐藥研究所成立于2017年［48］，2018 年初啟動(dòng)了國(guó)內(nèi)首個(gè)倫理審批的噬菌體治療臨床試驗(yàn)，并于同年8月成功治愈了一例超級(jí)細(xì)菌感染者?；颊呤且晃话螂啄[瘤術(shù)后復(fù)雜性、反復(fù)性尿路感染者，2014 年因全尿路內(nèi)滋生了多重耐藥的肺炎克雷伯菌，在左、右腎盂和膀胱3處中建立了感染。這幾處的感染既有聯(lián)系，又有差異，治療難度相當(dāng)大。治療團(tuán)隊(duì)利用改造后可以識(shí)別并殺死肺炎克雷伯菌的噬菌體，確定了最終的噬菌體-抗生素聯(lián)合治療方案：腎盂造瘺后通過(guò)造瘺管進(jìn)行噬菌體沖洗結(jié)合抗生素靜滴治療1 周，而后停用抗生素并繼續(xù)噬菌體治療1周，之后全面停藥，連續(xù)觀察1個(gè)月。最終，患者泌尿系統(tǒng)的肺炎克雷伯菌被徹底殺滅，尿路刺激癥狀顯著改善，明顯提高了患者的生活質(zhì)量。

4.3 工程細(xì)菌在生物被膜治療中的應(yīng)用

隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，我們能夠構(gòu)建出具有不同功能的工程細(xì)菌，并且將這些“智能”細(xì)菌應(yīng)用到臨床治療中［49］。細(xì)菌感染是臨床上致病性和死亡率的重要因素之一，結(jié)合不同菌株間的競(jìng)爭(zhēng)和同種菌株之間的聯(lián)系等機(jī)制，科學(xué)家們構(gòu)建出了可以自動(dòng)檢測(cè)病原菌、并殺死病原菌的工程菌株。

圖5 利用工程噬菌體M13-LexA3增強(qiáng)抗生素對(duì)大腸肝菌EMG3菌株的殺菌效率示意圖[47]Fig.5 Schematic for enhancing the efficacy of antibiotics treatment of E.coli through engineering with the phage M13-LexA3[47]

Chang等［50］在實(shí)驗(yàn)菌株大腸桿菌Top10中，設(shè)計(jì)并合成了一套包含群體感知、殺菌和裂解裝置的系統(tǒng)，使得大腸桿菌能夠感知并殺死臨床分離的致病菌銅綠假單胞菌菌株Ln7。感知裝置部分基于銅綠假單胞菌I型群體感知機(jī)制設(shè)計(jì)，如圖6所示，啟動(dòng)子tetR持續(xù)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子LasR，LasR 會(huì)與銅綠假單胞菌釋放的群體感知信號(hào)分子?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHLs）3OC12HSL 結(jié)合，導(dǎo)致啟動(dòng)子luxR被LasR-3OC12HSL 復(fù)合物［51］結(jié)合開(kāi)啟，在感知裝置中作誘導(dǎo)啟動(dòng)子；luxR啟動(dòng)子進(jìn)一步激活系統(tǒng)中的殺菌和裂解裝置部分，這兩部分分別產(chǎn)生綠膿菌素S5 和大腸桿菌的裂解蛋白E7；當(dāng)裂解蛋白濃度達(dá)到閾值時(shí)，大腸桿菌細(xì)胞膜破裂，釋放出累積的綠膿菌素S5。綠膿菌素S5 是可溶蛋白，會(huì)分散到目標(biāo)致病菌中，可以破壞目標(biāo)菌株結(jié)構(gòu)的完整性，從而殺死細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，工程大腸菌株可以殺死溶液中90%的活細(xì)菌，并且可以抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成，抑制率接近90%。

在對(duì)抗生物被膜的研究中，本課題組［52］利用光遺傳學(xué)技術(shù)優(yōu)化了的含有藍(lán)光感受器LOV結(jié)構(gòu)域蛋白的光遺傳學(xué)工具質(zhì)粒pDawn［53］，并將之導(dǎo)入生物被膜模式細(xì)菌——銅綠假單胞菌的基因組，使銅綠假單胞菌在光照條件下適量表達(dá)功能性蛋白PA2133。PA2133是在銅綠假單胞菌基因組上的一段基因，它含有EAL結(jié)構(gòu)域，能表達(dá)特定的磷酸二酯酶，從而水解環(huán)二鳥(niǎo)苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）。cdi-GMP［54］是細(xì)菌內(nèi)廣泛存在的一類重要的第二信使分子，調(diào)控細(xì)菌生物被膜的形成。這樣構(gòu)建出來(lái)的工程菌在光照條件下難以形成生物被膜，而在黑暗條件下形成的生物被膜通過(guò)光照，也會(huì)消散85%以上。

隨著對(duì)人體體內(nèi)微生物群的深入研究，益生菌也被選用為工程菌的基礎(chǔ)菌株［55］，為控制感染提供新的思路。Chang 等［56］對(duì)上述殺菌體系進(jìn)行了升級(jí)，選用了益生菌菌株大腸桿菌Nissle 1917作為基礎(chǔ)細(xì)菌進(jìn)行改造，如圖7所示，在原裝置基礎(chǔ)上添加了能夠分解生物被膜胞外聚合物重要組成部分的酶DspB，并將承載合成基因回路的質(zhì)粒，由抗生素識(shí)別標(biāo)記改為了營(yíng)養(yǎng)缺陷型識(shí)別標(biāo)記，解決了水平基因轉(zhuǎn)移帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題。這一工程益生菌在兩種動(dòng)物模型，秀麗隱桿線蟲(chóng)和小鼠模型中，對(duì)銅綠假單胞菌引起宿主的腸道感染都表現(xiàn)出了良好的預(yù)防和治療作用。

4.4 CRISPR技術(shù)在細(xì)菌感染性疾病治療中的應(yīng)用

CRISPR 系統(tǒng)是細(xì)菌在對(duì)抗入侵病毒和外來(lái)質(zhì)粒DNA 中演化出的防御機(jī)制，現(xiàn)在通過(guò)合成生物學(xué)技術(shù)的重新編程，可以用細(xì)菌自己的武器來(lái)對(duì)抗細(xì)菌病原體。研究人員成功地將CRISPR 干擾（CRISPR interference，CRISPRi）技術(shù)用于結(jié)核分枝桿菌感染模型，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄抑制，其作用機(jī)制涉及抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，改變其對(duì)小分子抑制劑的敏感性及破壞正常細(xì)胞形態(tài)。這是治療多重耐藥細(xì)菌的有利工具，盡管結(jié)核病早已可以治愈，但它仍是低收入發(fā)展中國(guó)家十大死因之一，每年造成全球約170萬(wàn)人死亡［57-59］。

圖6 感知并殺滅致病菌系統(tǒng)示意圖[50]Fig.6 Schematic of the pathogen sensing and killing system[50]

圖7 治療銅綠假單胞菌的工程益生菌大腸桿菌Nissle菌株示意圖[56]Fig.7 Schematic of engineering the probiotic Nissle strain from E.coli for preventing and eliminating P.aeruginosa infection[56]

科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)CRISPR 系統(tǒng)參與到病原體細(xì)菌如弗朗西絲氏菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌等的致病過(guò)程中，輔助破壞宿主的免疫系統(tǒng)或涉及細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生等。這些發(fā)現(xiàn)使我們對(duì)CRISPR系統(tǒng)作為細(xì)菌生理調(diào)節(jié)功能有了新的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步研究某些細(xì)菌病原體的CRISPR 系統(tǒng)的作用，可以讓我們更詳細(xì)地了解其毒性及致病機(jī)理，這可能為致病干預(yù)或治療提供新的策略。

5 合成生物學(xué)在病毒感染性疾病治療中的應(yīng)用

合成生物學(xué)在病毒感染性疾病治療中的應(yīng)用，主要集中在對(duì)病毒感染性疾病致病機(jī)理的研究和基于CRISPR技術(shù)的治療方案。

5.1 合成生物學(xué)在病毒感染性疾病致病機(jī)理研究中的應(yīng)用

合成生物學(xué)的出現(xiàn)為研究病毒致病機(jī)理提供了一種新的視角。隨著科學(xué)家們能夠以更快的速度合成和裝配病毒基因組［60］的序列，大大提高了我們對(duì)宿主-病原體相互作用和疾病機(jī)理的認(rèn)知。合成生物學(xué)的原理之一“合成分析”［61］，即通過(guò)將單個(gè)遺傳組分的快速合成、裝配、重組和突變與直接的功能分析結(jié)合起來(lái)，為病毒病理學(xué)致病機(jī)制的理解提供了一種新的思路。在研究病毒感染性疾病時(shí)，通過(guò)重構(gòu)致病病毒基因組，來(lái)研究其致病機(jī)理。例如，利用從冷凍保存的組織樣品中提取的基因片段的序列信息合成H1N1病毒的基因組，H1N1病毒曾造成全球5000萬(wàn)以上的人員死亡?？茖W(xué)家們通過(guò)重構(gòu)病毒對(duì)基因進(jìn)行功能性分析，挖掘出了兩種H1N1 病毒致病性的主要毒力因子：一種可以在不激活胰蛋白酶情況下誘導(dǎo)膜融合的血凝素變體，另一種可以增強(qiáng)病毒復(fù)制能力的改良聚合酶［60］。研究還揭示了1918年大流感病毒的超強(qiáng)毒性與8種基因的聯(lián)合作用有關(guān)［60-62］。這些研究可以幫助人們確定未來(lái)病毒變種的毒力分析和潛在威脅［63-64］。

針對(duì)嵌合病毒的合成和分析對(duì)我們認(rèn)識(shí)造成2002—2003 年嚴(yán)重急性呼吸綜合癥（severe acute respiratory syndrome，SARS）的冠狀病毒［65］作出了重大貢獻(xiàn)。因?yàn)镾ARS冠狀病毒的直系祖先不能在實(shí)驗(yàn)室模式動(dòng)物中傳播，所以對(duì)SARS冠狀病毒發(fā)展進(jìn)程的表征，尤其是對(duì)其宿主趨向性改變的表征，變得極具挑戰(zhàn)性。為此，科學(xué)家們?cè)O(shè)計(jì)并合成了一個(gè)30 kb 包含了與人類同源的受體結(jié)合刺突蛋白的類SARS 蝙蝠冠狀病毒［66］，這一合成的嵌合病毒能夠在培養(yǎng)基中復(fù)制并感染小鼠。刺突蛋白是SARS冠狀病毒表面最重要的膜蛋白，承擔(dān)了病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合并擔(dān)負(fù)膜融合功能，是各種冠狀病毒誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的主要抗原。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了刺突蛋白是造成人畜共患冠狀病毒宿主趨向性改變的主要因子之一，并且揭露了具有更強(qiáng)感染力的刺突蛋白突變體病毒株。

另外，DNA 合成重建病原體還可用于生產(chǎn)診斷性高密度抗原組［67-68］，如用于分析后萊姆病綜合征或?qū)Ρ透窝撞《荆╤epatitis C virus，HCV）和艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）［69］有體液免疫反應(yīng)的抗原組。

5.2 CRISPR技術(shù)在病毒感染性疾病治療中的應(yīng)用

病毒由一個(gè)核酸分子與蛋白質(zhì)構(gòu)成，利用宿主的細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行自我復(fù)制，無(wú)法獨(dú)立生長(zhǎng)和復(fù)制。一些致病性病毒，如HIV、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）可以在人體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存在，并且依然保持感染性且不受宿主免疫系統(tǒng)的影響，造成病毒持續(xù)感染（viral persistence）。近年來(lái)，CRISPR 技術(shù)在體外或動(dòng)物模型中被用于減少或消除持續(xù)性病毒感染，為潛伏性和慢性病毒感染的治療帶來(lái)了新的希望。

HIV是造成人類免疫系統(tǒng)缺陷的一種病毒，通過(guò)直接侵犯人體的免疫系統(tǒng)，破壞細(xì)胞免疫和體液免疫，不僅使人體難以抵御病原體侵害，而且給特效治療藥物和疫苗的研制帶來(lái)了困難。目前，感染了HIV 的病人主要依靠各種抗病毒藥物進(jìn)行治療。但是，這種療法并不能完全治愈病人，需要終身服藥。HIV-1 是艾滋病病毒最常見(jiàn)和最致病的毒株。消滅HIV-1需要清除受感染細(xì)胞和組織中發(fā)生整合反應(yīng)的前病毒DNA。研究人員開(kāi)發(fā)了一種聯(lián)合療法，靶向一群受感染小鼠體內(nèi)的HIV［70］。該療法使用一種持續(xù)的藥物遞送系統(tǒng)和基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術(shù)，前者會(huì)持續(xù)多天緩慢釋放藥物并抑制病毒活性，后者則會(huì)通過(guò)切斷相關(guān)的DNA 片段，消除被感染細(xì)胞中的病毒遺傳密碼。經(jīng)過(guò)連續(xù)的治療，研究團(tuán)隊(duì)使用解巢式PCR（nested PCR）、微滴式數(shù)字PCR（digitaldroplet PCR）及RNAscope 技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在接受治療后的5 周內(nèi)，已經(jīng)無(wú)法在小鼠的血液、淋巴組織、骨髓及大腦中檢測(cè)到HIV。這一試驗(yàn)結(jié)果有很大的發(fā)展前景，研究人員計(jì)劃將在此基礎(chǔ)上開(kāi)展進(jìn)一步的研究，改進(jìn)針對(duì)病毒的藥物遞送，特異性地消除潛伏的病毒感染。

通常情況下，HIV 病毒主要通過(guò)CCR5基因編碼白細(xì)胞上的一種受體進(jìn)入細(xì)胞。如果個(gè)體攜帶兩個(gè)CCR5突變拷貝，那么HIV 病毒株無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞。但這種抗HIV 基因特別罕見(jiàn)：僅1%的歐洲血統(tǒng)人口攜帶。我國(guó)北京大學(xué)鄧宏魁教授、307 醫(yī)院陳虎教授以及北京佑安醫(yī)院吳昊教授研究組［71］合作，報(bào)道了首例利用CRISPR-Cas9 在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）中編輯CCR5基因并成功移植到罹患HIV和急性淋巴細(xì)胞白血病的患者案例，移植治療使病人的急性淋巴白血病得到完全緩解，攜帶CCR5突變的供體細(xì)胞能夠在受體體內(nèi)長(zhǎng)期存活達(dá)19 個(gè)月，且未引起明顯的副作用，但細(xì)胞數(shù)量較少，對(duì)抵制HIV 感染效果欠佳，需進(jìn)一步研究。這項(xiàng)臨床研究初步探索了CRISPR的可行性和安全性。

截至2019 年，病毒性肝炎仍是全球主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，其中乙肝和丙肝影響到全球3.25億人，每年導(dǎo)致約140萬(wàn)人死亡。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)乙肝病毒感染者約8600 萬(wàn)人，丙肝感染者約1000 萬(wàn)人，每年約33 萬(wàn)人死于乙肝或丙肝感染導(dǎo)致的肝硬化和原發(fā)性肝癌。盡管針對(duì)HBV 研制的有效預(yù)防性疫苗已經(jīng)投入使用幾十年，但HBV 仍然是當(dāng)今全球十大死因之一，這是由于目前的治療藥物無(wú)法清除或使HBV 在肝細(xì)胞核內(nèi)穩(wěn)定存在的閉合共價(jià)環(huán)狀DNA（cccDNA）完全失活，在停止治療或出現(xiàn)耐藥性突變毒株后，HBV 可以繼續(xù)以cccDNA 為模板，產(chǎn)生子代病毒，重新活化。由此，研究人員利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，對(duì)受到感染的哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯。Chen 等［72］設(shè)計(jì)了8 種針對(duì)HBV 基因型A 的gRNA，在轉(zhuǎn)染HBV 質(zhì)粒的Huh7 細(xì)胞模型種鑒定出了2 個(gè)有效的gRNA，并在水流動(dòng)力學(xué)注射HBV 質(zhì)粒的小鼠模型種進(jìn)一步證明了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以切割肝內(nèi)含有HBV 基因組的質(zhì)粒，降低小鼠血清中HBV表面抗原水平。另一方面，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也被用于對(duì)HCV的抑制中。Weiss和Grakoui等［73］通過(guò)重新編輯弗朗西絲菌Cas9 蛋白，可以靶向HCV 病毒，抑制HCV在人類細(xì)胞中的復(fù)制。

6 合成生物學(xué)在感染性疾病預(yù)防中的應(yīng)用

合成生物學(xué)不僅參與感染性疾病的治療、感染性疾病致病機(jī)理和傳播機(jī)制的研究，同時(shí)在預(yù)防感染性疾病方面也取得了一些進(jìn)展［64，74-76］。

6.1 工程細(xì)菌在感染性疾病預(yù)防中的應(yīng)用

細(xì)菌之間可以通過(guò)化學(xué)物質(zhì)聯(lián)系，像我們熟知的群體感知［77］。單細(xì)菌產(chǎn)生和分泌信號(hào)分子，這些信號(hào)分子是多種細(xì)菌共有的，或者是種特異性的。這些分子隨著細(xì)菌種群的增長(zhǎng)而積累，并能與受體結(jié)合，從而協(xié)調(diào)整個(gè)菌落范圍內(nèi)的基因表達(dá)或操縱其他細(xì)菌種群的行為。由此，我們除了利用工程菌結(jié)合細(xì)菌間的競(jìng)爭(zhēng)生存機(jī)制治療感染性疾病，也可以利用其來(lái)預(yù)防感染性疾病。霍亂弧菌產(chǎn)生的霍亂自動(dòng)誘導(dǎo)因子1（CAI-1）和自動(dòng)誘導(dǎo)因子2（AI-2），是關(guān)鍵毒力因子的抑制開(kāi)關(guān)。March 等［78］構(gòu)建了一種工程益生大腸桿菌，這些菌株本身可以生產(chǎn)AI-2，在改造后可以持續(xù)合成CAI-1；給被霍亂弧菌感染的小鼠喂食這種工程益生菌可以顯著提升小鼠的存活率。這種方法可能成為預(yù)防感染性疾病的一種經(jīng)濟(jì)型的策略。與抗生素不同，基于群體感知的干預(yù)并不殺死病原體，而是重塑它們的行為，這種策略因?yàn)闆](méi)有選擇壓力的存在，不易使病原體產(chǎn)生抗性。

6.2 合成生物學(xué)在疫苗研發(fā)中的應(yīng)用

免疫接種對(duì)于控制感染性疾病，保護(hù)人類和動(dòng)物健康是一個(gè)非常有效的手段。合成生物學(xué)的出現(xiàn)對(duì)疫苗的研發(fā)有了新的突破，出現(xiàn)了多種不同的研究策略，為更加理性的設(shè)計(jì)更多安全性高且易于接種的疫苗提供了新的思路。

6.2.1 人工病毒在減毒疫苗構(gòu)建中的應(yīng)用

利用合成生物學(xué)原理，從遺傳組分中進(jìn)行全基因組的高通量、高精度組裝和合成，為設(shè)計(jì)用作疫苗的減毒病原體提供了新的方法。例如，對(duì)高劑量選擇性表達(dá)特定基孔肯雅病毒（CHIKV）結(jié)構(gòu)蛋白而產(chǎn)生的類病毒顆粒產(chǎn)生免疫的靈長(zhǎng)類動(dòng)物，可以抵抗病毒血癥；即使是用猴源抗體治療的免疫缺陷小鼠也能在隨后的致死劑量的CHIKV感染中存活下來(lái)［79］。

此外，DNA 合成和組裝也在開(kāi)發(fā)針對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒［80］的安全活疫苗方面發(fā)揮了重要作用。脊髓灰質(zhì)炎病毒可以通過(guò)病毒衣殼基因中相鄰密碼子對(duì)從高到低表達(dá)的系統(tǒng)基因逐級(jí)變化而減弱，例如，與GCA|GAG 相比，GCC|GAA 的表達(dá)量明顯不足，盡管兩者都編碼Ala-Glu。這些變化降低了病毒的轉(zhuǎn)譯量，削弱了病毒的復(fù)制能力和傳染性。這種毒性減弱的脊髓灰質(zhì)炎病毒給小鼠提供了保護(hù)性免疫，并且具有一個(gè)較高的安全標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樗?31個(gè)基因組個(gè)體變化發(fā)生逆轉(zhuǎn)并重構(gòu)成感染性野生型病毒的可能性很低。這種基因組工程方法可以代表針對(duì)感染性疾病設(shè)計(jì)活疫苗的一般策略。其他有潛力的疫苗接種例子如使用抗原產(chǎn)生免疫刺激脂質(zhì)體［81］作為基因可編程的合成疫苗和生產(chǎn)熱穩(wěn)定的口服型的基于藻類的疫苗，用于抵抗金黃色葡萄球菌感染［82］。

北京大學(xué)周德敏教授課題組［83］通過(guò)合成生物學(xué)方法構(gòu)建減毒活疫苗，開(kāi)發(fā)了被稱為“合成減毒病毒工程技術(shù)”的新策略。他們利用終止密碼子可以識(shí)別非天然氨基酸的原理，將病毒復(fù)制基因的部分編碼密碼子突變成終止密碼子，使其在感染人體細(xì)胞后，不能進(jìn)行完整的蛋白質(zhì)翻譯，從而獲得了甲型流感病毒的活病毒疫苗。所獲得的病毒疫苗具有安全性和有效性。進(jìn)一步突變3個(gè)以上三聯(lián)密碼子，使病毒由預(yù)防性疫苗變?yōu)橹委煵《靖腥镜乃幬?，且其藥效隨著三聯(lián)密碼子數(shù)目的增加而增強(qiáng)。與依賴于少數(shù)的幾個(gè)氨基酸突變所獲得的傳統(tǒng)減毒活病毒相比較，合成減毒病毒的減毒效果來(lái)源于多達(dá)幾百處的密碼子變化所產(chǎn)生的累積效應(yīng)，回復(fù)突變的風(fēng)險(xiǎn)極低，大大提高了疫苗的安全性。

我國(guó)中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所鄭振華研究員團(tuán)隊(duì)［84］成功利用合成減毒病毒工程技術(shù)研制出了新型的ZIKV 減毒疫苗，小鼠在單次免疫刺激后就可以產(chǎn)生高滴度中和抗體，獲得完全的攻毒保護(hù)，并且可以阻止ZIKV 通過(guò)母體垂直傳播給子代。弱毒疫苗的基因組中引入了2568個(gè)同義突變，因此幾乎不可能回復(fù)突變到野生型病毒。

6.2.2 人工細(xì)菌在減毒疫苗構(gòu)建中的應(yīng)用

人工減毒細(xì)菌不僅可以作為疫苗，還被證實(shí)是理想的疫苗載體。以口服方式進(jìn)行免疫接種，細(xì)菌在體內(nèi)可以有限增殖，一次免疫即可提供保護(hù)。細(xì)菌載體在增殖過(guò)程中能夠表達(dá)多種免疫原性物質(zhì)，誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答，大約90%的人類和動(dòng)物傳染病病原體感染是起始于黏膜表面的。此外，人工減毒細(xì)菌還能表達(dá)單一的或多重抗原，從而對(duì)一種或幾種病原體的感染提供保護(hù)。現(xiàn)已知沙門氏菌［85］、李斯特菌［86］等細(xì)菌常選被作為疫苗或疫苗載體的基礎(chǔ)菌種。

減毒的沙門氏菌活株具有作為疫苗載體的巨大潛力，沙門氏菌基于Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）的跨膜通道可以用來(lái)釋放跟其Ⅲ型毒性因子融合的外源蛋白。Hensel 等［87］研究了沙門氏菌致病性毒力島編碼的T3SS 的各種效應(yīng)蛋白對(duì)模型抗原的傳遞和免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)作用。這些效應(yīng)蛋白SifA、SteC、SseL、SseJ 和SseF 跨膜后有同一個(gè)內(nèi)體膜相關(guān)的亞細(xì)胞定位信息，所有效應(yīng)蛋白都可以與模型抗原卵清蛋白和李斯特菌溶蛋白一起轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的胞漿中。在體外試驗(yàn)中，SseJ 和SteC融合蛋白對(duì)T 細(xì)胞的刺激反應(yīng)表現(xiàn)優(yōu)于SseF 融合蛋白；而在接種了沙門氏菌載體菌株的小鼠中，只有基于SseJ或SifA的融合蛋白才能引發(fā)有效的T細(xì)胞反應(yīng)。由此，T3SS 介導(dǎo)的抗原傳遞，選擇最優(yōu)的效應(yīng)蛋白應(yīng)是合理設(shè)計(jì)有效的沙門氏菌疫苗的關(guān)鍵。

6.2.3 酵母改造在新型疫苗構(gòu)建中的應(yīng)用

酵母如釀酒酵母、畢赤酵母等，因其具有完整的基因組序列信息、穩(wěn)定的遺傳性、易于培養(yǎng)和非致病性，已經(jīng)成為人類公共衛(wèi)生或農(nóng)場(chǎng)畜牧業(yè)疫苗開(kāi)發(fā)的理想模型系統(tǒng)。釀酒酵母和畢赤酵母經(jīng)常用于表達(dá)具有治療感染性疾病作用的外源蛋白。如重組酵母乙肝疫苗［88］是一種乙肝表面抗原亞單位疫苗，它是采用轉(zhuǎn)基因的方法將乙肝病毒表達(dá)表面抗原的基因進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建，轉(zhuǎn)入進(jìn)入釀酒酵母中，通過(guò)培養(yǎng)這種重組酵母菌來(lái)表達(dá)乙肝表面抗原亞單位，具有原料易得、產(chǎn)量大、安全、高效等特點(diǎn)。重組芽殖酵母［89］可以在小鼠腸道中分泌蛋白質(zhì)或肽，為開(kāi)發(fā)口服疫苗開(kāi)辟了道路。針對(duì)病毒感染性疾病，基于酵母制備的疫苗研究還涉及針對(duì)HPV［90］、HCV［91］、腸道病毒［92］、DENV［93］、甲型流感病毒H1N1［94］等病毒病原體。針對(duì)細(xì)菌感染性疾病，基于酵母制備的疫苗研究涉及炭疽桿菌［95］、結(jié)核分岐桿菌［96］、李斯特菌［97］等細(xì)菌病原體。

6.3 合成生物學(xué)通過(guò)改造感染源限制疾病的傳播

感染性疾病具有感染源，他們是病原體自然生存、繁殖并排出的宿主或場(chǎng)所。感染源的種類包括患者、病原體攜帶者、動(dòng)物及某些場(chǎng)所的物品。昆蟲(chóng)是動(dòng)物傳染源中常見(jiàn)的感染源之一，科學(xué)家們利用帶有條件顯性致死合成回路的轉(zhuǎn)基因病毒株抑制昆蟲(chóng)病媒種群，可能控制瘧疾寄生蟲(chóng)和登革病毒的傳播，并可能最終控制無(wú)法治療的疾病的傳播。Fu 等［98-100］改造了這種轉(zhuǎn)基因的蚊子，蚊子體內(nèi)含依賴四環(huán)素的反激活因子（tTA），這種基因只在雌蚊子的間接飛行肌中表達(dá)，并且只有在抑制這種基因轉(zhuǎn)錄，即四環(huán)素存在的情況下才能繁殖。而四環(huán)素的缺失造成一種特異性的雌性不能飛行表型的形成。將這種轉(zhuǎn)基因蚊子的卵投放到生態(tài)系統(tǒng)中，只有雄性蚊子會(huì)釋放到環(huán)境中；雌性蚊子仍然滯留在地面，不能進(jìn)食、交配或吸血，這實(shí)際上是一種致命的表型。雄性蚊子不會(huì)傳播這種疾病，但它們會(huì)將這種合成回路傳播到原住民，即野生型蚊子種群中。

利用第一代tTA 轉(zhuǎn)基因蚊子進(jìn)行釋放攜帶顯性致死基因昆蟲(chóng)技術(shù)的野外測(cè)試早已在大開(kāi)曼島開(kāi)展起來(lái)。首先，小規(guī)模投放一群轉(zhuǎn)基因雄蚊證實(shí)其可以存活，與野生雌蚊交配并且產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因幼蟲(chóng)，接著大范圍的試驗(yàn)結(jié)果顯示，投放轉(zhuǎn)基因雄蚊約11周后，野生蚊子的數(shù)量減少了80%。然而由于研究地點(diǎn)不是隔離的，且周圍地區(qū)有高密度的野生型蚊子，因此實(shí)際的抑制效率仍然極具挑戰(zhàn)性［75，101］。

類似的研究比如利用一個(gè)合成的基于歸巢核酸內(nèi)切酶的基因驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)傳播改造的基因，將瘧疾抗性基因從工程改造的蚊子傳遞給野外蚊子種群［102］。歸巢內(nèi)切酶通常在宿主基因組中產(chǎn)生一個(gè)單序列特異性雙鏈斷裂，然后以歸巢內(nèi)切酶基因（HEG）為模板進(jìn)行同源重組修復(fù)。如此，自私的基因HEG在被稱為“歸巢”的基因轉(zhuǎn)換過(guò)程中被復(fù)制到斷裂的染色體上。在雄性種系啟動(dòng)子的控制下表達(dá)HEG I-SceI，可以使純合子雄蚊高效歸巢并快速產(chǎn)生遺傳驅(qū)動(dòng)，從而導(dǎo)致了被捕獲的蚊種群的HEG 入侵。通過(guò)工程化其他HEG 的序列特異性，例如，I-AniI或I-CreI，利用基因驅(qū)動(dòng)的概念，原則上可以用于敲入或敲除針對(duì)蚊子作為感染性疾病傳染源能力的基因功能。

我國(guó)中國(guó)科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所聯(lián)合約翰霍普金斯大學(xué)彭博公共衛(wèi)生學(xué)院［103］，發(fā)現(xiàn)了一種能在按蚊中進(jìn)行持續(xù)跨代傳播的沙雷氏菌屬（Serratia）新菌株AS1，并成功地人工構(gòu)建出能同時(shí)分泌表達(dá)5個(gè)抗瘧疾基因的菌株，能夠有效減少92%～93%的瘧疾原蟲(chóng)卵囊。通過(guò)高效驅(qū)動(dòng)抗瘧疾效應(yīng)分子快速散播到整個(gè)蚊群中，能夠使按蚊成為無(wú)效的瘧疾媒介，實(shí)現(xiàn)從源頭上阻斷瘧疾傳播。

7 總結(jié)與展望

在人類與感染性疾病抗?fàn)幍穆L(zhǎng)歲月里，隨著抗病原體藥物的廣泛大量使用，病原體耐藥性的出現(xiàn)和耐藥率的不斷增高正成為全球人類熱點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。病原體的耐藥性不僅降低抗病原體藥物的有效率，也嚴(yán)重威脅人類健康。合成生物學(xué)的出現(xiàn)為研究感染性疾病的機(jī)理、治療及預(yù)防提供了新的思路，并已取得了階段性的成果。

合成生物學(xué)不僅在感染性疾病治療方面頗有應(yīng)用，在治療癌癥、代謝系統(tǒng)疾病、再生醫(yī)學(xué)等方面也有相當(dāng)?shù)膽?yīng)用。然而，要將以合成生物學(xué)為基礎(chǔ)的生物醫(yī)學(xué)療法，真正應(yīng)用到臨床治療中，我們?nèi)匀贿€有很長(zhǎng)的路要走。合成生物學(xué)療法臨床化最重要的挑戰(zhàn)之一是如果將合成的治療回路、裝置或有機(jī)體植入患者的特定細(xì)胞，并確保不會(huì)干擾人體的新陳代謝。同時(shí)，以合成生物學(xué)為基礎(chǔ)的治療方案的臨床應(yīng)用，與所有以基因和細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療，都將面臨相同的科學(xué)、倫理和法律問(wèn)題，但由于合成生物學(xué)療法提供更復(fù)雜的控制動(dòng)力學(xué)，有望產(chǎn)生更高的治療效果。雖然目前合成生物學(xué)療法還處在試驗(yàn)階段，還沒(méi)有由合成生物學(xué)家開(kāi)創(chuàng)的合成生物設(shè)備、人工基因網(wǎng)絡(luò)或相關(guān)的產(chǎn)品用于臨床治療，但是合成生物學(xué)憑借自身優(yōu)勢(shì)，必將在21世紀(jì)生物醫(yī)學(xué)發(fā)展中扮演重要角色。