植物合成生物學研究進展

張博，馬永碩，尚軼，黃三文

（1 云南師范大學馬鈴薯科學研究院，云南省馬鈴薯生物學重點實驗室，云南 昆明650500； 2 中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)基因組研究所，農(nóng)業(yè)部基因組分析重點實驗室，廣東省嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)實驗室，廣東 深圳518120； 3 麻省理工學院化學工程系，馬薩諸塞州劍橋市，02139）

迄今，生命科學歷經(jīng)了三次革命，第一次是“DNA 雙螺旋結構的解析”，將科學研究由傳統(tǒng)的生理研究轉向分子生物學和遺傳學等層面［1］；第二次是隨著人類基因組測序成功和多組學的蓬勃發(fā)展，催生或衍生出了系統(tǒng)生物學［1］；第三次是生命科學、計算機科學、化學、物理學和工程學等學科的整合發(fā)展形成了合成生物學這一嶄新領域并迅速開展“會聚”研究的生命科學革命［2］。

合成生物學主要是“以分子生物學和分子遺傳學等傳統(tǒng)生物學為基礎，結合多種組學和系統(tǒng)生物學的手段，采用基因合成、編輯、網(wǎng)絡調控等新技術并利用工程學和計算機指導設計新的生命體或者改造現(xiàn)有生命體的一門綜合學科”［3］。這門學科的興起使得生物學從傳統(tǒng)的認識生命和研究生命上升到改造生命的高度，對探索生命本質具有重要的科學意義。在計算機的設計指導下，從頭合成或者改造已有的細胞組件，對其進行組裝和組合，進而生成特定功能或價值的生命體的這項嶄新研究，必將推動生命科學和生物技術的顛覆性發(fā)展，為經(jīng)濟和社會的發(fā)展帶來深刻的變革。

1 合成生物學

合成生物學的定義是“在人工設計的指導下，采用正向工程學‘自下而上’的原理，利用‘自上而下’的系統(tǒng)生物學，并整合分子生物學、信息技術和工程學等融合分析，對現(xiàn)有的、天然存在的生物系統(tǒng)有目的地進行重新設計和改造，或者通過人工的方法，創(chuàng)造出自然界不存在的活性生物分子、系統(tǒng)、細胞，甚至是‘人造生命’”［3-6］。它從微生物系統(tǒng)開始，現(xiàn)如今已發(fā)展到了包括植物系統(tǒng)的真核生物中［7-10］。合成生物學家利用無生命的基礎原件從頭合成脊髓灰質炎病毒基因組的cDNA［11］，使用全化學方法合成組裝了ΦX174 噬菌體［12］和蕈狀支原體［13］等簡單原核生物的基因組。隨著人類基因組計劃的研究深入，科學家還提出了合成酵母全染色體的Sc2.0 合成計劃［14］和人類基因組合成計劃［15］，這些計劃將合成生物學的對象從病毒和原核生物轉向真核生物，如酵母和動植物等。微生物的合成生物學的應用前景廣闊，主要體現(xiàn)在滿足環(huán)境改善［16-18］和工業(yè)化生產(chǎn)［19-22］等需要，然而，使用微生物底盤進行生產(chǎn)過程需要消耗大量糖類（如葡萄糖）［23］。此外，微生物往往難以異源合成植物來源的參與代謝及調控途徑的酶（如細胞色素P-450 酶）。而植物可以利用大氣中的CO2作為碳源，進行所需化合物的合成，且與宿主植物具有結構與功能類似的細胞器、輔酶和輔酶因子，因此無需優(yōu)化即可從宿主植物轉移相應的代謝通路用來生產(chǎn)和應用［24］。這些優(yōu)點為植物合成代謝工程提供了可持續(xù)發(fā)展的可能性。合成生物學的終極目標是可以像工程師一樣理解、設計、構建和創(chuàng)造生物［25］，雖然現(xiàn)階段在植物細胞體系中要實現(xiàn)這一目標還很遙遠，但研究人員還是取得了很多新的進展（圖1）。

2 植物合成生物學的內涵

圖1 植物合成生物學技術路線和應用進展Fig.1 Roadmap for plant synthetic biology and its applications

植物合成生物學是在植物基因工程和轉基因技術的基礎上發(fā)展起來的，三者間有部分研究內容是重疊的［26-27］。除了依賴基因工程原有的基因重組技術和植物組織培養(yǎng)技術操縱啟動子重組與外源基因表達之外，植物合成生物學更強調借助計算機、數(shù)學、化學、物理學等多種交叉學科和工程化的思維，從系統(tǒng)層面實現(xiàn)對植物體系的從頭設計與改造［28-29］。此外，傳統(tǒng)的基因工程和轉基因技術往往只能轉化少量的外源基因，而植物合成生物學則傾向于利用核基因組和質體遺傳，轉化多基因疊加系統(tǒng)甚至是整個遺傳通路［30］。新的染色體工程技術人工合成微小染色體（minichromosome）技術也可以確保多個基因的聯(lián)合遺傳［31］。這些新興技術的廣泛應用為植物合成生物學發(fā)展奠定了實踐基礎。

合成生物學的三大基石是合成元件、遺傳線路和合成模塊［29］。在植物中，生物合成元件主要分為三類：①催化元件（如氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂解酶、異構酶和連接酶等）；②轉運元件（從胞外向胞內內轉運和運輸?shù)南嚓P蛋白，如膜電化學梯度的轉運蛋白、離子通道蛋白等）；③調控元件，（如啟動子、核糖體結合位點、終止子、轉座子、核酸開關、核酸調節(jié)子和CRISPR/Cas9 系統(tǒng)等）［29，32-34］。合成元件可以組裝成復雜程度不同的合成基因線路，如可以通過模擬各種邏輯推理關系和數(shù)字元件的邏輯基因線路，以及構成具有特定生物功能的遺傳基因線路［28-29，34］，這些線路又能以新的形式組合成模塊，主要包括：①合成乙酰輔酶A、丙二酸單酰CoA、莽草酸和氨基酸等初級代謝產(chǎn)物的初級合成模塊；②合成苯烷類、萜類、糖、脂肪酸、含氮和硫等次生代謝產(chǎn)物的基本骨架合成模塊；③對多種代謝產(chǎn)物進行修飾（如甲基化、?；⑻腔土姿峄龋┑男揎椖K［28-29，35］。最后這些元件、線路和模塊都將運輸?shù)街参锏妆P的細胞中進行不同的亞區(qū)室化表達［36］（圖2），最終實現(xiàn)對現(xiàn)有植物體系的改造和優(yōu)化。

3 植物合成生物學技術進展

植物工程學中的“標準化、去耦合化和精簡化”等思想［37］會被運用到元件、遺傳線路和模塊系統(tǒng)的創(chuàng)建過程中。因此，對DNA的合成和組裝、基因編輯技術、核和質體遺傳轉化體系以及染色體工程等技術層面的探索顯得尤為重要。

圖2 植物合成生物學三大基石Fig.2 Three cornerstones for plant synthetic biology

3.1 DNA合成和組裝

DNA是“生物體儲存和傳遞遺傳信息的載體”［38］，如果需要對生物體進行特定的設計、改造和合成，則需要了解DNA的合成和組裝。因此DNA合成和組裝也是合成生物學中的關鍵技術。傳統(tǒng)的PCR技術可以對已知DNA 序列進行合成，但如果要合成自然界中并不存在的DNA，則需要使用DNA 從頭合成技術，即寡核苷酸合成。目前常用的基于柱基和微陣列的寡核苷酸合成技術是固相亞磷酰胺三酯法［39］。但隨著寡核苷酸合成鏈的延長，合成產(chǎn)量會逐漸降低，效率下降。目前亞磷酰胺基寡核苷酸合成的上限約為200nt，并且會產(chǎn)生危險的副產(chǎn)物［40］。因此有科學家提出了末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）的寡核苷酸合成策略［41］。該技術可反復延長寡核苷酸鏈，編寫出新的DNA，這就為制造酶促寡核苷酸合成儀［42］奠定了基礎。

合成的DNA 片段需要進一步進行組裝。常見的體外組裝方法主要分為三類：重疊定向組裝（如In-Fusion［43］、Gibson 組裝［13］）、利用噬菌體整合的位點特異性重組（如Gateway 克?。?4］）和基于限制性核酸內切酶的策略。基于Ⅱs 型限制性核酸內切酶的方法是最常用的DNA 標準化組裝方法，如BioBrick［45］、Golden Gate［46］、MoClo［47］、GoldenBraid［48］、 Golden Mutagenesis［49］和基于Golden Gate 形成的multi-kingdom 模塊化克隆系統(tǒng)［50］。體內組裝方法分為兩類：由λ-Red重組酶系統(tǒng)介導的同源重組方法［51］和Cre/loxP（如TGS Ⅱ系統(tǒng)）［52］、Flp/Frt［53］介導的位點特異性重組方法。其中TGS Ⅱ系統(tǒng)是基于Cre/loxP 重組酶介導的組裝方法，因其操作簡單、多基因組裝效率高，已經(jīng)被廣泛用于植物中。該方法已經(jīng)成功用于水稻胚乳中花青素、β-類胡蘿卜素和蝦青素的合成［54］。彭新湘等使用該系統(tǒng)疊加光呼吸的多個基因，開發(fā)出了一種提高光合效率和產(chǎn)量的新型水稻種質［55］。陳其軍等還建立了MISSA［56］、MISSA 2.0［57］和MISSA 3.0 體內多輪位點特異性組裝系統(tǒng)，促進了植物的多基因轉化。

3.2 基因編輯技術

基因編輯是基因功能分析和作物改良的重要工具。與鋅指核酸酶（ZFN）系統(tǒng)和轉錄激活因子樣核酸酶（TALEN）系統(tǒng)相比，成簇規(guī)則間隔的短回文重復（CRISPR）/CRISPR 相關蛋白（Cas）系統(tǒng)更加簡單、快捷和高效。目前，植物基因組編輯中最常用的是CRISPR/ Cas9 系統(tǒng)，其次是CRISPR/ Cas12a （Cpf1） 系統(tǒng)。 大部分的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是以單個基因為靶點，設計出一條gRNA 來完成敲除工作（如敲除OsNramp5 基因可以降低水稻鎘的積累［58］，敲除BADH2 可以提高稻米的香味［59］）。而植物的生物合成和調控通路往往是由多個基因共同參與，如果想要了解和改造這些通路就需要進行多基因編輯。多基因編輯的主要方法是針對不同基因的靶點設計gRNA，采用Golden Gate 或Gibson 組裝方法將多個gRNA序列裝配到CRISPR/Cas9 雙元表達載體中。例如基于pCAMBIA1300 骨架的pYLCRISPR/ Cas9 雙元載體系統(tǒng)，能夠高效編輯單子葉和雙子葉植物中的多個基因［60］；基于pGreen 或pCAMBIA 的載體系統(tǒng)針對多個基因進行定向突變，并在玉米和擬南芥中分別驗證了其功能性［61］。多基因編輯技術還可以實現(xiàn)片段的刪除［62］，將tRNA 與gRNA 結合形成多順反子基因，并使用內源tRNA 系統(tǒng)加工該合成基因，生成大量的gRNA，引導CRISPR/Cas9 載體進行多重基因組編輯和染色體片段缺失［63］。

通過非同源末端連接（NHEJ）修復方式可以將含有定點替換的DNA 片段與基因組中兩個靶點之間的DNA 片段互換，進而實現(xiàn)基因的定點替換和定點插入，這一方法得到的突變體在水稻中可以穩(wěn)定遺傳到下一代［64］。除了定點替換和插入之外，現(xiàn)有的技術還可以在DNA 雙鏈不斷裂的情況下利用胞嘧啶脫氨酶或腺嘌呤脫氨酶對目標基因的特定位點進行精準的單堿基編輯。例如胞嘧啶單堿基編輯器［65］能將C/G 堿基對轉化成T/A 堿基對；腺嘌呤單堿基編輯器ABE7-10可以將A/T堿基對轉化成G/C 堿基對［66］。單堿基編輯系統(tǒng)A3APBE 已經(jīng)成功在小麥、水稻及馬鈴薯中實現(xiàn)高效的C/T 單堿基編輯［67］。通過合用兩類單堿基編輯器并針對靶基因的gRNA庫，科學家提出了單堿基編輯技術介導的水稻內源靶標基因的定向進化技術（BEMGE）［68］和飽和靶向內源基因突變堿基編輯器STEME［69］。STEME 雙堿基編輯器［69］能夠在只有一個gRNA 引導下誘導靶位點C＞T 和A＞G 的同時突變。使用這些技術能在植物中實現(xiàn)基因的定向進化，也為短時間創(chuàng)制大量突變類型的育種篩選材料提供可能。

敲除植物體某些基因可能會導致植物不育甚至死亡，需要對其基因表達量進行調控。利用基因編輯技術對基因啟動子的上游開放閱讀框（uORF）［70］或順式調控元件［71］進行編輯或刪除，進而間接改變基因的表達水平。例如：對生菜的維生素C 的GDP-L-半乳糖磷酸化酶（GGP）上游啟動子的uORF 區(qū)域進行編輯，導致生菜中維生素C含量顯著提高［72］。

3.3 核基因組遺傳轉化

植物的遺傳轉化是一項重大科學突破，從根本上改變了農(nóng)業(yè)和植物生物學。目前常用的遺傳轉化手段主要有農(nóng)桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道遺傳轉化法、顯微注射法和最新的納米顆粒轉化法。其中農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法已成為雙子葉植物和單子葉植物（如水稻）中最常用的基因傳遞技術。而納米材料構建的基因載體具有穿透性強、裝載量大、有對外源基因的保護作用以及較短的遺傳轉化周期等特點［73］。部分納米材料如碳納米管［74］、二氧化硅（SiO2）納米粒子［75］等可以裝載外源基因，結合基因槍技術可穿過植物細胞壁，獲得轉基因植株。而磁性納米顆粒（如Fe3O4磁性納米顆粒）載體則可以與花粉管通道法結合，成為花粉磁轉染法［76］。在適合的磁場條件下，磁性納米顆粒載體傳遞到花粉中，利用磁轉染花粉授粉，再在子房受精產(chǎn)生轉基因種子，這種方法可以有效地轉化某些難以使用常規(guī)方法進行遺傳轉化的植物。

由于上述方法都需要將CRISPR 重組體或人工合成的基因整合到植物基因組中才能發(fā)揮其作用［77］。因此，研究人員又開發(fā)出一種不依賴于植物細胞遺傳轉化體系：核糖核蛋白轉化法。該方法先將CRISPR/Cas9 蛋白和gRNA 在體外組裝成核糖核蛋白復合體（RNP）［78-79］，然后將該復合體轉化到萵苣和小麥的原生質體中，獲得不含轉基因片段的突變植株［79］。 此外，上述遺傳轉化技術都需要進行植物組織培養(yǎng)，效率往往較低，還易導致基因組發(fā)生不可預測的變化［80］。最新研究發(fā)現(xiàn)在植物中同時表達WUSCHEL（WUS）、SHOT MERISTEMLESS（STM）、MONOPTEROS（MP）等主要發(fā)育調控因子和基因編輯元件，可從頭誘導分生組織獲得穩(wěn)定遺傳的轉基因和基因編輯植物［81］。

值得一提的是農(nóng)桿菌介導的基因瞬時表達滲透技術，因其操作簡單（僅需無針注射器與根癌農(nóng)桿菌懸浮液浸潤葉片）、轉化效率高（同時實現(xiàn)多基因表達）和檢測周期短（幾小時或幾天就可以產(chǎn)生蛋白）等特點被廣泛應用于利用植物底盤生產(chǎn)天然產(chǎn)物。例如：利用瞬時表達技術在煙草中生產(chǎn)萜類化合物［82］。

3.4 質體遺傳轉化

質體是植物細胞合成代謝中最主要的內共生細胞器，是由植物細胞內的前質體分化而來的，分為葉綠體、有色體和白色體，具有原核生物基因組的特點。在質體中發(fā)生的主要反應有光合作用，淀粉、氨基酸、脂肪酸、色素以及氮、硫代謝［83］。與核基因組轉化相比，葉綠體轉化具有無可比擬的優(yōu)勢：①通過基因工程，可以將多基因串聯(lián)，置于同一個操縱子中［84］；②高效表達外源蛋白，如葉綠體轉化煙草植株可產(chǎn)生高達70%的可溶性蛋白［85］；③沒有表觀遺傳效應，不會產(chǎn)生基因沉默和位置效應［86］；④母系遺傳特性很大程度上阻止外源基因通過花粉傳播［86］。目前質體成功轉化的物種有20 余種，其中體系穩(wěn)定且高效表達的是煙草質體轉化體系，以基因槍法為主，一般經(jīng)過2～3輪篩選，使所有質體基因組均同質化。除了基因槍技術，人們還可以利用脂質交換膜滲透（LEEP）技術，借助納米顆粒（包裹著殼聚糖的碳納米管）將基因在無外力作用的情況下運輸?shù)街参锛毎娜~綠體中。進入葉綠體后，在葉綠體弱酸性環(huán)境下，DNA 被釋放，進而合成相應的蛋白［87］。因為植物細胞一般有幾十個葉綠體，所以以葉綠體作為生物反應器可以高效地表達如抗體［88］和口服型疫苗［89］等外源蛋白，還可以創(chuàng)制抗病抗蟲抗干旱等非生物脅迫的轉基因植物材料［90］。有意思的是，有研究表明利用嫁接技術不僅可以實現(xiàn)整個質體基因組在同一物種的細胞間發(fā)生轉移［91］，還可以實現(xiàn)在兩個種間不親和的茄科植物中發(fā)生轉移［92］，這為打破種間隔離，產(chǎn)生新物種提供了更多可能性。

3.5 植物染色體工程

相對于傳統(tǒng)的遺傳轉化和育種過程，染色體工程具有如下的優(yōu)勢：①使用染色體系統(tǒng)可以整合和表達多個外源基因。這些基因既可以是多個基因的簡單堆疊，也可以是對復雜基因復合物的工程改造［93］；②染色體特定位點重組技術能對目標位點進行定點整合，而不會產(chǎn)生因隨機插入導致的基因表達水平改變、基因沉默、插入基因突變等情況［94］，并能防止內源基因的功能被破壞［93］；③在傳統(tǒng)育種過程中，引入目標基因或染色體片段時往往也會引入連鎖的帶有不良性狀的染色體片段，而簡單的回交等育種方式無法消除這一負面影響。染色體工程中的人工染色體技術（PAC）可以避免傳統(tǒng)育種過程中產(chǎn)生的連鎖累贅。PAC 上的整個基因起著一個連鎖基團的作用，可以在一次雜交中轉移而無需從基因組中引入其他基因［93，95］。

人工染色體是染色體工程新的熱點研究方向，它是由必需的順式作用元件構成的人造線性或環(huán)狀DNA分子，主要包含主復制序列（ARS）、著絲粒和端粒三個功能元件。它可以作為新的載體系統(tǒng)轉移和疊加多個外源基因。構建人工染色體的方法有兩種：一種是自下而上，對染色體的功能元件（如復制起點，著絲粒、端粒等）進行組裝［96］；另一種是自上而下，改造原有或已知的染色體，從中挑選微小染色體并在植物體內進行定點整合［97］，如端粒介導的染色體截斷技術，在擬南芥、水稻和玉米等［98-99］產(chǎn)生了微小染色體，這是目前更常見的合成和構建微小染色體的方法。將單倍體育種技術（如CENH3 的從頭合成［100］）與PAC 結合會加速植物新品種的選育［101］，為它們提供良好的特性，如抗旱、抗蟲等［101］。此外，改造的植物也可以作為大規(guī)模生產(chǎn)特定蛋白質或代謝物的工廠［102］。

4 植物合成生物學的研究應用

隨著植物合成生物學的迅猛發(fā)展，研究人員可以通過設計和改造植物來滿足人們更多的需求。如合成多樣化的生物傳感器來監(jiān)測細胞內的活動，定向改造作物提高產(chǎn)量和豐富營養(yǎng)品質，合成植物天然產(chǎn)物或蛋白質。這些工程學應用使植物合成生物學逐步走向成熟。

4.1 合成生物傳感器

植物每時每刻都在不停地調動體內營養(yǎng)物質、代謝物和信號分子來維持代謝活動。要理解植物內部細胞是如何調動這些資源從而實現(xiàn)體內動態(tài)代謝生命活動，需要一類蛋白質或RNA 元件來識別特定的生物活性分子或其體內發(fā)生的某些生物學過程，并將其轉換成可輸出、可檢測甚至可計量的信號。這類生物元件被稱為生物傳感器［103］。

生物傳感器分為直接生物傳感器和間接生物傳感器［103］。目前鈣指示劑是最先進、應用最廣泛的直接生物傳感器。無論是生物發(fā)光、化學熒光還是熒光蛋白和鈣結合后熒光強度發(fā)生變化，都可以通過測量光強來衡量細胞內鈣信號變化［104］。檢測植物體內激素信號的啟動子-報告基因系統(tǒng)則屬于間接生物傳感器，如生長素的DR5v2 和DR 5啟動子［105］、細胞分裂素的TCS 啟動子［106］、乙烯的EBS 啟動子［107］和脫落酸的UAS 啟動子［108］，它們能驅動GUS 或熒光蛋白基團來轉錄響應相關激素變化過程。內源激素信號還可以通過熒光共振能量轉移（FRET）生物傳感器進行檢測［109］。例如：在ABACUS 和ABAleon 兩個生物傳感器［110］中，ABA 響應會改變受體和磷酸酶相互作用的鉸鏈區(qū)域的構象，從而改變供體和受體熒光前體之間的相互作用，促使熒光共振能量轉移。最近一些研究還開發(fā)了可檢測植物營養(yǎng)物質變化的生物傳感器。例如：cpFLIPPi 可以檢測根表皮細胞在磷饑餓和補充反應中胞漿的磷濃度變化［111］；高親和力FRET 的Zn2+生物傳感器通過檢測兩個金屬結合域ATOX1 和WD4 與Zn2+結合后的能量轉移來檢測Zn2+的濃度［103］。光敏色素信號還可以作為溫度傳感器，監(jiān)測植物的光合溫度信號變化［112］。植物前哨生物傳感器可以經(jīng)過特定修飾檢測信號并對害蟲、病原體和非生物脅迫等環(huán)境因素做出應對反應。如三硝基甲苯（TNT）全植物生物傳感器可以快速激活脫綠基因的電子通路，使葉綠素降解相關的基因上調表達［113］。

4.2 提高農(nóng)作物產(chǎn)量

對于農(nóng)作物來說，第一要務就是要提高產(chǎn)量。而產(chǎn)量的提升可以從提高光合作用效率、促進植物與根際微生物間的有益相互作用、促進養(yǎng)分的獲取減少肥料使用、增強抵御非生物脅迫的能力及提高水的利用效率等方面入手。合成生物學的出現(xiàn)，為研發(fā)提高農(nóng)作物產(chǎn)量的方法提供了新的思路。

4.2.1 提高光合作用效率

光合作用是植物生長和生物量生產(chǎn)的主要動力。增加植物生物量和提高作物產(chǎn)量最主要的手段是提高植物對光能的利用效率。提高光合作用效率主要有以下幾個策略。

（1）優(yōu)化光合作用的光反應。光合作用的電子轉移反應（也稱為光反應）提供了CO2同化所必需的ATP 和NADPH。通過過表達電子傳遞鏈的成分可以促進電子運輸進而導致更高的CO2同化效率，如細胞色素b6f 復合物及其相關蛋白PsbS 和Rieske FeS 亞基的調控［114］。減少因葉片過量光吸收而導致的非光化學猝滅過程（NPQ）中的能量損失，可以加快煙草從光保護中恢復，從而顯著提高了煙草的生長速度［115］。

（2） C3 植物中引入藍藻CO2濃縮機制（CCMs）。藍藻有不同于C3 植物的二氧化碳濃縮機制（CCM），通過累積細胞質內的無機碳酸氫鹽（）作為主要碳源，后經(jīng)碳酸酐酶催化形成CO2促進Rubisco 羧化，從而實現(xiàn)高效率碳固定。藍藻中已經(jīng)鑒定出幾種可以促進植物CO2運輸和光合碳同化的基因，如在擬南芥、煙草和大豆中的Ictb （無機碳轉運蛋白B） 可以通過積累［116］，進而增強光合碳同化作用。過表達Ictb 和FBP/Sbpase（果糖1，6-二磷酸酶/景天庚酮糖1，7-二磷酸酶）不僅增強了水稻的光合作用也提高了水稻籽粒的產(chǎn)量［117］。還有研究表明，在C3植物中從頭構建簡化的α-羧酶體可以使植物產(chǎn)生部分固碳能力，這對在植物中引入CCM 具有重要意義［118-119］。

（3）設計和改造碳固定通路和光呼吸旁路。研究人員通過對來自9 種生物體中的17 種酶進行組合，將甲基琥珀酰輔酶A 脫氫酶（Mcd）改造成氧化酶（Mco），最終在體外人工構建出一條名為CETCH 的碳固定通路，其固定CO2的速度為傳統(tǒng)的卡爾文循環(huán)的10倍以上［120］。由于光呼吸涉及多種生理功能，如光合作用代謝、光保護、H2O2信號傳導、硝酸鹽吸收、C1 代謝和適應生物/非生物脅迫等［121］，單純抑制光呼吸作用可能會影響其正常生長。因此，需要設置光呼吸旁路，使植物在乙醇酸完全氧化成二氧化碳的過程中，不產(chǎn)生還原當量，從而提高生長速度和增加生物量。目前，已在煙草葉綠體中人工合成出3條光呼吸旁路：①大腸桿菌乙醇酸氧化途徑的五種基因；②植物的乙醇酸氧化酶、蘋果酸合酶以及來自大腸桿菌的過氧化氫酶；③植物蘋果酸合成酶和綠藻乙醇酸脫氫酶［122］。設置這些光呼吸旁路途徑使轉基因煙草的生長量比野生型煙草提高了約40%［55］。旁路工程使植物顯示出更高的光合作用和生物量產(chǎn)量，并減少了光呼吸作用。

4.2.2 減少氮、磷肥的使用

豆科植物和根瘤菌的共生固氮機制是生物固氮的重要途徑。目前主要有兩種策略在谷物根中重現(xiàn)固氮共生機制：①將豆科植物-根瘤菌的固氮通路轉移到谷物中，建立起谷物和根際微生物的聯(lián)系；②改善谷物根中已存在的信號通路實現(xiàn)共生固氮。在豆科共生固氮過程中，幾種根瘤菌在豆科結節(jié)中合成了一類根狀莖化合物（rhizopines），這類化合物由scyllo-inosamine 1（SIA）和3-O-methyl-scyllo-inosamine 2（3-O-MSI）兩種物質組成，并且受核心正調節(jié)基因nifA的調控［123］。通過建立苜蓿和大麥的轉基因植物和根際微生物兩者間由SIA介導的跨界信號通路，可激活非豆類作物根系微生物群落的特定組分從而實現(xiàn)非豆類作物的固氮的可能性［124］。除了根狀莖中的rhizopines，根部釋放出的類黃酮也可以刺激根瘤菌產(chǎn)生信號分子結瘤因子（NOD）［125］，其誘導的信號通路與單子葉植物之間保守的共生信號（SYM）通路是類似的。通過改造單子葉植物現(xiàn)有SYM 途徑，使其被NOD 因子激活，進而導致谷物菌根與固氮根瘤菌產(chǎn)生聯(lián)系進行固氮［126］。此外，通過固氮基因nif（vnf/anf）或結瘤固氮通路來直接調控谷物底盤［127］，如水稻［96］、小麥［128］、玉米和大麥［129］等的氮利用效率，減少氮肥使用。

磷是植物生長的必要關鍵元素之一。由于磷元素在土壤中易被固定，植物難以吸收，磷肥的有效利用率低［130-131］。在長期進化過程中，植物形成了一系列抵抗低磷脅迫的適應機制［132］。提高植物對磷的吸收能力的常見策略如下。①增加根系分泌物（主要是有機酸和酸性磷酸酶）的合成和分泌，其中植酸酶基因和紫色酸性磷酸酶基因的超量表達可以促進植物對根際有機磷的溶解，提高對磷元素的吸收［133-134］；過表達蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase， MDH）和檸檬酸合成酶（citrate synthase， CS）［135］基因，可以調控植物有機酸的合成，進而促進對難溶性無機磷的活化作用，提高作物對磷肥的利用。②形成植物和根際微生物的共生體系［136］。當植物在低磷環(huán)境下，根際微生物可促使植物開啟低磷脅迫適應機制PSR（phosphate starvation responses），增強從土壤中吸收磷的效率。研究表明PHR1 核心轉錄因子可以調控PSR。構建一個不依賴磷積累的可控磷脅迫響應開關，即在非低磷脅迫條件下，根際微生物也會大量吸收土壤中的磷素，進而提高植物對磷的利用效率［137］。

4.2.3 抵御非生物脅迫

脫落酸（ABA）是一種倍半萜類植物激素，在調節(jié)植物發(fā)育、生長及應對非生物脅迫反應中都起關鍵作用。然而脫落酸的化學性不穩(wěn)定、合成成本極高，不易利用。因而，通過改造脫落酸受體或合成脫落酸結構功能類似物，有助于更好地利用脫落酸抗旱，同時避免脫落酸對作物帶來的脫葉傷害，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著廣闊的應用前景。

研究表明，脫落酸受體蛋白（PYR1/PYL/RCAR），能夠識別和啟動ABA 信號轉導［138-139］。利用蛋白質工程開發(fā)出新的脫落酸受體，即PYR1的六突突變體（PYR1MANDI），使其可以特異性識別雙炔酰菌胺（mandipropamaid，一種農(nóng)業(yè)常用滅菌劑），啟動ABA信號通路，既有效提高了植物抗旱性，又避免了脫落酸的脫葉作用，不影響植物的正常生長發(fā)育［140-141］。目前還發(fā)現(xiàn)了幾種脫落酸功能類似物。Pyrabactin［142］是第一個人工合成的脫落酸類似物，可以與PYL 受體的部分亞基特異性結合，作為種子抑制劑而發(fā)揮作用。AM1（ABA mimicking）［143］，也稱為Quinabactin［144］，不僅可以抑制植物種子發(fā)芽，而且在增強抗旱性方面具有廣譜性，但是它的受體親和性比脫落酸更弱，因此抗旱性較弱，并不適合大面積使用和推廣?；贏M1 的主鏈結構又人工衍生出新型化合物AMF4（在AM1 的4-甲基苯基環(huán)的鄰位和間位添加了四個氟原子）［145］。與AM1 相比，AMF4 可與PYL 受體形成更多的氫鍵，導致其與受體的親和性較脫落酸高出一個數(shù)量級。因此噴灑AMF4可以使植物表現(xiàn)出更強的耐旱性。在植物中如果過表達PYL2基因，還可以進一步增強AMF4 的抗旱性。 最新發(fā)現(xiàn)的脫落酸類似物Opabactin（OP）［146］，其受體親和力相對于脫落酸提高了約7倍，在植物體內最高可提高10 倍，且在不同作物（如小麥、番茄、大麥、擬南芥）中均有活性，解決了之前磺酰胺分子的局限性，使其有望成為“超級激素”。這些脫落酸類似物的發(fā)現(xiàn)，為植物抵御非生物脅迫，尤其是應對干旱脅迫提供更多的保障。

4.3 增強作物營養(yǎng)品質

植物性營養(yǎng)素（黃酮類、花青素、類胡蘿卜素等）和微量營養(yǎng)素（維生素和礦物質元素）對人體健康具有重要意義。缺失這些營養(yǎng)物質被稱為“隱性饑餓”，嚴重會導致心血管疾病甚至是癌癥發(fā)生，因此人們對于開發(fā)健康防護類的營養(yǎng)可食用主糧和蔬菜作物興趣日益濃厚。

4.3.1 植物性營養(yǎng)素

花青素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、角黃素和蝦青素是工業(yè)上常用的高價值類著色劑和飼料補充劑，它們也是有效的抗氧化劑。對于黃酮類、花青素和類胡蘿卜素這些代謝通路研究相對清楚的化合物，有兩種常見的方法提高營養(yǎng)素的水平。①通過特異性啟動子過表達單個或多個關鍵酶基因和/或轉錄因子基因提高營養(yǎng)素含量。如：水稻胚乳作為黃酮類生物合成的“生產(chǎn)車間”，水稻種子或胚乳特異性啟動子與大量合成相關的酶（OsPAL， OsCHS， AtF3H， AtFLS， GmIFS，

PcFNSI，GmFNSII，OsOMT）融合可高效產(chǎn)出黃酮類化合物，如黃烷酮、黃酮醇、異黃酮和黃酮［147］?；ㄇ嗨厣锖铣墒芏喾N轉錄調控因子控制，在番茄中用果實特異性啟動子過表達SlAN2-like［148］、AtMYB12［149］和SlMYB75［150］等轉錄因子均獲得了果皮和果肉中富含花青素的紫色番茄。而將多種植物或細菌的類胡蘿卜素合成關鍵酶基因（PSY、CRT、LCY等）轉化到水稻、玉米、小麥、高粱、大豆、番茄和馬鈴薯等作物中可以增加β-胡蘿卜素、玉米黃素、角黃素和蝦青素含量。其中，八氫番茄紅素合成酶（PSY）是類胡蘿卜素合成途經(jīng)的第一個關鍵限速酶［151］，是生物強化的理想候選基因。僅過表達PSY單基因已成功培育出多種生物強化作物，在水稻中引入水仙花PSY酶基因和細菌胡蘿卜素去飽和酶基因（CRT）則生產(chǎn)出一代黃金大米［152］。胡蘿卜素生物強化中另一個重要的基因是編碼1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）基因，在上游MEP 途徑中發(fā)揮重要作用。將AtDXS轉入水稻中導致水稻胚乳中的類胡蘿卜素的含量顯著提高［153］。②在營養(yǎng)缺乏的作物中重構生物合成途徑。如：創(chuàng)制富含β-胡蘿卜素的二代黃金大米、富含花青素的紫晶米和紫玉米、富含角黃素的角黃素米和富含蝦青素的赤晶米等。利用高效的多基因載體系統(tǒng)TGSⅡ，在水稻胚乳中同時表達8個花青素合成及調控相關外源基因，獲得高花青素含量的紫色胚乳水稻［154］。利用胚乳特異性啟動子驅動雙基因（sZmPSY1、sPaCrtI）、三基因（sZmPSY1、 sPaCrtI、 sCrBKT） 和四基因（sZmPSY1、sPaCrtI、sCrBKT、sHpBHY），分別獲得了無選擇標記的富含黃色β-胡蘿卜素的二代黃金大米、角黃素大米和蝦青素大米新種質［54］。利用玉米胚乳特異性雙向啟動子（PZmBD1）、2A 連接肽和4 個花青素合成基因（ZmBz1、ZmBz2、ZmC1、ZmR2）及7 個報告基因組成玉米多基因表達體系（MES），開發(fā)出胚和胚乳花青素富集的紫色玉米［155］。

4.3.2 微量營養(yǎng)素

微量營養(yǎng)素包括多種維生素（B族維生素、維生素C 和維生素E）、鐵和鋅等礦質元素［156］。大部分微量營養(yǎng)素是細菌、真菌和植物從頭合成的，而人則主要依靠飲食來補充。植物作為飲食的重要組成部分，是這些營養(yǎng)素的主要來源。大多數(shù)主食作物（如小麥、水稻、玉米、馬鈴薯和木薯）微量營養(yǎng)素含量較低，需要改善其營養(yǎng)組成［156］。

在植物中實現(xiàn)生物強化的B族維生素是維生素B1（硫胺素）、維生素B6和維生素B9（葉酸），都是人體必不可少的水溶性維生素。過表達維生素B1部分合成基因，如THI1和THIC（4-甲基-5-C 噻羥乙基噻唑磷酸合酶和4-氨基-2-甲基-5-羥甲基嘧啶磷酸合酶），可以導致未拋光水稻種子中硫胺素含量增加了五倍［157-158］。單獨過表達維生素B6合成的關鍵酶［磷酸吡哆醛合成酶（PDX1）和磷酸吡哆醛谷氨酰胺酶（PDX2）］，維生素B6含量的增加并不顯著［159-160］，但在木薯中同時過表達擬南芥的PDX1.1和PDX2基因可以顯著增加葉片和塊根總的維生素B6含量，與非轉基因相比葉片和塊根分別提高了3.9～48.2 倍和1.9～5.8 倍［161］。目前也開發(fā)出多種葉酸強化作物，如水稻［162］、玉米［163］和馬鈴薯［164］。主要通過增加兩種葉酸前體（喋呤和pABA）含量來增強葉酸生物合成。如：同時過表達GTPCHI和ADCS成功地將番茄［165］和水稻［162］中的總葉酸含量分別提高了25 倍和100 倍；在水稻同時過表達GTPCHI、ADCS、FPGS和FBP獲得了比野生型水稻高150 倍的葉酸生物強化水稻［166］；過表達GTPCHI，ADCS，HPPK/DHPS和FPGS使轉基因馬鈴薯的成熟塊莖中葉酸含量最多增加12 倍，并且長達9 個月的儲藏時間內保持穩(wěn)定［167］。

維生素C（抗壞血酸）的生物強化主要是通過過表達其生物合成基因或沉默其代謝基因來實現(xiàn)。其中維生素C含量增加比較多的例子是在番茄中過表達合成關鍵酶GGP（GDP 半乳糖磷酸化酶），致使果實中維生素C含量比對照提高了6.2倍［168］。與過表達合成基因不同，在番茄［169］、玉米［163］和馬鈴薯［164］中沉默代謝基因（單脫氫抗壞血酸還原酶MDHAR 和脫氫抗壞血酸還原酶DHAR）后維生素C的增加量較少。此外，GGP在翻譯水平上也受到調節(jié)，敲除GGP 的上游開放閱讀框（uORF）會破壞抗壞血酸的反饋抑制，從而增加擬南芥［170］、生菜［171］和番茄［172］的維生素C濃度。

維生素E是一種脂溶性維生素，其中α-生育酚的生物活性最高，約是γ-生育酚的10 倍。大豆、玉米、棕櫚和芥子油中所含的γ-生育酚的占比是α-生育酚的10 倍，因此需要設計代謝工程將γ-生育酚轉換成活性更高的α-生育酚。過表達γ-TMT（γ-生育酚甲基轉移酶）可實現(xiàn)這一轉化，導致α-生育酚在生育酚中的比例增加，如玉米中增加6.5 倍，約占總數(shù)的94%［173］。過表達多個維生素E生物合成基因會導致總維生素E含量大量增加。如大豆中特異性表達大麥的HGGT（香葉基香葉基轉移酶）和大豆γ-TMT，生育三烯酚增加了8～10倍，大豆油的氧化穩(wěn)定性也得到了提高［174］。

在人類賴以生存的礦物質營養(yǎng)素中，鐵和鋅在許多新陳代謝過程中都起著至關重要的作用。考慮到農(nóng)作物中鐵和鋅積累的復雜機制，主要通過以下方法來提高作物中鐵和鋅的生物利用效率。①增加金屬結合蛋白和相關酶的表達，如Fer（鐵蛋白）［175］、NAS（煙堿胺合酶）［176］、NAAT（煙堿胺轉氨酶）和脫氧葡糖酸合酶（DMAS）［177］；②增強鐵和鋅從根部到食用部位的轉運和運輸，如IRT（鐵調節(jié)金屬轉運蛋白）［178］、YSL（黃色條紋蛋白）［179］、ZIP（鋅鐵調控蛋白）［180］；③減少抑制鐵和鋅吸收的抗營養(yǎng)素，如植酸［181］。其中比較成功的例子是將擬南芥IRT1和NAS1基因與小麥的FER基因在水稻胚乳中特異性協(xié)同表達使水稻胚乳中鋅和鐵的含量高達33.17μg/g （以干重計，下同）和10.46 μg/g［182］；利用薯塊特異性啟動子表達擬南芥鐵轉運蛋白（IRT1）和鐵蛋白（FER1）使轉基因木薯中鐵含量提高了7～18倍，鋅含量提高了3～10倍［178］。需要注意的是因為金屬元素的特性，增加鋅和鐵等有益元素同時有害元素（如鎘）也容易大量積累［183］，其中過表達OsHMA3［184］可將根部的鎘運輸?shù)揭号葜袕亩档偷厣喜糠宙k的積累量。

4.4 植物天然產(chǎn)物合成

植物一直以來都是藥物、營養(yǎng)素、香料和調味料等的主要來源。由于目標代謝物豐度較低、結構復雜性、原始植物生長緩慢等，加大了研究和開發(fā)的難度。為了解決這些問題，科研人員開始使用異源宿主生產(chǎn)天然代謝產(chǎn)物。植物底盤具有類似結構和功能的細胞器、輔酶（如P-450 酶）、輔酶因子以及前體物質，更利于蛋白表達和表達后修飾。因此，植物底盤更適于重建復雜天然產(chǎn)物生物合成途徑。模式植物本氏煙草因為其生長周期短和適合農(nóng)桿菌介導的瞬時表達而被作為理想的研究對象［82］。通過在本氏煙草中重構了天然產(chǎn)物的通路，已成功合成多種天然活性物質，如長春花堿和長春新堿［185］、鬼臼毒素（依托泊苷的天然產(chǎn)物前體）［186］、甜菜堿［187］、紅景天苷（紅景天屬酚類天然產(chǎn)物）［188］、青蒿素［189］、紫杉二烯和5α 杉羥基紫杉二烯。其中紫杉二烯和5α-羥基紫杉二烯（紫杉醇關鍵中間體）［190］是通過在煙草葉綠體中導入紫杉二烯合成酶（TS）、紫杉二烯-5 二-羥化酶（T5H） 及其細胞色素P-450 還原酶（CPR），同時過表達MEP（甲基赤蘚糖醇磷酸）途徑上的關鍵合成酶DXS（1-脫氧木酮糖-5-磷酸關鍵分支酶）以及GGPPS（香葉基香葉基焦磷酸合成酶）生產(chǎn)出來的，其產(chǎn)量分別為56.6μg/g（以總重計，下同）和1.3μg/g。此外，番茄果實因其富含多種代謝底物（糖和芳香族氨基酸）、中間體（4-香豆酰輔酶A 和乙?；o酶A）、代謝產(chǎn)物（苯基丙烷和萜類化合物），產(chǎn)量大和果實便于提取分離純化目標化合物等特性成為了植物代謝工程最受歡迎的底盤植物［191］。目前，番茄果實通過代謝工程已可以產(chǎn)生高價值代謝物，如甜菜堿［192］和類胡蘿卜素［193］（角黃素、金盞花紅素和蝦青素）、迷迭香酸、生育酚、膽固醇及其衍生物（甾體皂甙，薯蕷皂苷元（用作激素藥物）及其衍生物黃體酮、甾體生物堿（SA）香豆精苷和潛在的抗癌藥維生素D3［194］。

萜類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物中最大的一類，植物中藥用萜類化合物的生物合成是一個相當復雜的過程，其中絕大多數(shù)都涉及細胞色素P-450 酶（CYP450）［195］。植物中大約有1%的基因編碼P-450 酶，是植物天然產(chǎn)物結構多樣的重要驅動因素之一。與參與植物初生代謝途徑的酶相比，P-450 酶參與次生代謝反應效率偏低，部分P-450酶底物的專一性差，因此改造P-450 酶對于植物天然產(chǎn)物合成生物學的研究有著重要意義。作者所在實驗室之前開發(fā)了一套基于蛋白結構與組學數(shù)據(jù)改造植物P-450 酶功能的方法［196］，為植物天然產(chǎn)物代謝工程和合成生物學研究提供了新的思路。

5 植物合成生物學存在的問題

與單細胞微生物相比，多細胞植物生長周期更長、基因組更大、細胞器更多、代謝與調控機制更復雜，這些都加大了利用植物體系來開展合成生物學研究的難度。雖然在微生物中合成元件、線路和模塊化設計都已有很多成功的例子［197］，但因為植物體系本身的復雜性導致人工定制可利用的生物元件偏少，多使用植物天然元件，如順式調控元件、啟動子和終止子等［28-29］，在組裝方面難以實現(xiàn)標準化和工程化。此外，由于植物需要隨時應對不斷變化的外界環(huán)境，如何精準控制合成線路和模塊中基因表達和轉錄調控提高對環(huán)境的適配性也將是植物合成生物學研究的難點和重點。植物合成生物學常用到的轉基因技術具有一定的局限性［198］，如周期長，轉化效率受物種限制，基因編輯技術則可能會造成無法預估的脫靶問題，導致一定的安全風險問題［198-199］。在作物中，染色體工程中誘發(fā)微小染色體的方法缺乏通用性，而且染色體截斷技術還不夠穩(wěn)定，多基因轉化體系仍需要繼續(xù)完善［200］。

合成生物學也和大多數(shù)科學技術一樣被視為雙刃劍，尤其是制造“生命”的倫理問題，挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)的生命觀念、自然發(fā)展的規(guī)律、進化論和尊重生命的倫理法則［201］。目前，世界各國圍繞植物轉基因技術的爭議一直存在如獲得世界糧食大獎的黃金大米至今未商業(yè)化［202］，可以預見消費者接受和社會認可轉基因作物還需要一個緩慢的過程。未來植物合成生物學將廣泛應用于農(nóng)業(yè)和環(huán)境等領域，尤其需要謹慎使用和關注改造的植物體系，人工合成植物對生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性和生物多樣性造成潛在的安全風險［203］。同時要進一步完善安全倫理監(jiān)管機制，制定相應的安全倫理法規(guī)，加強科研人員和媒體、公眾之間的交流等措施促進我國植物合成生物學健康發(fā)展。

6 植物合成生物學的未來發(fā)展趨勢

雖然植物體系比微生物更加復雜，但植物合成生物學研究也具有其獨特的優(yōu)勢。植物來源的天然產(chǎn)物生物合成、調控及轉運元件、線路和模塊能更好適應植物底盤。隨著植物基因組、轉錄組、蛋白組、代謝組和表型組等組學大數(shù)據(jù)的快速發(fā)展，利用多種組學數(shù)據(jù)進行突變體庫篩選、元件發(fā)掘以及模型預測加速了植物代謝網(wǎng)絡和信號轉導通路等數(shù)據(jù)發(fā)掘工作，已成為植物合成生物學研究必備研究策略，為未來植物合成生物學研究提供了新的契機。利用農(nóng)桿菌介導的瞬時表達技術可在煙草中快速表達多個基因，其操作簡單、周期短和轉化效率高，適用集設計（多基因快速遺傳轉化體系）、測試（生產(chǎn)出重組蛋白）、優(yōu)化（擴大規(guī)模大量生產(chǎn)）于一體的轉化原則，有望成為生產(chǎn)植物生物活性物質和其他高價值化學物質的底盤植物。

隨著全球氣候變暖，極端天氣頻繁出現(xiàn)，大力發(fā)展新的科學技術保障世界糧食安全日趨緊迫。植物合成生物學研究將在未來提高農(nóng)作物產(chǎn)量、增強作物營養(yǎng)品質等方面發(fā)揮著重要作用。其中，提高光合作用效率是未來農(nóng)業(yè)增產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。未來有望通過優(yōu)化光合作用酶（如Rubisco 和ATP合成酶）以及構建新的光呼吸旁路；將C4 植物的高光效途徑轉移到C3 植物宿主中；創(chuàng)建全新光合通路（如不用Rubisco）甚至人造葉綠體基粒等［204］生物膜堆疊系統(tǒng)來提高光能利用率提高農(nóng)作物產(chǎn)量。此外，人工構建固氮酶以及工程菌提高根瘤菌和非豆科植物互作效率，從而減少氮肥用量同樣是未來農(nóng)業(yè)發(fā)展必然趨勢，也必將依賴于植物合成生物技術的突破和快速發(fā)展。

致謝：本研究由國家重點研發(fā)計劃“合成生物學”重點專項，合成植物天然產(chǎn)物的微生物細胞工廠構建及其應用示范（2018YFA0901800）和云南師范大學研究生科研創(chuàng)新基金項目（ysdyjs2019170）資助，同時這項工作也得到了云南省和深圳市政府的支持。