四川省攀西地區(qū)山羊泰勒蟲(chóng)病血清學(xué)檢測(cè)

郝桂英，袁曉琴，陳永航，莫 全，嚴(yán)光文，李鳳琴，楊應(yīng)東，萬(wàn) 潔，文建國(guó)，吉色曲伍

（1.西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，四川西昌 615013；2.攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院畜牧水產(chǎn)所，四川攀枝花 617061；3.涼山彝族自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川西昌 615000）

山羊泰勒蟲(chóng)病（caprine theileriosis）是由頂復(fù)門(mén)（Apicomplexa）梨形蟲(chóng)綱（Piroplasmea）梨形蟲(chóng)目（Piroplasmida）泰勒科（Theileriidae）泰勒屬（Theileria）的原蟲(chóng)寄生于山羊巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)所引起的一類(lèi)由媒介蜱傳播的血液原蟲(chóng)病[1]。該病主要發(fā)生于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，呈地方性流行，以高熱、貧血、消瘦、體表淋巴結(jié)腫大為主要臨床特征，可引起羔羊和外地引進(jìn)羊大量死亡，使慢性發(fā)病羊發(fā)育遲緩，產(chǎn)肉量顯著下降，給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展[2]。

我國(guó)流行的羊泰勒蟲(chóng)主要是尤氏泰勒蟲(chóng)（T.uilenbergi）、呂氏泰勒蟲(chóng)（T.luwenshuni）和綿羊泰勒蟲(chóng)（T.ovis）[3]。由于泰勒蟲(chóng)病為蜱傳性疾病，因此該病的流行隨媒介蜱的分布和活動(dòng)，呈現(xiàn)出明顯的地方性和季節(jié)性特征。羊泰勒蟲(chóng)病在新疆、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、甘肅、青海、寧夏、河北、河南、山西、陜西、山東、湖北、浙江、江蘇、廣東、貴州、重慶、四川等19 個(gè)省市區(qū)均有報(bào)道。近年來(lái)，隨著養(yǎng)羊業(yè)的迅速發(fā)展，我國(guó)羊泰勒蟲(chóng)病的發(fā)生呈上升趨勢(shì)。而該病在自然感染病例中常為隱性感染，因而增加了該病的防控難度[4]。

血涂片鏡檢法常用于泰勒蟲(chóng)病的診斷，然而其靈敏性低，所以檢出率也低，易出現(xiàn)漏檢和誤診，在檢測(cè)領(lǐng)域受到一定的限制。隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的檢測(cè)方法被建立并用于泰勒蟲(chóng)病檢測(cè)，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）具有較好的特異性和靈敏性，操作簡(jiǎn)便，易于標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)試驗(yàn)條件要求不高，更適于基層實(shí)驗(yàn)室大量血清樣品的檢測(cè)，因此被廣泛用于流行病學(xué)調(diào)查研究[5-7]。

攀西地區(qū)位于四川省西南部，在安寧河、金沙江和雅礱江交匯處，山場(chǎng)廣闊，是四川省養(yǎng)羊的傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)之一，在全省養(yǎng)羊業(yè)中具有舉足輕重的地位。隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，養(yǎng)羊業(yè)已成為攀西地區(qū)脫貧致富的主要途徑。目前，羊散養(yǎng)在攀西地區(qū)仍占主導(dǎo)地位，且蜱在該地區(qū)分布廣泛，因此該地區(qū)養(yǎng)羊業(yè)受到泰勒蟲(chóng)病的潛在威脅。迄今，僅見(jiàn)郭淑珍等[8]報(bào)道，2001—2002 年涼山彝族自治州羊泰勒蟲(chóng)病發(fā)病率為70%（35/50），死亡率為40%（20/50）。為了解四川省攀西地區(qū)山羊泰勒蟲(chóng)病流行情況，采用雙抗原夾心ELISA 方法，對(duì)采自涼山州和攀枝花市的640 份山羊血清進(jìn)行泰勒蟲(chóng)病血清學(xué)檢測(cè)，以期為當(dāng)?shù)匮蛱├障x(chóng)病防制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清 2013 年11月—2019 年12月，在四川省涼山州西昌市（427 份）、布拖縣（36 份）、會(huì)理縣（31 份）、會(huì)東縣（20 份）、美姑縣（10 份）、寧南縣（20 份）、普格縣（36 份）、鹽源縣（19份），以及攀枝花市米易縣（19 份）、鹽邊縣（22 份）等10 個(gè)縣/市，無(wú)菌采集640 份山羊血，其中136份采集自西昌市養(yǎng)羊場(chǎng)，其余樣品均采自羊散養(yǎng)戶(hù)。待血液凝固析出血清后，3 000 r/min 離心10 min，分離血清，編號(hào)后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 羊抗泰勒蟲(chóng)病ELISA 檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京綠源伯德生物科技有限公司，其抗原為呂氏泰勒蟲(chóng)重組表達(dá)表面蛋白（rTlSP）。

1.2 方法

1.2.1 雙抗原夾心ELISA 法檢測(cè) 根據(jù)羊抗泰勒蟲(chóng)病ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。使用前，將試劑盒置于室溫平衡20 min 后，取出所需量酶標(biāo)板條，設(shè)空白對(duì)照1 孔，陰性及陽(yáng)性對(duì)照各2 孔。在陰、陽(yáng)性對(duì)照孔，分別加入陰、陽(yáng)性對(duì)照各50 μL；在待測(cè)樣品孔，先加待測(cè)血清10 μL，再加樣本稀釋液40 μL；隨后在陰、陽(yáng)性對(duì)照孔和待測(cè)樣品孔中，每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗原100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃溫育1 h。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1 min。甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5 次。每孔加入底物液A、B 各50 μL，37 ℃避光溫育15 min。每孔加入終止液50 μL，用空白孔調(diào)零，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光值（OD值）。

1.2.2 結(jié)果判定 試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD平均值≥1.00，陰性對(duì)照孔OD 平均值≤0.15。臨界值（cut-off）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔OD 平均值+0.15。結(jié)果判定：樣品OD 值＞臨界值，為血清抗體陽(yáng)性，反之為陰性。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)不同地區(qū)和季節(jié)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)

攀西地區(qū)10 個(gè)縣/市羊泰勒蟲(chóng)血清抗體陽(yáng)性率介于52.78%～100%，平均陽(yáng)性率為73.44%（表1），表明該地區(qū)羊泰勒蟲(chóng)病流行較嚴(yán)重。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，10 個(gè)縣/市的羊泰勒蟲(chóng)血清抗體陽(yáng)性率差異顯著（χ2=54.392，P＜0.01），表明該地區(qū)羊泰勒蟲(chóng)病呈現(xiàn)一定的區(qū)域分布特點(diǎn)。

表1 不同縣/市羊泰勒蟲(chóng)病血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同季節(jié)

按不同季節(jié)進(jìn)行分組比較，春季（3月—5月）、夏季（6月—8月）、秋季（9月—11月）、冬季（12月—次年2月）血清抗體陽(yáng)性率介于65.42%～95.24%，其中春季最高、秋季最低（表2）。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，不同季節(jié)血清抗體陽(yáng)性率差異顯著（χ2=38.157，P＜0.01），表明該地區(qū)羊泰勒蟲(chóng)病呈現(xiàn)較明顯的季節(jié)性特征。

3 討論

我國(guó)存在的長(zhǎng)角血蜱（Haemaphysalis longicornis）和青海血蜱（H.qinghaiensis）均能傳播尤氏泰勒蟲(chóng)和呂氏泰勒蟲(chóng)[9]，小亞璃眼蜱（Hyalomma anatolicum anatolicum）可傳播綿羊泰勒蟲(chóng)[10]。我國(guó)大部分地區(qū)均有不同程度地羊泰勒蟲(chóng)病流行，因此羊放牧?xí)r被蜱叮咬而感染的風(fēng)險(xiǎn)較高。攀西地區(qū)林草資源豐富，為蜱的滋生提供了有利的環(huán)境，因而導(dǎo)致該地區(qū)羊泰勒蟲(chóng)病流行率較高。

表2 不同季節(jié)羊泰勒蟲(chóng)病血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

ELISA 是目前應(yīng)用最廣泛的羊泰勒蟲(chóng)病血清學(xué)檢測(cè)方法。目前已建立了幾種基于裂殖子粗抗原和重組抗原的間接ELISA 方法，用于泰勒蟲(chóng)抗體檢測(cè)。Gao等[5]基于泰勒蟲(chóng)裂殖子粗抗原建立的間接ELISA 方法，可檢測(cè)尤氏泰勒蟲(chóng)和呂氏泰勒蟲(chóng)，但與羊巴貝斯蟲(chóng)有交叉反應(yīng)，還存在標(biāo)準(zhǔn)化難、需要感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以獲取制備抗原等缺點(diǎn)。Guo等[11]用裂殖子粗抗原間接ELISA 方法，對(duì)甘肅省甘南藏族自治州7 個(gè)地區(qū)進(jìn)行泰勒蟲(chóng)病流行情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)甘南地區(qū)泰勒蟲(chóng)平均陽(yáng)性率為70.1%，不同地區(qū)陽(yáng)性率介于27.8%～83.3%。Niu等[12]用裂殖子粗抗原間接ELISA 方法，對(duì)采集自遼寧遼陽(yáng)、河北興隆、內(nèi)蒙古通遼、四川秦嶺以及甘肅天祝、甘南等地共1 234 份羊血清進(jìn)行泰勒蟲(chóng)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)總陽(yáng)性率為66.78%（824/1 234），各地陽(yáng)性率介于0～80.9%，其中甘南地區(qū)陽(yáng)性率為71.3%，遼陽(yáng)、興隆、通遼的陽(yáng)性率均為0。

其他檢測(cè)小反芻動(dòng)物泰勒蟲(chóng)病的ELISA 方法均是基于重組表達(dá)抗原建立的。Miranda等[13]用克隆表達(dá)的Theileriasp.（China）熱休克蛋白70（TcHSP70）作為抗原建立的間接ELISA方法雖然與環(huán)形泰勒蟲(chóng)（T.annulata）無(wú)交叉反應(yīng)，但并沒(méi)有用田間樣品進(jìn)行驗(yàn)證。Bakheit等[14]用萊氏泰勒蟲(chóng)裂殖子Clone-5 基因的重組表達(dá)蛋白作為抗原建立了間接ELISA 方法（Clone-5XP2 ELISA），其敏感性和特異性分別為94.6%和88.0%，與分離自我國(guó)的泰勒蟲(chóng)和考德里氏體屬（Cowdriaspp.）無(wú)交叉反應(yīng)。Liu等[15]基于尤氏泰勒蟲(chóng)重組免疫蛋白（rTuIP）建立的間接ELISA 方法的特異性和靈敏性分別為98.44%和97.92%，僅與呂氏泰勒蟲(chóng)有交叉反應(yīng)，與萊氏泰勒蟲(chóng)、巴貝斯蟲(chóng)未定種、羊無(wú)形體無(wú)交叉反應(yīng)。后來(lái)，Liu等[16]用rTuIP-ELISA 方法，對(duì)湖北隨州、貴州貴陽(yáng)以及甘肅天祝和麻當(dāng)?shù)难蛱├障x(chóng)病流行情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率分別為17.8%、11.6%、97.4%、97.0%，認(rèn)為rTuIP-ELISA 方法可作為呂氏泰勒蟲(chóng)和尤氏泰勒蟲(chóng)流行病學(xué)調(diào)查的工具。Abdo等[17]基于尤氏泰勒蟲(chóng)裂殖子cDNA 文庫(kù)的表面蛋白（Clone-9）建立了間接ELISA（rc9b-ELISA）方法，發(fā)現(xiàn)其靈敏性和特異性分別為87.7%和57.1%，與rTuIP-ELISA 的陽(yáng)性符合率為85%。李有全等[18]以呂氏泰勒蟲(chóng)重組表達(dá)表面蛋白（rTlSP）作為抗原建立的間接ELISA 方法與綿羊泰勒蟲(chóng)、尤氏泰勒蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)、東方泰勒蟲(chóng)（T.orientalis）、中華泰勒蟲(chóng)（T.sinensis）有交叉反應(yīng)，但與巴貝斯蟲(chóng)無(wú)交叉反應(yīng)。He等[6]報(bào)道rTlSP-ELISA 方法的特異性和靈敏性分別為97.9%和97.1%，并用該方法對(duì)采集自甘肅省的240 份綿羊血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率（63.75%）高于血涂片鏡檢陽(yáng)性率（46.67%）。Li等[19]用rTlSPELISA 方法，對(duì)采集自吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山東、山西、安徽、浙江、陜西、甘肅、寧夏、青海、新疆、重慶、四川、西藏、湖南、貴州、云南、廣西、廣東等21 個(gè)省區(qū)市的2 351 份羊血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)平均陽(yáng)性率為41.0%（965/2 351），其中甘肅省陽(yáng)性率最高，為76.0%，四川省為18.7%，河北省為0。Li等[20]用rTlSP-ELISA 方法，對(duì)我國(guó)北方牛泰勒蟲(chóng)病成功進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查。

盡管已經(jīng)建立了多種羊泰勒蟲(chóng)病血清學(xué)診斷方法，但血清學(xué)檢測(cè)存在不能區(qū)分耐過(guò)動(dòng)物，不易區(qū)分相近蟲(chóng)種的交叉感染而出現(xiàn)假陽(yáng)性等缺點(diǎn)，目前還沒(méi)有一種血清學(xué)方法能明確、特異地區(qū)分呂氏泰勒蟲(chóng)和尤氏泰勒蟲(chóng)。而與基于DNA 的分子生物學(xué)方法相比，ELISA 具有成本更低、更易操作等優(yōu)點(diǎn)，在大規(guī)模流行病學(xué)研究中具有很高的適用性。

本次檢測(cè)用rTlSP 抗原包被的雙抗原夾心ELISA，對(duì)攀西地區(qū)的羊血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)攀西地區(qū)山羊泰勒蟲(chóng)血清抗體陽(yáng)性率為73.44%，高于青海等地的報(bào)道。李英等[21]用ELISA 方法，對(duì)青海天峻地區(qū)綿羊群進(jìn)行泰勒蟲(chóng)病血清學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)血清抗體陽(yáng)性率為18.68%（17/91）。尕松代吉[22]用ELISA 方法，對(duì)青海玉樹(shù)州羊群進(jìn)行泰勒蟲(chóng)病血清學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)血清抗體陽(yáng)性率為49.74%（382/768）。本次檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，攀西地區(qū)10 個(gè)縣/市的羊泰勒蟲(chóng)血清抗體陽(yáng)性率介于52.78%～100%，地區(qū)差異顯著。這些地區(qū)差異可能與不同地區(qū)蜱的分布以及蜱的泰勒蟲(chóng)攜帶率不同有關(guān)。

本次檢測(cè)結(jié)果與秦思源等[23]對(duì)甘肅省瑪曲不同季節(jié)牦牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)感染結(jié)果基本一致，但與Guo等[11]報(bào)道的甘肅省甘南藏族自治州羊泰勒蟲(chóng)抗體檢測(cè)結(jié)果稍有差異。甘肅甘南藏族自治州羊泰勒蟲(chóng)抗體的血清陽(yáng)性率從3月份開(kāi)始上升，到5月份達(dá)到最高（68.2%），10月份開(kāi)始下降，到次年1月份降至最低（36.4%）。這是因?yàn)椴煌貐^(qū)蜱的活動(dòng)時(shí)間并不一致。攀西地區(qū)春季和夏季陽(yáng)性率高于秋季和冬季，可能與春季和夏季的氣候條件更適合蜱的生存與繁殖有關(guān)。

本次檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，攀西地區(qū)羊泰勒蟲(chóng)血清抗體陽(yáng)性率較高（73.44%）。這提示有關(guān)部門(mén)應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)并采取滅蜱等措施，以控制該病的流行與傳播。本檢測(cè)初步了解了羊泰勒蟲(chóng)病在攀西地區(qū)的分布及流行狀況，但由于采樣時(shí)間和采樣數(shù)量的局限，檢測(cè)結(jié)果并不能全面真實(shí)反映該病的流行與分布情況，但可以為該病的防制提供一定的參考。

4 結(jié)論

檢測(cè)表明，攀西地區(qū)羊泰勒蟲(chóng)病流行較為嚴(yán)重，且呈現(xiàn)明顯的地區(qū)和季節(jié)性暴發(fā)特點(diǎn)，因此在高發(fā)地區(qū)和高發(fā)季節(jié)，應(yīng)采取監(jiān)測(cè)和滅蜱等措施來(lái)控制該病流行。