水生動物冠狀病毒研究進展

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

2019 年12月，湖北省武漢市首次發(fā)生新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）疫情。研究證實該病是由β 冠狀病毒屬的人新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS?CoV?2）感染引起的一種急性呼吸道傳染病[1]。冠狀病毒屬于套式病毒目（Nidovirales）、冠狀病毒亞目（Cornidovirineae）、冠狀病毒科（Coronaviridae）。2019 年國際病毒學分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）將冠狀病毒科分為正冠狀病毒亞科（Orthocoronavirinae）和Letovirinae病毒亞科。其中正冠狀病毒亞科包括α、β、γ 和δ 4 個屬，而Letovirinae病毒亞科僅包括1 個屬（Alphaletovirus屬）[2-3]。

據WHO 官方數據，截至2020 年7月9 日，全球COVID-19 確診人數已超過1 000 萬。我國通過隔離等多種綜合防控措施，使疫情得到有效控制。然而從2020 年6月11 日以來，北京市連續(xù)出現COVID-19 確診病例。相關部門通過流行病學調查，從北京新發(fā)地批發(fā)市場某切割進口三文魚的案板上檢測到SARS-CoV-2 核酸。隨后，全球三文魚產業(yè)鏈乃至其他水產品產業(yè)都遭到了嚴重沖擊。至今為止，水生動物冠狀病毒的報道相對較少，目前已知的水生動物冠狀病毒屬于γ 冠狀病毒屬和Alphaletovirus屬，而SARS-CoV-2 為β 冠狀病毒屬的成員。已有的研究表明，魚類感染SARSCoV-2 的概率相對較低，因此從該市場的環(huán)境中檢出大量SARS-CoV-2 表明三文魚被人為污染的可能性較大。為了進一步明晰對水生動物感染冠狀病毒的認知，本文系統(tǒng)論述了水生動物冠狀病毒感染狀況，并對SARS-CoV-2 與水生動物冠狀病毒之間的遺傳關系進行了分析，以期為SARS-CoV-2 科學防控提供參考信息。

1 水生動物感染的冠狀病毒

水生動物冠狀病毒的相關報道較少，可能一方面水生動物本身對冠狀病毒不易感，也有可能與水生動物體內病原難于分離培養(yǎng)有關。截至目前，絕大多數水生動物冠狀病毒的鑒定都是通過宏基因組測序等進行冠狀病毒核酸檢測。先后在白鯨（Delphinapterus leucas）[4]、寬吻海豚（Tursiops truncatus）[5]等水生哺乳動物，以及鮭科魚的三文魚（Oncorhynchus keta）[6]中檢測到不同種類的冠狀病毒核酸。此外，在鯉科魚中也有檢測到疑似感染冠狀病毒的報道[7-8]，但由于沒有明確的形態(tài)學報告以及病毒基因序列等關鍵信息，所以并未被ICTV 所認可。水生動物中檢測到的冠狀病毒及其分類地位分別見表1 和圖1。

1.1 白鯨冠狀病毒（beluga whale coronavirus，BWCoV）

2008 年首次公布了一株海洋哺乳動物冠狀病毒白鯨冠狀病毒SW1（BWCoV SW1）的全基因組序列[4]。一頭人工飼養(yǎng)的白鯨在患上肺臟疾病后不久死于急性肝功能衰竭。肝組織電鏡檢查結果顯示，肝細胞內存在大量的圓形病毒顆粒。病毒粒子大小（直徑60～80 nm，核心45～50 nm）與已知冠狀病毒明顯不同。該病毒具有宿主特異性，無法用非同源細胞系分離病毒。病毒基因組遺傳進化分析顯示，該病毒與禽冠狀病毒親緣關系較近。盡管其復制酶基因同源性（＜67%）明顯低于物種劃分的臨界值（90%），但SW1 仍被劃分為γ 冠狀病毒屬[10]。目前僅檢測到BWCoV SW1 的核酸，該病毒對水生動物的致病性仍需進一步研究。

表1 水生動物冠狀病毒

圖1 冠狀病毒基因組遺傳進化分析樹

1.2 寬吻海豚冠狀病毒（bottlenose dolphin coronavirus，BdCoV）

2008—2010 年中國香港從3 只表面健康的印度太平洋寬吻海豚糞便樣品中檢測到一種新型的冠狀病毒核酸，命名為HKU22[5]。與白鯨分離株SW1 不同，HKU22 沒有引發(fā)任何明顯的臨床癥狀，寬吻海豚僅為無癥狀或輕度感染。感染期檢測到病毒基因組，在感染后4～8 周的血清樣本中檢測到N 蛋白特異性抗體。3 只寬吻海豚體內檢測到的病毒基因組基本相同，均屬于γ 冠狀病毒屬。病毒無法在非宿主特異性細胞系中復制，而且目前也沒有病原體超微結構的信息。遺傳進化分析顯示，BdCoV HKU22 與BWCoV SW1 具有類似的基因組特性，基因組大小約為31.7 kb，同源性極高。兩種病毒的N 蛋白基因和復制酶多蛋白保守區(qū)同源性為99.3%～99.6%，與禽冠狀病毒同源性較低（35.4%～74.9%）。兩種病毒的主要區(qū)別為纖突蛋白S，僅有74.3%～74.7%的氨基酸同源性[5]?；蚪M分析顯示，BdCoV HKU22 和BWCoV 屬于γ 冠狀病毒屬的不同分支（圖1）。兩種病毒的宿主都屬于鯨目，這一發(fā)現也與其宿主之間的親緣關系一致。因此，Woo[5]等建議將BWCoV 和BdCoV 列為γ 冠狀病毒屬中一個單獨的病毒種——鯨類動物冠狀病毒。

1.3 太平洋鮭套式病毒（pacific salmon nidovirus，PsNV）

2019 年，Mordecai[6]等利用宏轉錄組測序技術，從三文魚（包括野生，孵化和養(yǎng)殖）體內首次發(fā)現了一種PsNV 。該病毒在孵化場、水產養(yǎng)殖和野生的大鱗大麻哈魚上都能檢測到，其主要分布在三文魚的鰓組織中。PsNV 在進化上與呼吸系統(tǒng)冠狀病毒相關，與冠狀病毒科、Letovirinae病毒亞科Alphaletovirus屬的姬蛙甲型勒托病毒一型（Microhyla letovirus1，MLeV）的同源性最高，其單獨形成一個分支，與正冠狀病毒亞科形成姐妹群（圖1）。PsNV 病毒基因組長約36.7 kb，編碼非結構蛋白（復制酶，ORF 1a 和1b）和結構蛋白（LAB1C-like、S、E、M 和N），兩端具有非編碼區(qū)。PsNV 基因組結構比正冠狀病毒亞科病毒多出LAB1C-like 蛋白，其具體功能有待進一步研究。基因組進化分析結果顯示，PsNV 與MLeV 雖然屬于同一個分支，但它們之間較長的分支長度、較遠的遺傳距離表明可能屬于不同的屬。

1.4 麻斑海豹冠狀病毒

1987 年，邁阿密水族館飼養(yǎng)的3 只海豹突發(fā)急性壞死性腸炎[9]，其中2 只海豹死亡前未表現出任何臨床癥狀，另外1 只海豹出現白細胞顯著增多、脫水、高鈉血癥和高氯血癥。病理切片顯示，局灶性支氣管肺泡出血和水腫，以及嚴重的彌散性肺淤血。脾臟和外周淋巴結出現中度至重度淋巴細胞減少，腸黏膜檢測到冠狀病毒特異性抗原。用豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、貓傳染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus，FIPV） 和犬冠狀病毒（canine coronavirus，CCoV）抗體進行免疫熒光檢測均為陽性，但用牛冠狀病毒抗體檢測結果為陰性。根據抗原交叉反應結果，感染麻斑海豹的冠狀病毒很可能屬于α 冠狀病毒屬。由于此麻斑海豹冠狀病毒RdRp基因序列較短（208 bp），未有基因組信息，所以還未被ICTV 正式認可，仍需進一步研究證實。

1.5 未確認的其他水生動物冠狀病毒

1997—1998 年，一種冠狀病毒樣病毒（被命名為鯉魚病毒血癥相關的ana-aki-byo 病毒）引起錦鯉（Cyprinus carpio，C.carpio）較高的死亡率[7]。病死魚內臟器官可見壞死病變，造血組織及脾臟可見病毒顆粒。病毒呈圓形，表面呈尖狀突起，直徑100～180 nm。在感染細胞的細胞質中觀察到不同長度的管狀結構（直徑60～70 nm）和晶體包裹體。Sano等[8]從一種死于急性感染的鯉魚身上分離出一種冠狀病毒樣病毒，病死魚臨床表現為腹部紅斑，肝、腎壞死。該病毒通過20 °C 的水傳播給鯉魚苗。從鯉魚腎臟、肝臟和脾臟中可分離出該病原，被包裹的粒子直徑為60～100 nm。牙鲆、鰻鱺等魚類中也有疑似感染冠狀病毒的報道[11]。從超微結構和形態(tài)發(fā)生的角度來看，這些病毒與冠狀病毒相似。但值得注意的是，這些分離物不符合分類學分類標準（缺少基因組和/或形態(tài)學數據），因此沒有被正式確認為冠狀病毒，相關的分類鑒定、流行病學及病毒生態(tài)學等還有待深入研究。

2 水生動物冠狀病毒與SARS-CoV-2 的遺傳關系

自2020 年6月12 日，相關部門在北京新發(fā)地批發(fā)市場從切割進口三文魚的案板檢測到SARS?CoV?2 核酸以來，三文魚以及水生動物冠狀病毒與SARS-CoV-2 的關系成為公眾關注的焦點。將BWCoV、BdCoV、PsNV、SARS-CoV-2（武漢分離株SARS-CoV-2/Wuhan-Hu-1/2019 和北京新發(fā)地分離株hCoV-19/Beijing/IVDC-01-06/2020、hCoV-19/Beijing/IVDC-03-06/2020），以 及 從GenBank 和GISAID 數據庫篩選的55 株α、β、γ、δ 冠狀病毒屬和Alphaletovirus屬中具有代表性的冠狀病毒基因組及各ORF 序列進行同源性比對，并利用MEGA 6.0 軟件，采用NJ（Neighbor-Joining）方法構建系統(tǒng)進化樹。遺傳進化分析結果顯示，SARS?CoV?2 武漢分離株SARS-CoV-2/Wuhan-Hu-1/2019 以及北京新發(fā)地分離株hCoV-19/Beijing/IVDC-01-06/2020、hCoV-19/Beijing/IVDC-02-06/2020 和hCoV-19/Beijing/IVDC-03-06/2020 都屬于β 冠狀病毒屬，但二者基因組序列存在一定差異?；蚪M學研究顯示，北京新發(fā)地分離株與歐洲早期分離株同源性較高，可能與輸入性有關。感染水生哺乳動物的BWCoV 與BdCoV 都屬于γ 冠狀病毒屬，感染三文魚的PsNV 屬于Letovirinae病毒亞科Alphaletovirus屬（圖1），說明已知水生動物冠狀病毒與SARS?CoV?2 之間遺傳關系較遠。

基因組同源性分析結果顯示，SARS?CoV?2武漢分離株SARS-CoV-2/Wuhan-Hu-1/2019 以及SARS?CoV?2 北京新發(fā)地分離株hCoV-19/Beijing/IVDC-01-06/2020（三株病毒基因組同源在99.9%以上）與γ 冠狀病毒屬的BWCoV 基因組同源性為52.3%，與BdCoV HKU22 基因組同源性為51.9%，與Alphaletovirus屬的PsNV 基因組同源性最低，為47.9%（表2）。SARS-CoV-2 武漢分離株SARS-CoV-2/Wuhan-Hu-1/2019 以及北京新發(fā)地分離株hCoV-19/Beijing/IVDC-01-06/2020 的主要基因（1ab、S、E、M、N）均與水生動物冠狀病毒的主要基因同源性較低，僅為43.7%～54.1%，其中與PsNV 的同源性最低。

基于病毒基因組和各主要基因的遺傳進化分析與同源性分析，可初步排除SARS?CoV?2 來源于已知水生動物冠狀病毒的可能性。遺傳進化分析顯示（圖1），SARS-CoV-2 屬于冠狀病毒科β 冠狀病毒屬。而相關研究表明，β 冠狀病毒屬只感染哺乳動物，且SARS-CoV-2 主要作用于上呼吸道和下呼吸道，其病理影響主要集中于肺部。但除肺魚以外的其他魚類沒有肺，因此不易感染該病毒[12]。SARS-CoV-2 的受體為血管緊張素轉化酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）。從受體分布來看，除哺乳動物之外，SARS-CoV-2 很難感染魚類、鳥類和爬行類動物[13]。繼北京新發(fā)地批發(fā)市場從三文魚案板檢測到SARS-CoV-2 核酸以來，陸續(xù)從該市場的牛羊肉大廳環(huán)境樣品中也檢測到SARS-CoV-2 核酸，說明三文魚感染SARSCoV-2 的可能性較低，而通過人員或者物品污染的可能性較大。水生動物及其產品可能會通過人員或者物品污染SARS-CoV-2，尤其是被SARS-CoV-2感染者接觸后，此外如果環(huán)境中存在大量病毒也可通過氣溶膠等方式污染。冠狀病毒在外環(huán)境中的存活時間可能從數小時到數天不等。雖然目前尚未有SARS-CoV-2 在水產品表面存活時間的具體數據，但由于冠狀病毒不耐熱，無法在正常烹飪溫度（大于70 ℃）下存活。因此在做好個人防護的前提下，對于在符合衛(wèi)生標準和食品安全條件下制作、供應的水生動物及其產品，可以安全食用。

表2 人新型冠狀病毒 SARS-CoV-2/Wuhan-Hu-1/2019、hCoV-19/Beijing/IVDC-01-06/2020 與水生動物冠狀病毒的同源性%

3 結語

冠狀病毒種類繁多，并具有宿主多樣性，人和多種動物均可感染。冠狀病毒也可感染白鯨、寬吻海豚等海洋哺乳動物以及鮭科魚、鯉科魚等，并對水生動物健康繁殖造成一定影響。隨著各種生物技術的發(fā)展與應用，對水生動物冠狀病毒的認識也將有進一步的提升。進一步了解和研究病毒的流行、分布和傳播機制，以及其宿主特性和相關生態(tài)因素，將有助于對水生動物冠狀病毒的監(jiān)測、控制和傳播風險評估。