山東省東營市奶牛乳腺炎致病菌的分離鑒定及藥敏試驗

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

奶牛乳腺炎是奶牛最常發(fā)生的疾病，給世界各國奶牛產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。據(jù)報道[1]，引起奶牛乳腺炎的病原微生物有150 多種，其中以細菌為主。而細菌感染情況與地域、飼養(yǎng)環(huán)境及使用藥物等因素有關(guān)。因此，準確掌握引發(fā)本地區(qū)奶牛乳腺炎主要致病菌的種類和耐藥性，避免盲目用藥，是防治該地區(qū)奶牛乳腺炎的關(guān)鍵。

近年來，東營市奶牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但尚未有該地區(qū)奶牛乳腺炎病原學(xué)的調(diào)查和研究報道。因此，本研究對東營市奶牛乳腺炎主要致病菌進行分離鑒定及耐藥性檢測，以期對該地區(qū)選擇有效藥物防治奶牛乳腺炎提供參考。

1 試驗材料

1.1 培養(yǎng)基

普通營養(yǎng)瓊脂、改良艾德華瓊脂、S-S 瓊脂、麥康凱瓊脂等培養(yǎng)基和生化鑒定微量發(fā)酵管，杭州濱和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。營養(yǎng)肉湯、綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，按照陳天壽[2]提供的方法自行制備。

1.2 藥敏紙片

制備頭孢洛寧、頭孢噻呋、頭孢喹肟、芐星氯唑西林、慶大霉素、利福昔明等12 種藥敏紙片的原材料，參照胡桂學(xué)[3]、丁伯良等[4]提供的方法自行制備。金黃色葡萄球菌（ATCC25923）和大腸桿菌（ATCC25922），均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 診斷試劑

LMT 乳腺炎診斷試劑，購自蘭州畜牧與獸藥研究所。

2 試驗方法

2.1 奶樣采集

從東營市的5 個奶牛場，參照李曉楠等[5]的方法，選取臨床型乳腺炎和隱性型乳腺炎各50 例，在臨床型乳腺炎乳區(qū)和隱性型乳腺炎陽性乳區(qū)，參照阮智楊等[6]的方法，無菌操作，采集奶樣100 份，標(biāo)記后置4 ℃冰箱冷藏保存。

2.2 病原菌分離培養(yǎng)

參照薛梅等[7]的方法，將處理好的奶樣接種于普通營養(yǎng)瓊脂和綿羊血瓊脂平板，觀察菌落形態(tài)特征，并進行革蘭氏染色鏡檢。將符合鏈球菌、葡萄球菌、革蘭氏陰性桿菌形態(tài)特征的菌株分別接種于改良愛德華瓊脂、綿羊血瓊脂、麥康凱瓊脂和S-S 瓊脂培養(yǎng)基。根據(jù)菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色特性以及鏡下的細菌形態(tài)、大小和排列方式，初步判定分離細菌種類，純化培養(yǎng)后保存。

2.3 細菌生化鑒定

參照薛梅等[7]、孔憲剛等[8]提供的方法，將分離純化的細菌進行生化鑒定，確定奶樣分離細菌的種類。

2.4 藥敏試驗

參照丁伯良等[4]提供的方法進行紙片擴散法藥敏試驗，并根據(jù)周婷婷等[9]提供的判定標(biāo)準，判定抗菌藥物敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）。

3 結(jié)果與分析

3.1 細菌分離鑒定

奶樣細菌分離鑒定結(jié)果（表1）顯示：100份乳腺炎奶樣中，有83 份檢出細菌，檢出率為83.0%，其中臨床型乳腺炎奶樣細菌檢出率為86.0%（43/50），隱性型乳腺炎奶樣細菌檢出率為80.0%（40/50）；單純感染48 份、混合感染35 份；共分離到132 株細菌，其中無乳鏈球菌占27.27%（36/132）、金黃色葡萄球菌占26.52%（35/132）、大腸桿菌占15.15%（20/132）、停乳鏈球菌占12.12%（16/132），表明它們是東營市奶牛乳腺炎的主要致病菌。

3.2 藥敏試驗

107株主要致病菌的藥敏試驗結(jié)果（表2）顯示：對引起東營市奶牛乳腺炎主要致病菌敏感率高的藥物依次是頭孢喹肟80.37%（86/107）、頭孢洛寧74.77%（80/107）、頭孢噻呋71.96%（77/107）和氟苯尼考67.29%（72/107），耐藥率高的依次是四環(huán)素61.68%（66/107）、慶大霉素60.75%（65/107）和頭孢氨芐46.73%（50/107）。

表1 100 份乳腺炎奶樣的細菌分離鑒定結(jié)果

4 討論

對東營市5 個奶牛場乳腺炎奶樣進行主要致病菌分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)細菌檢出率較高（83.0%），說明致病菌是東營市奶牛乳腺炎的主要致病因素。本研究結(jié)果高于張青青等[10]報道的該地區(qū)乳腺炎奶樣的細菌檢出率，這可能與奶樣采集季節(jié)、奶樣采集牛場飼養(yǎng)管理水平不同有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和停乳鏈球菌是引起東營市奶牛乳腺炎的主要致病菌（81.1%）。這與張傳美等[11]、薛梅等[7]、張月[12]、李振等[13]報道的山東膠東地區(qū)、濰坊市、濰坊市臨朐縣、臨沂市的奶牛乳腺炎主要致病菌差別不大，與阮智楊等[6]、葛影影等[14]、姚偉等[15]報道的安徽省、河南省、遼寧省奶牛乳腺炎主要致病菌差別較大，說明奶牛乳腺炎主要致病菌有地區(qū)（省）差異。

本研究未進行奶牛乳腺炎奶樣中的支原體分離鑒定。但據(jù)有關(guān)報道，支原體也是引起奶牛乳腺炎的重要病原之一。張建華等[16]報道，我國大部分奶牛場存在牛支原體感染，牛支原體感染可能成為危害我國奶牛業(yè)的主要疫病。牛支原體不僅能夠通過機械傳播，從乳腺管侵入乳房導(dǎo)致乳腺炎，還可以突破血乳屏障，從呼吸道及生殖道侵入導(dǎo)致乳腺炎[17]。由于支原體較普通細菌難以分離鑒定，國內(nèi)關(guān)于牛支原體引起奶牛乳腺炎的研究較少，本團隊將加強對該病原的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，對引起東營市奶牛乳腺炎主要致病菌敏感率高的藥物依次是頭孢喹肟、頭孢洛寧、頭孢噻呋和氟苯尼考，耐藥率高的依次是四環(huán)素、慶大霉素和頭孢氨芐。這與張傳美等[11]、張月[12]、李振等[13]報道的山東省各地區(qū)的藥敏試驗結(jié)果不同，與阮智楊等[6]、葛影影[14]、姚偉等[15]報道的其他省份相同致病菌的藥敏試驗結(jié)果也不同。抗生素是最常用于防治奶牛乳腺炎的藥物，奶牛場

長期應(yīng)用特別是長期濫用抗生素，會導(dǎo)致抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)[18]，造成以前常用抗生素（四環(huán)素、慶大霉素、頭孢氨芐）耐藥率高，而應(yīng)用時間短的藥物（頭孢喹肟、頭孢洛寧、頭孢噻呋、氟苯尼考）則相對敏感。因此，在防治奶牛乳腺炎時，最好通過藥敏試驗選擇藥物。

表2 東營市奶牛乳腺炎主要致病菌藥敏試驗結(jié)果