布魯氏菌S2 疫苗陰道途徑免疫羊的安全性初步研究

韓 燾，畢一鳴，穆佳毅，彭小薇，蔣 卉，馮 宇，于廣秋，郭富存，左海莉，王傳彬，董 浩

（1.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 102618；3.建昌縣畜牧獸醫(yī)局，遼寧建昌 125300；4.包頭市九原區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古包頭 014060）

布魯氏菌?。ê喎Q布?。┦且环N由感染布魯氏菌引起的危害嚴重的人獸共患病。布魯氏菌主要侵害患病動物的生殖系統(tǒng)，以母畜流產(chǎn)和公畜睪丸炎為主要特征。人感染布魯氏菌后，主要表現(xiàn)發(fā)熱、乏力、流產(chǎn)、睪丸炎等，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，甚至喪失勞動能力和生育能力[1]。

布病在全球廣泛流行，每年人間新發(fā)布病病例數(shù)超過50 萬[2]。而世界衛(wèi)生組織（WHO）指出，真實的人間發(fā)病率應(yīng)為報告數(shù)字的10～25 倍[3-4]。目前，我國人間和畜間布病流行形勢不容樂觀。中國疾病預(yù)防控制中心公布的2019 年法定傳染病報告顯示，2019 年共新增人間布病病例44 036 例，病例數(shù)仍處于歷史高位。2013—2017 年，國家動物布病參考實驗室從有流產(chǎn)癥狀的布病非免疫牛場采集23 381 份血清樣本進行布魯氏菌血清抗體檢測，發(fā)現(xiàn)平均個體陽性率高達44.2%[5]。

在布病流行率較高地區(qū)，使用疫苗免疫被證明是一種經(jīng)濟、有效的家畜布病控制方法。我國目前使用的布魯氏菌疫苗主要有A19、M5（M5-90）和S2 三種。在早期研究中，遼寧省建昌縣探索出一種S2 疫苗陰道噴灌的新型免疫技術(shù)。通過使用此技術(shù)，該縣的羊流產(chǎn)率和每年新增人布病病例數(shù)大幅下降[6]。但早期研究僅對S2 疫苗陰道噴灌免疫的抗體消長規(guī)律等進行了相關(guān)研究，缺乏該免疫技術(shù)對免疫動物安全性的相關(guān)研究[7-9]。本研究使用S2 疫苗陰道噴灌方式免疫3 只母羊，免疫1 個月后測定免疫母羊的抗體滴度、體內(nèi)不同臟器的含菌量，觀察肝臟和脾臟的病理變化，初步評價這種免疫技術(shù)的安全性。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本

臨床組織樣品采自遼寧省某羊場的3 只布魯氏菌S2 疫苗株陰道免疫1 個月的山羊（陰道免疫劑量為1×1010CFU/只）和同群的3 只未免疫布魯氏菌S2 疫苗株的山羊（陰性對照）。采集6 只山羊的血清樣品，用于抗體水平測定；采集6 只山羊的心、肝、脾、肺、腎、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和頜下淋巴結(jié)樣品各1 份并做好標記，由國家動物布魯氏菌病參考實驗室經(jīng)組織勻漿后進行疫苗菌株的分離和核酸提??；采集6 只山羊的肝臟和脾臟樣品浸于裝滿4%多聚甲醛的50 mL 離心管中進行固定。

1.2 主要試劑與儀器

布魯氏菌活疫苗（S2 株），購自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司；布魯氏菌虎紅平板凝集試驗抗原、試管凝集試驗抗原，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家動物布魯氏菌病參考實驗室；4%多聚甲醛固定液，購自碧云天生物技術(shù)有限公司；QIAamp DNA Mini Kit，購自Qiagen 公司；GoTaq?Probe qPCR Master Mix，購自Promega公司；熒光定量PCR 所有引物探針，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

Qiagen tissue lyser II 組織研磨儀，購自QIAGEN 公司；Gentier 96E 全自動醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)，購自西安天隆科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，購自蘇州威爾實驗用品有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 免疫抗體檢測 對陰道免疫S2 疫苗株1個月的3 只山羊和同群未免疫山羊進行采血和血清分離，采用虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗檢測所有山羊的抗體水平。試驗操作按照GB/T18646—2018 進行。

1.3.2 細菌分離 將無菌采集的6 只羊的組織臟器，剪取小塊后放入2 mL 離心管中，加入1 mL 無菌的PBS 緩沖液和鋼珠，使用Qiagen tissue lyser ii組織研磨儀將組織研碎；分別取200 μL 勻漿液涂布于選擇培養(yǎng)基上，置于普通培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)10 d。具體操作步驟和選擇培養(yǎng)基的配置方式參照GB/T 18646—2018。所有羊組織臟器的細菌分離試驗均在中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生物安全三級實驗室開展。

1.3.3 組織樣品核酸提取 使用QIAamp DNA Mini Kit，對200 μL 各種組織樣品的勻漿液，按照試劑盒說明書提取核酸。

1.3.4 熒光定量PCR 方法 使用熒光定量PCR方法，檢測提取的布魯氏菌核酸。布魯氏菌熒光定量PCR 方法，參考相關(guān)文獻中發(fā)表的基于IS711序列的檢測方法[10]。使用Gentier 96E 全自動醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)進行熒光定量PCR 擴增。上游引物序列為5'-cgctcgcgcggtggat-3'，下游引物序列為5'-cttgaagcttgcggacagtcacc-3'，探針序列為5'-FAMacgaccaagctgcatgctgttgtcgatg-BHQ1-3'。熒光定量PCR 的反應(yīng)體系為：GoTaq?Probe qPCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L 的上下游引物各0.6 μL，10μmol/L 的探針0.6 μL，DNA 模板2 μL，加入無核酸酶的水補齊20 μL。擴增程序為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60℃ 1 min，40 個循環(huán)。每個循環(huán)第2 步，60 ℃ 1 min，收集熒光信號。

1.3.5 病理學(xué)分析 組織包埋切片、切片HE 染色和病理學(xué)分析，由武漢賽維爾生物科技有限公司完成。

1.3.5.1 固定組織切割 將組織從固定液中取出，在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)刀切割，組織厚度為3 mm 左右。將修切好的組織和對應(yīng)的標簽放于脫水盒內(nèi)。

1.3.5.2 組織脫水 將脫水盒放進吊籃于脫水機內(nèi)依次梯度脫水：75%酒精4 h-85%酒精2 h-90%酒精2 h-95%酒精1 h-無水乙醇I 30 min-無水乙醇II 30 min-醇苯5～10 min-二甲苯I 5～10 min-二甲苯II 5～10 min-蠟I 1 h-蠟II 1 h-蠟III 1 h。若不同組織的脫水程序不同，還應(yīng)詳細注明。

1.3.5.3 組織石蠟包埋 將浸好蠟的組織于包埋機內(nèi)進行包埋。先將融化的蠟放入包埋框，待蠟?zāi)讨?，將組織從脫水盒內(nèi)取出放入包埋框并貼上對應(yīng)的標簽。包埋好的蠟塊置于-20 ℃凍臺上冷卻；蠟?zāi)毯?，將蠟塊從包埋框中取出并修整。

1.3.5.4 石蠟切片 將修整好的蠟塊置于石蠟切片機上切片，片厚為4 μm。切片漂浮于攤片機40 ℃溫水上時，將組織展平，用載玻片將組織撈起，并放進60 ℃烘箱內(nèi)烤片；待水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.5 石蠟切片脫蠟至水 依次將石蠟切片放入二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-無水乙醇Ⅰ10 min-無水乙醇Ⅱ10 min-95% 酒精5 min-90%酒精5 min-80%酒精5 min-70%酒精5 min-蒸餾水洗。

1.3.5.6 蘇木素染細胞核 切片入Harris 蘇木素染3～8 min，自來水洗；1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗；0.6%氨水返藍，流水沖洗。

1.3.5.7 伊紅染細胞質(zhì) 切片入伊紅染液中染色1～3min。

1.3.5.8 切片脫水封片 將切片依次放入95%酒精I 5 min-95%酒精II 5 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。

1.3.5.9 染色后切片鏡檢 將染色封固后的切片至于正置白光顯微鏡下鏡檢染色質(zhì)量，以細胞核藍色，細胞漿紅色，紅色與藍色對比清晰作為染色合格標準。

1.3.5.10 成像以及病理分析 使用正置光學(xué)顯微鏡或切片掃描儀數(shù)字掃描成像后觀察，描述其主要病理改變，拍攝或截取對應(yīng)描述中不同的典型病變部位并用不同顏色箭頭標識。

2 結(jié)果

2.1 免疫抗體檢測

虎紅平板凝集試驗結(jié)果顯示，3 只免疫山羊的血清均為陽性；試管凝集試驗結(jié)果顯示，3 只免疫山羊的血清均在1:100 稀釋時出現(xiàn)50%凝集。同群飼養(yǎng)的3 只未免疫的山羊虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗均為陰性。

2.2 細菌分離

3 只免疫山羊和同群3 只未免疫山羊的心、肝、脾、肺、腎、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和頜下淋巴結(jié)樣品，經(jīng)37 ℃溫箱培養(yǎng)10 d，均未分離到布魯氏菌。

2.3 核酸檢測

3 只免疫羊的各組織中，均能檢測到布魯氏菌核酸（表1），而同群飼養(yǎng)的3 只未免疫羊均未檢測到布魯氏菌核酸。

表1 3 只免疫羊組織中布魯氏菌核酸的熒光定量PCR 檢測結(jié)果（Ct 值）

2.4 組織病理檢測

對免疫組和對照組的6 只羊進行剖檢，可見免疫組3 只羊的肝臟和脾臟與對照組相比，均未發(fā)生明顯腫大。進一步采集免疫組和對照組羊只的脾臟樣品和肝臟樣品進行組織病理檢測發(fā)現(xiàn)：免疫組羊的脾臟組織（圖1-A 和1-B）中廣泛可見肝細胞輕度水腫、胞質(zhì)疏松淡染（黑色箭頭），局部匯管區(qū)膽管周圍可見較多淋巴細胞灶性浸潤（黃色箭頭），局部匯管區(qū)周圍可見少量結(jié)締組織增生（紅色箭頭）；對照組羊的脾臟（圖1-C 和1-D）紅髓白髓分界清晰，脾小結(jié)形狀規(guī)則，淋巴細胞數(shù)量豐富、排列緊密，紅髓中可見較多中性粒細胞浸潤（黑色箭頭）。

肝臟的病理檢測結(jié)果顯示：免疫組羊的肝臟組織（圖2-A 和2-B）中廣泛可見肝細胞輕度水腫，胞質(zhì)疏松淡染（黑色箭頭），局部匯管區(qū)膽管周圍可見較多淋巴細胞灶性浸潤（黃色箭頭），局部匯管區(qū)周圍可見少量結(jié)締組織增生（紅色箭頭）。對照組羊的肝臟組織（圖2-C 和2-D）中廣泛可見肝細胞水腫，胞質(zhì)疏松淡染（黑色箭頭）；局部匯管區(qū)膽管周圍可見較多淋巴細胞灶性浸潤（黃色箭頭）；局部膽管內(nèi)可見較多脫落的上皮細胞（紅色箭頭）。

圖1 免疫組和對照組羊只的脾臟病理檢測結(jié)果（20×）

圖2 免疫組和對照組羊只的肝臟病理檢測結(jié)果（20×）

3 討論

S2 疫苗是我國目前應(yīng)用最為廣泛的家畜布魯氏菌疫苗。該疫苗于1952 年由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所篩選自然弱毒株研制而成。20 世紀70 年代，該疫苗的廣泛使用有效控制了我國家畜布病疫情的流行。該疫苗主要通過口服、皮下或肌肉注射方式接種。口服免疫雖然使用較為廣泛，但抗體陽轉(zhuǎn)率低；皮下或肌肉注射雖然陽轉(zhuǎn)率高，但會造成懷孕動物流產(chǎn)。遼寧省建昌縣經(jīng)過多年臨床實踐，建立了陰道途徑免疫技術(shù)。該技術(shù)既可以激發(fā)較高的抗體陽轉(zhuǎn)率，又不會造成懷孕動物流產(chǎn)[6]。早期研究主要針對動物陰道免疫的抗體消長規(guī)律，而未知該途徑免疫動物的體內(nèi)細菌持續(xù)時間、主要臟器病理變化等問題。因此，本研究對上述問題進行了初步研究。

對3 只山羊經(jīng)陰道免疫1 個月后進行撲殺采樣檢測，發(fā)現(xiàn)3 只羊都發(fā)生了抗體陽轉(zhuǎn)，而在其所有臟器中均未分離到布魯氏菌，說明該疫苗株毒力較弱，侵入動物機體后能很快被宿主清除。國家動物布魯氏菌病參考實驗室關(guān)于S2 疫苗株毒力評價的研究結(jié)果顯示，S2 疫苗株在小鼠和豚鼠動物感染模型的平均持續(xù)時間小于4 周[11-12]，這與本研究的羊體內(nèi)細菌分離結(jié)果吻合。同時，本研究的這一結(jié)果也證明了《國家布魯氏菌病防治計劃（2016—2020 年）》中“一類地區(qū)免疫牛羊，在免疫45 d后可以憑產(chǎn)地檢疫證明在一類地區(qū)跨省流通”的移動控制要求是具有科學(xué)性的。

與細菌分離的全陰性結(jié)果相比，3 只免疫羊的大部分組織臟器中都呈現(xiàn)布魯氏菌核酸陽性。這一結(jié)果一定程度上說明了熒光定量PCR 的敏感性高于細菌分離，但也暴露出分子生物學(xué)檢測方法的弊端，即無法確定樣品中的細菌是否存活。

免疫組3 只羊免疫后均未引起肝臟和脾臟腫大，且免疫組羊的肝臟和脾臟均未出現(xiàn)炎性壞死和特征性肉芽腫等布魯氏菌病感染相關(guān)的病理變化[13]，說明該免疫技術(shù)對羊是安全的，不會對免疫羊造成明顯的病理損傷。同時，在免疫過程中，通過做好生物安全防護和在免疫前后場地的充分消毒，可以極大降低疫苗株感染接種人員的風(fēng)險。