基于網絡藥理學研究白及治療肺癌的潛在靶標及作用機制＊

敖卓君，張云帆，洪佳娜，肖 雪，李莎莎，嚴詩楷，3

（1. 廣東藥科大學中醫(yī)藥研究院 廣州 510006；2. 廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院 廣州 510006；3. 上海交通大學藥學院 上海 200240）

白及又名白芨，為蘭科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.的干燥塊莖，其性味苦、甘、澀，微寒，入肺經。具有補肺，止血，消腫，生肌，斂瘡的功效，主治肺傷咳血，衄血，金瘡出血，潰瘍疼痛等疾病[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，白及具有抗菌、止血、抗腫瘤、抗?jié)儭⒖估w維化、促進傷口愈合等藥理活性，臨床常用于治療咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、婦科肌瘤、腫瘤栓塞等病癥[2]。白及素有“血家圣藥、肺科良藥”的美稱，為中醫(yī)臨床治療肺部疾病的首選要藥[3]。

肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[4]，包括非小細胞癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞癌（small cell lung cancer，SCLC），前者發(fā)病率高達80%且呈逐年升高趨勢[5,6]。目前的治療方法仍以單一或聯(lián)合化療、靶向治療等手段為主?；熆梢詺珞w內癌細胞,也可以殺滅體內正常細胞，如骨髓細胞、頭發(fā)毛囊細胞，副作用極大。而靶向治療專門打擊特異性的腫瘤細胞，副作用大大減少，但仍可出現(xiàn)皮疹、惡心、嘔吐、腹瀉、用藥后的疲憊感等副作用。中醫(yī)藥在腫瘤多靶點綜合治療中具有獨特的療效優(yōu)勢，且副作用小，已被聯(lián)合用于晚期癌癥二、三線化療后患者的治療[7]。臨床上白及常與白花蛇舌草、半枝蓮等中藥配合用于抗肺癌治療中[8]，具有良好的應用前景?，F(xiàn)代研究表明，白及對肺癌細胞具有明顯的抑制作用[3，9]，但其潛在靶標及作用機制尚不明確。

網絡藥理學利用網絡拓撲結構分析及生物信息學方法來解釋藥物、靶標、信號通路與疾病之間的復雜關系，為中藥復方作用機理的研究及臨床應用提供了新思路[10]，是新藥開發(fā)設計的一種新方法。本文將這一技術應用于預測白及治療肺癌的靶標及其信號通路，探討其多靶標、多途徑的調控機制。本研究將為白及進一步的基礎實驗、臨床研究以及新藥開發(fā)等提供科學依據，為肺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 化學成分收集與篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫和分析平臺TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[11]及中醫(yī)百科全書ETCM數(shù)據庫（http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/）[12]中檢索“白及”，獲得白及化學成分。為了不遺漏可能的有效成分，應用OB/DL 值和Lipinski 五規(guī)則兩種方法對成分進行虛擬篩選并對篩選結果進行合并去重。OB值和DL值是藥物成分篩選的常用參數(shù)[13]，根據口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18篩選白及活性成分并收集成分作用靶標。Lipinski 五規(guī)則包括相對分子量小于500、脂水分配系數(shù)（ClogP）小于5、氫鍵給體數(shù)目小于5、氫鍵受體數(shù)目小于10、化合物中可旋轉鍵的數(shù)量小于10，符合此規(guī)則的化合物往往具有較好的生物利用度和藥動學性質。但此規(guī)則實際應用上具有局限性，為了盡量減少漏篩, 本研究基于前三項進行篩選[14]。

1.2 活性成分作用靶標篩選

利用Uniprot（http://www.uniprot.org/）數(shù)據庫將白及活性成分作用靶蛋白轉換為相應基因名，在Excel表格中對相同基因靶點進行去重，刪除uniprot 里搜尋不到的靶蛋白。在Pubchem 數(shù)據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/）中搜索成分的SMILES 號，通過Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）在線工具進行靶標預測，設置為Homo sapiens[15]，篩選可能性排前的15個靶標作為候選靶標，整合TCMSP、ETCM數(shù)據庫中獲得的靶標。

1.3 疾病靶標預測

GeneCards 數(shù)據庫（http://www.genecards.org/）包含了豐富的疾病相關靶標信息，是常用的疾病靶標預測工具[16]。在數(shù)據庫中以“Lung Cancer”為關鍵詞檢索得到肺癌疾病相關基因，作為候選靶標基因。

1.4 成分-潛在靶標蛋白互作網絡圖構建

將白及活性成分和相應作用靶標按照不同類別導入Cytoscape3.7.0軟件中，構建“白及活性成分-作用靶標”網絡；利用Cytoscape中的STRING插件構建肺癌靶標“蛋白質相互作用（PPI）”網絡；使用Merge 功能取上述網絡的并集，獲得白及與肺癌的共同靶標，構建“活性成分-共同靶標蛋白互作”網絡。

1.5 GO功能富集與KEGG通路富集分析

將共同靶標同時導入Metascape 生物分子功能注釋系統(tǒng)（www.metascape.org/）進行GO 基因本體功能和KEGG 通路富集分析，設置P Value Cutoff 為0.01，選擇生物過程（Biological Processes）、分子功能（Molecular Functions）、細胞組成（Cellular Components）、KEGG 通路（KEGG Pathway）進行富集分析。

1.6 成分-靶標-信號通路網絡構建

為進一步探究成分、靶標與信號通路之間的相互作用關系，利用Cytoscape3.7.0軟件構建“靶標-信號通路”網絡，并采用Merge功能將其與“活性成分-共同靶標蛋白互作”網絡進行合并，構建白及“成分-潛在靶標互作-信號通路”網絡圖。

2 結果

2.1 化學成分收集與篩選

在TCMSP 和ETCM 數(shù)據庫中共收集到44 種白及化學成分。根據簡化后的Lipinski 五規(guī)則篩選活性成分，得到22個活性成分，結果見表1；根據OB ≥30%、DL ≥0.18 篩選出9個活性成分，結果見表2。整合二者得到的結果，去重后共計得到27個活性成分。

2.2 活性成分作用靶標篩選結果

通過Swiss Target Prediction 在線工具的分子反向對接技術和TCMSP、ETCM 數(shù)據庫，共獲得362個靶標，去重后為137個。

2.3 疾病靶標篩選結果

在GeneCards 數(shù)據庫中檢索得到20104個肺癌疾病相關基因，選取score ≥20 分的靶點，共得575個疾病基因靶標。

2.4 活性成分-作用靶標網絡構建結果

利用Cytoscape3.7.0 軟件中的Merge 功能取“白及活性成分-作用靶標”網絡與“蛋白質相互作用（PPI）”網絡的并集，獲得白及活性成分與肺癌的25個共同靶標，構建“活性成分-共同靶標蛋白互作”網絡，如圖1所示。

表1 基于Lipinski五規(guī)則篩選的22個白及活性成分

表2 基于口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）篩選的9個白及活性成分

2.5 GO富集與KEGG通路分析

將共同靶標同時導入Metascape數(shù)據庫中進行GO功能富集分析和KEGG 通路富集分析，得到21個富集條目，如圖2所示（P＜0.01），詳情見表3。

通過GO 功能富集分析，共確定了16個GO 條目。其中分子功能有2 條，分別是跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性和一氧化氮合酶調節(jié)活性；細胞成分有1條，即囊腔；涉及生物過程有13條，分別是前列腺增長、雌二醇反應、毒性反應、共生過程、肌肉細胞增殖、酸性化學反應、細胞缺氧反應、線粒體膜電位調節(jié)、橫紋肌組織發(fā)育的正向調節(jié)、離子平衡、有絲分裂細胞周期相變、細胞激素代謝過程、細胞成分組織的負調控。

通過KEGG 通路富集分析，得到白及治療肺癌可能參與的5條通路，包括表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥、PI3K-Akt信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、卵巢類固醇生成、癌癥中的轉錄失調過程。

圖1 “活性成分-共同靶標蛋白互作”網絡

圖2 GO、KEGG富集分析熱圖

表3 GO功能和KEGG通路富集結果

2.6 成分-靶點-信號通路網絡構建

利用Cytoscape3.7.0 軟件分別構建“成分-疾病潛在靶標互作”、“靶標-信號通路”網絡，并采用其Merge功能將其與上述網絡進行合并，構建白及“成分-潛在靶點互作-信號通路”網絡圖，按degree 值大小進行排布，如圖3所示。

圖3 成分-潛在靶標-信號通路網絡圖

由圖可見，白及的25個活性成分主要通過20個潛在靶標對肺癌起治療作用。對該網絡進行拓撲結構分析，該網絡共包含55個節(jié)點和248 條邊，其中248條邊代表成分、靶標和通路間的相互作用關系。25個綠色節(jié)點代表白及活性成分，節(jié)點平均度為2.84，大于成分節(jié)點平均度的節(jié)點有14個，包括白及菲螺醇（blespirol）、2,4,7-三甲氧基-9,10-二氫菲（2,4,7-trimethoxy-9,10-dihydrophenanthrene）、3′-氧-甲基山藥素III（3′-O-Methylbatatasin III）、7-甲氧基-9,10-二氫菲-2,5-二醇（7-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene-2,5-diol）、山藥素III（Batatasin III）、山藥素IV（Batatasin IV）、4-羥基苯甲醛（HBA 4-Hydroxybenzaldehyde）、大黃素甲醚（Physcion）等；25個飛鏢形節(jié)點代表成分作用靶標，節(jié)點平均度為15.08，大于靶標節(jié)點平均度的節(jié)點有10個，分別是雌激素受體α（estrogen receptor alpha，ERα/ESR1）、前列素內環(huán)氧化物合成酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2，PTGS2）、ALB、熱休克蛋白90α（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1）、v-erb-b2 紅細胞白血病病毒癌基因同源物2/人類表皮生長因子受體II（verb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2/human epidermal growth factor receptor-2，ERBB2/HER2）、表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）、雌激素受體β（estrogen receptor beta,ERβ/ESR2）、激酶插入區(qū)受體（kinase insert domain protein receptor，KDR）、BCL2L1、MET，其中ALB 與通路無關，故除此靶點其余皆可視為該白及治療肺癌的關鍵靶點。5個橙色節(jié)點代表肺癌發(fā)生可能涉及通路，平均節(jié)點度為9.6，大于平均節(jié)點度的是表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥、PI3K-Akt 信號通路，可能為白及治療肺癌的關鍵通路。

3 討論

肺癌是常見的原發(fā)性惡性腫瘤,其早期診斷率低于20%，我國80%的Ⅲ-Ⅳ期肺癌患者5年生存率僅17.7%[17-18]，預后不良。臨床以化療、放療以及外科手術作為肺癌的主要治療方式，其中最為有效的治療手段當屬化療，針對癌細胞的靶向藥物能較為準確地定位腫瘤，并促使癌細胞凋亡[19]，靶向藥物近年來具有針對性的優(yōu)勢而被應用于晚期肺癌的化療中，但存在較大的副作用，故而中藥的多靶點多通路且副作用小的治療優(yōu)勢愈來愈受到重視?！妒備洝费?“肺積息賁氣脹滿咳嗽，涕唾膿血”[20]，肺癌咯血吐膿的特點與白及補肺、止血、消腫生肌的功效及歸經相契合，具有良好的理論基礎。網絡藥理學基于“多成分-多靶標-多通路”的理念構建“藥物-靶標-疾病”多層次網絡結構，達到從整體上預測藥物靶標的目的[21]。本研究旨在運用網絡藥理學的方法，對白及中可能抑制肺癌細胞增殖、侵襲、轉移的潛在成分，作用靶標以及信號通路進行分析，為進一步借助實驗探究確切機制提供依據。

3.1 白及治療肺癌的有效成分

白及的化學成分中，聯(lián)芐類、二氫菲類、聯(lián)菲類、聯(lián)菲醚類、菲并吡喃類、三萜等為其主要成分[4,22]。其藥理活性主要有抗菌、止血、抗腫瘤、抗?jié)?、抗纖維化、促進傷口愈合等[23]。茋類化合物是聯(lián)芐類、菲類及二苯乙烯類化合物的總稱，對肺癌細胞有明顯的抑制作用，而白芨藥材中含量較多的主要是聯(lián)芐類和菲類化合物，如白及中的關鍵成分Blespirol、2,4,7-trimethoxy-9,10-dihydrophenanthrene 等都屬菲類化合物。仰蓮[3]曾運用MTT 法初步驗證了白及中的茋類化合物對非小細胞肺癌A549 細胞的增殖具有顯著抑制作用，誘導A549細胞阻滯于G0/G1期。白及塊莖含有粘液質多糖，其抗癌作用可能與其抑制微管蛋白的聚合有關[24]。茋類化合物通過抑制癌細胞增殖、轉移和誘導癌細胞凋亡、自噬發(fā)揮治療肺癌作用[3]。

3.2 白及治療肺癌的潛在靶標

雌激素受體是一種核轉錄因子，包括雌激素受體α（estrogen receptor alpha，ERα/ESR1）和雌激素受體β（estrogen receptor beta，ERβ/ESR2）[25，26]。雌激素的表達和腫瘤的預后有著極為密切的關系，ER 具有增強腫瘤細胞惡性程度和刺激腫瘤細胞生長的作用[27-29]。ER 通過控制細胞信號轉導、調控細胞周期從而影響細胞生存[30]。故抑制ERα和ERβ的表達從而抑制肺癌細胞的增殖成為可能[31]。Hamilton DH[28]發(fā)現(xiàn)用Fulvestrant 靶向雌激素受體信號可增強人肺癌的免疫和化療介導的細胞毒性，雌激素信號通路通過誘導EMT影響肺癌進展。

EGFR 是上皮生長因子細胞增殖和信號傳導的受體，其在腫瘤發(fā)生以及介導腫瘤細胞的生物學行為過程上發(fā)揮著重要的作用[32]。EGFR 與腫瘤細胞的增殖、凋亡、血管的生成、腫瘤的侵襲、轉移受到抑制相關。其可能機制有：EGFR 的高表達導致下游信號傳導的增強；突變型EGFR 受體表達的增加引起EGFR的持續(xù)活化；自分泌環(huán)的作用增強；受體下調機制的破壞；異常信號傳導通路的激活等。EGFR 的過表達在惡性腫瘤的演進中起重要作用，其過表達主要與基因擴增、活化后降解減少有關。EGFR 的配體也極大影響了細胞內信號傳導。它通過自分泌激活EGFR，從而促進癌細胞增殖，這二者的共表達往往提示腫瘤預后不良。Kopp[33]對結直腸癌的研究結果表明，在EGFR 的過表達及其配體共同表達作用下，腫瘤開始自分泌生長。另外，EGFR 可以通過調節(jié)Ang-1 和VEGF 等因子水平而影響腫瘤血管生成。李夢穎[34]發(fā)現(xiàn)肺腺癌胸水癌細胞EGFR 突變狀態(tài)和肺腺癌增殖、侵襲、轉移生物學行為有關。

PTGS2 基因又稱誘導性即刻反應基因，其在正常狀態(tài)下大多不表達，但在良性癌前病變和惡性腫瘤中為高表達。其表達上調，往往是受到某些炎性介質、激素、生長因子、促癌因子等刺激因素影響。前列腺素是PTGS2 高表達的主要產物，具有抑制細胞凋亡和免疫監(jiān)視、促進細胞增殖和血管生成等作用[35]。

Hsp90α是機體在應激狀態(tài)下合成的一組蛋白質分子，參與蛋白的合成、折疊和調控細胞內多種信號蛋白功能穩(wěn)定，作為細胞內關鍵信號通路和細胞轉錄的調控者[36]。它在腫瘤細胞的凋亡和增殖、細胞周期和細胞信號轉導的過程中起著調節(jié)作用，從而影響肺癌的發(fā)生和發(fā)展過程。WANG X F 等[37]的研究發(fā)現(xiàn)血漿中Hsp90α表達水平高低與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移過程密切相關，細胞Hsp90α的分泌量隨腫瘤惡性程度增高而升高。Hsp90α是潛在的肺癌腫瘤標志物，聯(lián)合其他肺癌標志物可顯著提高肺癌檢出率[38]。

ERBB2是原癌基因erbB-2編碼的185kDa的細胞膜受體，為表皮生長因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）家族成員之一。ErbB2 高表達時，腫瘤細胞增殖能力增強，其分化成熟和凋亡機制受到抑制，Ras-MAPK 和PI3K-Akt 信號傳導活性增強，從而增強細胞惡性程度。周轉轉等發(fā)現(xiàn)[39]非小細胞肺癌中ErbB2 陽性表達率較癌旁組織明顯升高，可作為腫瘤免疫生物治療的理想靶點。

KDR 能與VEGF 結合并發(fā)揮信號傳遞的作用[40]，其表達水平影響著血管新生過程，高表達的KDR基因促使腫瘤細胞新生血管，從而提高了腫瘤細胞的復發(fā)率和轉移率[41]。婁曉宇等發(fā)現(xiàn)[42]VEGF 和KDR 參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移過程，其可作為肺癌惡化的一項生物學指標。

c-MET 是肝細胞生長因子的受體酪氨酸激酶,被證實為NSCLC 患者的不良預后因素[43]，c-MET 過表達與NSCLC 預后差有關。c-MET 陽性往往可引起局部復發(fā)，而脈管受侵也可引起遠處轉移。脈管受侵是NSCLC 患者遠處轉移的危險因素，由于血管、淋巴管是腫瘤細胞的存儲庫，故成為了腫瘤細胞轉移、擴散的常見途徑。c-MET 與癌癥的發(fā)生發(fā)展關系密切，主要與腫瘤細胞的增殖、遷移、浸潤、凋亡及血管生成過程有關[44]。

3.3 關鍵通路分析

3.3.1 表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑抗性

表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibition，EGFRTKI）在NSCLC 中的療效值得肯定。識別突變和抑制其活性的藥物已成為晚期肺癌的主要治療手段,但不幸的是，這些藥物療效受到普遍耐藥性發(fā)展的限制。AXL 屬于受體酪氨酸激酶家族，在多種腫瘤細胞中過表達，是多種腫瘤常規(guī)化療和藥物靶向耐藥治療過程的重要分子標記[45]。AXL 激酶是NSCLC 活化后的受體酪氨酸激酶之一，其過表達是攜帶EGFR 敏感突變因子的肺癌患者對EGFR-TK1 產生耐藥的重要機制之一。研究酪氨酸激酶抑制劑耐藥的生物化學機制可能為提高靶向治療的療效提供新的治療靶點。

3.3.2 PI3K-Akt信號轉導途徑

PI3K 參與多種細胞因子轉導途徑，阻斷此途徑可降低肺癌細胞中SKP-2 蛋白表達水平，將細胞周期阻滯于G1/S 期復合體。Akt 是PI3K 的下游分子，也是PI3K/AKT 信號通路的關鍵，活化后的AKT 通過磷酸化反應激活下游靶蛋白，從而控制轉錄、翻譯、凋亡和細胞周期等生物學效應。。PI3K/Akt 信號通路在超氧化物和雌激素抵抗腫瘤壞死因子等因素誘導凋亡的過程中具有重要意義，如雌激素可通過Ras/PI3K/Akt信號通路誘導凋亡相關蛋白BAD的磷酸化過程。

綜上所述，白及的活性成分通過多靶標作用于多條信號通路上，通過抑制癌細胞增殖、轉移和誘導癌細胞凋亡、自噬等過程發(fā)揮治療肺癌的作用。在臨床實際應用中，白及雖然常被運用于中醫(yī)肺癌治療中，但往往僅作為隨證加減輔助用藥，多為了緩解肺部咯血癥狀或者用于消腫生肌，其治療肺癌的能力還有待不斷挖掘驗證。目前針對白及治療肺癌的相關基礎研究較少，大多數(shù)研究關注點在于白及治療腫瘤的活性成分，且對其發(fā)揮抑癌作用的機理尚不明確。隨著白及在抗腫瘤領域研究的深入與發(fā)展，不僅要明確白及化學成分及藥理作用,還要進一步闡明白及的藥效物質基礎及作用機制。本文首次基于網絡藥理學方法，挖掘出白及發(fā)揮治療肺癌作用的潛在靶標及相關通路，并建立起“藥物成分-靶標-信號通路”之間發(fā)揮藥效作用的關系網絡。立足于現(xiàn)有預測靶點及其相關通路，結合細胞水平、動物水平等實驗，驗證白及的抗肺癌活性，為白及的藥理作用、新藥研發(fā)、質量控制等提供科學依據。