UPLC-MS/MS 法測定人血漿中丙硫氧嘧啶的含量

李群英，凌 琳，李盛建，周 瑾，李甜甜，趙 亮，呂 磊 （. 上海市寶山區(qū)羅店醫(yī)院，上海 0908；. 浙江工業(yè)大學(xué)中藥學(xué)院，浙江 00；. 上海市寶山區(qū)大場鎮(zhèn)大場社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 00；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院，上海 008）

丙硫氧嘧啶（propylthiouracil），為硫脲類化合物，它可通過抑制甲狀腺內(nèi)過氧化物酶系統(tǒng)，阻止酪氨酸的碘化及碘化酪氨酸的縮合，從而抑制甲狀腺激素的合成，是臨床常用的治療甲亢的藥物[1-3]。其口服吸收迅速，約1～1.5 h 達(dá)血藥濃度峰值；代謝快，24 h 內(nèi)約有35%的藥物以原型和葡萄糖醛酸化物的形式從尿中排出，血漿半衰期約為1～3 h[4]。口服丙硫氧嘧啶個(gè)體差異較大，由于其血漿蛋白結(jié)合率高（約為80%），且存在肝毒性，因此對(duì)其進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測，能使藥物應(yīng)用更為安全合理[5-6]。進(jìn)口丙硫氧嘧啶的價(jià)格昂貴，研發(fā)高質(zhì)量、低價(jià)格的國產(chǎn)仿制藥具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[7]，開發(fā)高效穩(wěn)定的丙硫氧嘧啶的血藥濃度測定方法，可為仿制藥一致性評(píng)價(jià)中的生物等效性試驗(yàn)（BE）提供依據(jù)。

目前，丙硫氧嘧啶的體內(nèi)測定方法主要為高效液相色譜法（HPLC）[8-10]，早期開發(fā)的液相測定方法，分析時(shí)間長，專屬性和靈敏度均無法滿足臨床高通量測定的需求，因此，建立簡單快速、靈敏準(zhǔn)確的丙硫氧嘧啶血藥濃度質(zhì)譜分析方法（MS）具有重要意義。本文建立UPLC-MS/MS 法測定人血漿中丙硫氧嘧啶的含量，可為臨床治療藥物監(jiān)測（TDM）和生物等效性試驗(yàn)（BE）提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1290 UPLC 超高效液相色譜（安捷倫科技有限公司，美國），配有在線脫氣機(jī)、二元泵、低溫自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱；Agilent 6470 Triple Quad 三重四極桿質(zhì)譜（安捷倫科技有限公司，美國），配有AJS-ESI 噴射流電噴霧離子源、MassHunter 分析工作站；SECURA125-1CN 型十萬分之一電子天平、Arium mini 超純水儀（賽多利斯，德國）；Fresco 21 低溫離心機(jī)（賽默飛，美國）。

1.2 試藥

對(duì)照品丙硫氧嘧啶（批號(hào)：100803-201503，純度＞99.4%）購自中國食品藥品檢定研究院，內(nèi)標(biāo)丙硫氧嘧啶-D5（批號(hào)：13-EQJ-150-1，純度＞98%），購自Toronto Research Chemicals；甲酸為色譜純（ACS 恩科化學(xué)，美國）；甲醇和乙腈為色譜純（霍尼韋爾，美國）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件

色 譜 柱 為Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相采用甲醇-0.1%甲酸水溶液（80∶20，V/V），等度洗脫；流速：1 ml/min，柱后分流比2∶3；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μl，分析時(shí)間3min。

2.1.2 質(zhì)譜條件

采用AJS-ESI 源，正離子模式，離子源參數(shù)：干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速10 L/min；霧化器壓力40 psi；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速11 L/min；毛細(xì)管電壓4 000 V。多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）的參數(shù)：丙硫氧嘧啶m/z171.1→112.1，碎片電壓110 V，碰撞能量30 eV；丙硫氧嘧啶-D5（IS）m/z176.1→117.0，碎片電壓110 V，碰撞能量30 eV。丙硫氧嘧啶和氘代內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間均為1.9 min。

2.2 溶液的配制

2.2.1 丙硫氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液

精密稱取丙硫氧嘧啶對(duì)照品1.5mg，置于2 ml稱量瓶中，用移液器（已校準(zhǔn)）加入甲醇適量溶解，渦旋混勻，配成1.0 mg/ml 的對(duì)照品儲(chǔ)備液；取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇逐級(jí)稀釋，配成濃度分別 為 200、 500、 1000、 2 000、 10 000、 20 000、40 000、80 000、100 000 ng/ml 的系列對(duì)照品溶液，置4 ℃冰箱保存，備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液

精密稱取丙硫氧嘧啶-D5 對(duì)照品1.3mg，置于2 ml 稱量瓶中，用移液器（已校準(zhǔn)）加入甲醇適量溶解，渦旋混勻，配成1.0 mg/ml 的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液；取上述儲(chǔ)備液適量，用乙腈（含5%甲酸）稀釋400 倍，得2 500 ng/ml 的內(nèi)標(biāo)溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿及質(zhì)控樣品溶液

取空白血漿950 μl，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下制備的丙硫氧嘧啶系列標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μl，旋渦混勻，配成濃度分別為10、25、50、100、500、1 000、2 000、4 000、5 000 ng/ml 的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿。同法制備4 個(gè)濃度的質(zhì)控樣品（QC），分別為10、25、500、4 000 ng/ml，待用。

2.3 血漿樣品前處理

血漿樣品先置于室溫下解凍，取100 μl 血漿，依次加入200 μl 內(nèi)標(biāo)溶液，200 μl 乙腈（含5%甲酸），渦旋1min，于4 ℃下13000×g高速離心10 min，取100 μl 上清液于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

2.4 血漿樣品分析方法驗(yàn)證

2.4.1 選擇性

通過比較6 個(gè)不同健康志愿者的空白血漿樣品、質(zhì)控樣品和給藥后實(shí)際樣品的色譜圖來評(píng)估。分別取空白血漿、質(zhì)控樣品（QC-L）和受試者給藥后的血樣各100 μl，按“2.3”項(xiàng)下血漿樣品前處理方法操作，進(jìn)樣，獲得樣品的色譜圖（圖1），包括空白樣品色譜圖、質(zhì)控樣品色譜圖和實(shí)際樣品色譜圖。結(jié)果顯示，空白血漿中的內(nèi)源性成分不干擾待測物和內(nèi)標(biāo)出峰，選擇性良好。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限

取“2.2.3”項(xiàng)下制備的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣品100 μl，按“2.3”項(xiàng)下血漿樣品前處理方法操作，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以待測物血漿濃度為橫坐標(biāo)（X），待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸，使用1/X加權(quán)，求得回歸方程：Y=0.000 4X-0.000 2（r=0.999 3）。結(jié)果表明，血漿中的丙硫氧嘧啶在10～5 000 ng/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以S/N＞10 確定，定量下限（LLOQ）10 ng/ml，為標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)。

2.4.3 精密度和準(zhǔn)確度

在LLQQ（10 ng/ml）、QC-L（25 ng/ml）、QCM（500 ng/ml）、QC-H（4 000 ng/ml）4 個(gè)濃度下，通過批內(nèi)和批間分別考察。按“2.2.3”項(xiàng)下制備丙硫氧嘧啶4 個(gè)濃度質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行5 份，按“2.3”項(xiàng)下血漿樣品前處理操作，進(jìn)樣分析。并于每天制備4 個(gè)濃度質(zhì)控樣本各5 份，進(jìn)樣分析，連續(xù)3 d，計(jì)算批內(nèi)、批間的精密度（RSD）及準(zhǔn)確度（RE），批內(nèi)和批間的RSD＜10%， RE＜±10%，結(jié)果見表1。

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng)

取6 位健康志愿者的空白血漿，在相當(dāng)于QCL（25 ng/ml）和QC-H（4000 ng/ml）的2 個(gè)濃度下來考察。先按“2.3”項(xiàng)下血漿樣品前處理方法制備空白基質(zhì)上清，然后加入丙硫氧嘧啶及內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以使其終濃度與處理后QC-L 和QC-H 一致；同時(shí)制備相同濃度不含基質(zhì)的待測物和內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液，進(jìn)樣分析。通過峰面積分別計(jì)算待測物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子，進(jìn)一步得到經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子。不同基質(zhì)下，2 個(gè)濃度基質(zhì)效應(yīng)的變異系數(shù)均小于5%，符合方法學(xué)要求，結(jié)果見表2。

表1 丙硫氧嘧啶精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

表2 丙硫氧嘧啶的基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4.5 提取回收率

取單一來源的空白血漿，在相當(dāng)于QC-L（25 ng/ml）、QC-M（500 ng/ml）、QC-H（4 000 ng/ml）的3 個(gè)濃度下來考察。先按“2.3”項(xiàng)下血漿樣品前處理方法制備空白基質(zhì)上清，然后加入丙硫氧嘧啶及內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以使其終濃度與處理后QCL、QC-M、QC-H 一致；同時(shí)按“2.2.3”和“2.3”項(xiàng)下制備和處理3 個(gè)濃度的QC 樣品，每個(gè)濃度平行操作5 份，分別進(jìn)樣分析。通過峰面積計(jì)算待測物的提取回收率，平均回收率為101.60%～113.56%，結(jié)果見表3。

表3 丙硫氧嘧啶的提取回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.4.6 穩(wěn)定性

首先通過新鮮配制丙硫氧嘧啶和內(nèi)標(biāo)的儲(chǔ)備液1.0 mg/ml，考察對(duì)照品儲(chǔ)備液于4 ℃下放置30 d的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，RE＜±10%，穩(wěn)定性良好。然后在QC-L（25 ng/ml）、QC-H（4 000 ng/ml）2 個(gè)濃度下，分別考察4 種條件下丙硫氧嘧啶的穩(wěn)定性：室溫放置4 h、自動(dòng)進(jìn)樣器（4 ℃）放置24 h，凍融循環(huán)3 次，以及-80 ℃下凍存30 d，每個(gè)濃度平行操作5 份。按“2.3”項(xiàng)下血漿樣品前處理操作，進(jìn)樣分析，將丙硫氧嘧啶和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測濃度，計(jì)算RE 以及RSD，結(jié)果（見表4）顯示穩(wěn)定性良好。

表4 考察不同條件下丙硫氧嘧啶的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.4.7 殘留

通過在定量上限（ULOQ）5 000 ng/ml 完成測定之后立即測定空白樣品來評(píng)估。結(jié)果顯示，分析物保留時(shí)間處峰面積小于LLOQ 的20%，IS 保留時(shí)間處的峰面積小于實(shí)際IS 的5%。該方法幾乎無殘留，不影響測定。

2.4.8 稀釋可靠性

通過使用空白基質(zhì)將定量上限（ULOQ）10 倍（50 000 ng/ml）和50 倍（250 000 ng/ml）濃度的樣品稀釋至定量范圍（10～5 000 ng/ml）來評(píng)估，每個(gè)濃度平行操作5 次。結(jié)果表明，RSD 和RE 均低于15%，樣品稀釋不影響測定的精密度和準(zhǔn)確度。

3 討論

3.1 樣品前處理的優(yōu)化

常用的樣品前處理方法為蛋白沉淀和液液萃取，優(yōu)先采用簡單的蛋白沉淀法。沉淀劑考察了甲醇和乙腈，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈沉淀更完全，在同位素內(nèi)標(biāo)下，歸一化的基質(zhì)效應(yīng)更低，添加5%甲酸后，待測物峰形更好，因此選擇乙腈（含5%甲酸）為沉淀劑。進(jìn)一步考察了血漿與沉淀劑的比例（1∶3、1∶4、1∶5，V/V），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，比例為1∶4 時(shí)，提取回收率最高，最終選定為前處理方法。

3.2 液相條件的優(yōu)化

首先考察了甲醇-水和乙腈-水體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然乙腈-水體系的洗脫能力更強(qiáng)，但甲醇-水體系下峰形更佳，血漿中內(nèi)源性成分與主峰分離完全，基線噪音小。在水相中添加0.1%的甲酸，可以顯著提高丙硫氧嘧啶的質(zhì)譜響應(yīng)，檢測靈敏度令人滿意，也可進(jìn)一步改善峰拖尾。柱后采用了2∶3 分流，實(shí)際進(jìn)入質(zhì)譜的流速約為0.4 ml/min，既保障了色譜柱的最佳流速（1 ml/min），又保證了ESI 源的離子化效率，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

丙硫氧嘧啶在正離子模式下的響應(yīng)明顯優(yōu)于負(fù)離子模式，因此確定采用正離子模式檢測。采用Optimizer 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化程序依次對(duì)霧化室參數(shù)（鞘氣溫度、鞘氣流速、干燥氣溫度、干燥氣流速、霧化器壓力、毛細(xì)管電壓）以及MRM 參數(shù)（母離子、子離子、碎片電壓、碰撞能）進(jìn)行調(diào)節(jié)優(yōu)化，最終依據(jù)丙硫氧嘧啶和內(nèi)標(biāo)的檢測靈敏度，確定了“2.2.2”項(xiàng)下最佳的質(zhì)譜參數(shù)。得益于采用的同位素內(nèi)標(biāo)，丙硫氧嘧啶和氘代內(nèi)標(biāo)出峰穩(wěn)定，雖保留時(shí)間同為1.9 min，但并沒有離子串?dāng)_影響，而且歸一化的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果滿意。

綜上，本文建立了快速簡便、靈敏準(zhǔn)確的測定人血漿中丙硫氧嘧啶含量的UPLC-MS/MS 方法。樣品采用簡單蛋白沉淀法處理，LLOQ 為10 ng/ml，基質(zhì)效應(yīng)低，回收率高，每個(gè)樣本的分析時(shí)間3 min，每天可分析超過400 樣本，滿足高通量測定需要。本研究為丙硫氧嘧啶的治療藥物監(jiān)測（TDM）和生物等效性試驗(yàn)（BE）提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。